外周血microRNA-199a水平與特發性肺動脈高壓預后的相關性

宋瑋 齊詠 陳卓昌

(河南省人民醫院呼吸與危重癥醫學科，河南 鄭州 450000)

特發性肺動脈高壓(idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH)是肺動脈高壓中的一種特殊類型，是以不明原因的肺小動脈管壁增殖性改變為主要病理特征，進而引起肺動脈血管阻力增加、血流受限并最終導致右心功能不全的臨床綜合征[1-2]。一組基于中國人的調查顯示，IPAH患者經常規治療后5年生存率為20.8%[3]。目前臨床上仍缺乏預測IPAH疾病嚴重程度和預后的特異性強的分子標志物。報道顯示，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)參與調節IPAH發展進程，可能成為IPAH防治的新的潛在標志物[4]。相關研究[5]表明，miRNA-199a在肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)增殖調控中具有明確的作用。因此，本研究通過分析外周血miRNA-199a在IPAH患者中的表達水平，探討其與IPAH預后的相關性，旨在為IPAH的預后預測尋找可靠的分子標志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年11月—2017年11月河南省人民醫院收治的42例IPAH患者(IPAH組)。納入標準：(1)符合IPAH診斷標準，靜息狀態肺動脈平均壓(mean pulmonary artery pressure,mPAP)≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)，并排除其他病因；(2)年齡≥18歲；(3)本研究取得患者知情同意并經醫院倫理委員會通過。排除標準：(1)合并腫瘤、嚴重的肝腎疾病或全身代謝性疾病者；(2)有心肌梗死、肺梗死或腦梗死史者；(3)合并其他系統疾病導致無法配合完成心導管檢查者。42例IPAH患者中，女性27例，男性15例；年齡21～64歲[(36.64±6.20)歲]。另選取同期性別、年齡與IPAH組患者相匹配的健康體檢者40例作為正常對照組。所有患者入院后采集空腹靜脈血5 mL，離心后分離血漿，并于-80 ℃條件下保存。對IPAH患者隨訪觀察2年，隨訪以電話及門診方式進行，記錄患者隨訪期內生存情況。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器

實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)于羅氏cobas z480全自動熒光定量PCR分析儀進行，miRNA提取試劑盒由德國Qiagen生產。

1.2.2 miRNA的提取

冷凍血漿標本融化后，將1 mL總提取液加入到300 μL血清樣本中，根據miRNeasy血漿提取試劑盒操作說明從血漿樣本中提取總RNA。

1.2.3 miRNA逆轉錄及RT-PCR檢測

以U6作為實驗內參，逆轉錄反應體系：5 μL RNA模板，3 μL U6及miRNA-199a引物，0.15 μL 100 mmol/L dNTPs，1.00 μL逆轉錄酶，1.5 μL 10×反轉錄緩沖液，0.19 μL RNase抑制劑，4.16 μL無菌三蒸水；逆轉錄反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。擴增反應體系為20 μL：1.00 μL TaqMan Small RNA Assay(20×)溶液，10.00 μL TaqMan?Universal PCR Master Mix Ⅱ(2×)溶液，1.33 μL cDNA，7.67 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水。擴增條件：95 ℃ 10 min為一個循環，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min進行40個循環，重復3次。以2-ΔΔCt法計算miRNA-199a的相對表達水平。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 兩組一般資料及IPAH組心導管檢查結果

兩組性別、年齡和身體質量指數比較無顯著差異(P>0.05)。IPAH組心導管檢查結果詳見表1。

表1 兩組患者一般資料及IPAH組心導管檢查結果

2.2 外周血miRNA-199a在IPAH組和對照組表達水平比較

IPAH組外周血miRNA-199a水平顯著低于對照組，差異有統計學意義(t=12.359，P<0.05)，見圖1。

注：與對照組比較，*表示P<0.05。圖1 外周血miRNA-199a在IPAH組和對照組表達比較

2.3 IPAH患者外周血miRNA-199a表達水平與mPAP、肺血管阻力和肺血管阻力指數的相關性分析

采用Pearson相關分析IPAH患者外周血miRNA-199a表達水平與mPAP、肺血管阻力(total pulmonary vascular resistance，PVR)和肺血管阻力指數(pulmonary vascular resistance index，PVRi)的相關性，結果顯示外周血miRNA-199a表達水平與mPAP、PVR和PVRi均呈顯著負相關(r=-0.509，P<0.05；r=-0.637，P<0.05；r=-0.591，P<0.05)。見圖2。

