細菌性陰道病動物模型研究進展

張巧妮綜述路會俠審校

大理大學，云南大理671000

細菌性陰道病(gacterial vaginosis，BV)是指由于陰道正常優勢菌群乳酸桿菌的地位被陰道加德納氏菌(Gardnerella vaginalis，G菌)、類桿菌、普雷沃菌(Prevotella bivia，P菌)等機會致病菌所取代，導致陰道微生態環境失調，從而引起的無陰道黏膜炎癥表現的臨床綜合征[1-2]。BV是育齡女性陰道感染性疾病中最常見的一種，在我國的發病率為4.96%～36.0%，且以26～35歲的婦女發病率最高[2-3]。嚴重者常伴有盆腔炎、輸卵管炎癥、不孕不育、早產、胎膜早破，甚至人類免疫缺陷病毒(HIV)感染等并發癥[4-5]。

動物模型是探討細菌性陰道病發病機制、臨床治療和新藥開發的基礎。然而，BV確切的發病機制和感染發病過程仍然不清楚，因此目前缺少有效的動物模型，且動物模型制備方面的文獻報道較少，本文擬就BV動物模型新進展做一綜述。

1 動物模型的菌種選擇和造模方法

1.1 傳統菌種選擇確定致病菌自BV首次描述以來就是一個重要挑戰，以單個細菌種類為核心是目前BV動物模型的關鍵[4,6]?，F有的BV模型制備中多應用金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、淋球菌、綠膿桿菌的一種或多種細菌混合接種感染，觀察到炎癥表現及鏡下組織改變即可認為造模成功。其中以金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌等需氧菌為主要種植菌種的動物模型制備流程已趨于完善，并具備一定的經濟性和實用性[7-17]。

早期關于細菌性陰道炎、BV的兩種疾病研究概念混淆不清。細菌性陰道炎屬于陰道細菌感染性疾病范疇，可以根據所感染的細菌種類的不同而歸類，如嗜血桿菌、棒狀桿菌、厭氧菌等，且大多陰道及顯微鏡下檢查有炎癥改變[18]。兩種疾病的概念相似卻不盡相同，主導菌群也有區別。隨著女性陰道細菌感染性疾病分型逐漸細化，曾定義為“中間型細菌性陰道病”的需氧型陰道炎逐漸被認知[11]。以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等菌群為主體的模型，并不能代表BV陰道無陰道黏膜炎癥的典型陰道微環境[2,19]。以需氧菌為主的菌種核心選擇已缺乏研究BV模型的可靠性。雖然目前BV的致病機制尚未完全明確，但BV患者陰道微生物中乳酸桿菌的優勢地位被厭氧菌占據的現象，使得菌群核心研究也有進一步的發展。

1.2新菌種核心選擇隨著對BV的深入研究，其他細菌也逐漸被選作BV動物實驗的陰道定植菌[20-23]。如從胎盤、羊水和輸卵管卵巢膿腫中分離出來的G菌、厭氧菌(如P菌)，也可以作為BV動物模型菌種核心的研究方向[5,20,24]。

SEHGAL等[18]表明G菌與BV發生具有相關性。而GILBERT等[4]則表示G菌可從絕大多數患有BV的婦女陰道中分離出來，進一步證實G菌的條件致病能力。CASTRO等[24-25]的研究又從機制上表明，BV相關的G菌定殖可以成為BV發展的觸發因素，并在陰道上皮表面形成相應的G菌微生物生物膜(biofilm，BF)。更高的初始黏附性、細胞毒性以及形成BF的傾向性等特點，決定了G菌比其他BV相關菌種具有更強的毒性潛力，對于BV的發病機制和動物模型的菌種核心選擇的研究有很大的幫助。而在G菌對BV相關特征和并發癥的重要意義研究上，NICOLE等[26]在G菌感染的動物BV模型中發現了臨床上用于診斷BV的關鍵特征點，包括無組織炎癥狀態下陰道上皮細胞脫落與黏附細菌，以及與感染程度和唾液酸酶活性水平相關的陰道上行性感染。同時基于人類BV微生物環境中G菌、P菌之間存在的生長協同作用上，GILBERT等[4]提出了更具有全面性的G菌+P菌共感染模型，進一步證實了人類BV發病機理中陰道唾液酸酶活性、上皮脫落和上行感染等幾個方面的問題。BV發病機制逐漸轉向研究以G菌等厭氧菌的主體菌群致病機理。

1.3 造模方法目前采用的BV造模方法多為將≥1種的菌液(＞108個/mL)按照動物單位體質量劑量(如＞0.20 mL/kg)注入其陰道內，也有研究[27]預先用雌二醇進行動物發情預處理，再進行細菌接種以獲得較高的感染率。陰道菌群種植結束后，間隔4～5 d后觀察陰道外觀評分、陰道組織病理學改變和陰道分泌物中細菌陽性率等與陰道微生態評價系統、Amsel標準和Nugent標準分類法相關的多個指標，具體定量或定性地評判造模效果[2,18]。

現有造模方法不足之處在于