圖2 IPAH患者外周血miRNA-199a表達水平與mPAP、PVR和PVRi的關系

2.4 外周血miRNA-199a表達水平與IPAH患者預后的關系

2.4.1 不同預后IPAH患者外周血miRNA-199a表達水平比較

截止隨訪時間，42例IPAH患者均獲得完整隨訪，其中12例(28.57%)因心功能不全死亡。據隨訪結局，將IPAH患者分為生存組與死亡組，死亡組外周血miRNA-199a表達水平顯著低于生存組(P<0.05)，見表2。

表2 不同結局IPAH患者外周血miRNA-199a表達水平比較

2.4.2 外周血miRNA-199a預測IPAH患者預后的ROC曲線分析

繪制外周血miRNA-199a預測IPAH患者預后的ROC曲線，取約登指數最大時對應的miRNA-199a水平作為最佳臨界值，結果顯示外周血miRNA-199a預測IPAH預后不良的最佳截斷值為1.36，預測的AUC為0.834(95%CI0.734～0.908)，與AUC=0.5比較，差異有統計學意義(Z=6.430，P<0.05)。見表3和圖3。

表3 外周血miRNA-199a預測IPAH患者預后的預測效能

圖3 外周血miRNA-199a預測IPAH患者預后的ROC曲線

3 討論

近年來報道[6]顯示，循環血miRNA水平變化與眾多疾病聯系緊密，有潛力作為疾病早期診斷和預后評估的生物標志物。研究發現miRNA與肺動脈高壓的疾病進程密切關聯[7-8]。此外，血液中的miRNA不易被降解，相關報道[9]指出細胞中的miRNA能以微泡、外來體和凋亡小體等形式分泌入血，從而逃避血漿RNA消化酶對其進行消化降解，同時伴隨著微量miRNA提取技術的快速進展，也使得血漿miRNA可能作為判斷IPAH預后的潛在分子標志物。

報道指出，在肺動脈高壓和癌癥的致病機制中存在相似的細胞過度增殖和遷移的相關病理機制[10-12]。研究[13]顯示，miRNA-199a參與腫瘤疾病進程中的細胞增殖與遷移的調控，但目前miRNA-199a在IPAH中的作用尚不完全清楚。本組病例中，IPAH組miRNA-199a水平較正常對照組顯著下調，提示miRNA-199a可能與IPAH病程密切相關。右心導管檢查是臨床上IPAH診斷的“金標準”，本研究中，IPAH患者入院后右心導管檢查均提示患者存在嚴重的血流動力學障礙，表現為mPAP、PVR和PVRi等參數均異常升高。通過相關性分析，筆者發現miRNA-199a水平與mPAP、PVR和PVRi呈顯著負相關，說明miRNA-199a與IPAH病情嚴重程度間存在著密切關聯。Yang等[14]采用缺氧條件培養大鼠PASMCs，結果顯示miRNA-199a表達水平在大鼠PASMCs中顯著下調了約85%，通過過表達miRNA-199a可顯著降低缺氧誘導的PASMCs增殖，從而增加其凋亡；而敲除miRNA-199a可增加PASMCs的增殖和減少其凋亡。結合Yang等[14]研究，筆者推測IPAH患者外周血miRNA-199a下調可能反映了IPAH患者PASMCs內miRNA的表達變化，并通過相關信號通路調控PASMCs增殖和凋亡的形式參與IPAH疾病進程，但具體的信號轉導機制有待后續研究進一步明確。IPAH好發于女性患者，并且預后較差，患者多因進行性的右心功能不全而致右心衰竭死亡。本研究中IPAH患者發病特征與以往報道[15]的IPAH人口學特征相符，另外通過分析外周血miRNA-199a表達水平與IPAH患者預后的關系發現，低外周血miRNA-199a表達水平提示IPAH預后差。ROC曲線分析顯示，外周血miRNA-199a預測IPAH預后不良的最佳截斷值為1.36，預測的AUC為0.834(95%CI0.734～0.908)，提示其對IPAH患者預后具有較好的預測價值。

綜上所述，本研究結果表明外周血miRNA-199a表達水平在IPAH患者明顯下調，其能較好地預測IPAH患者預后，可能是IPAH預后預測的潛在分子標志物。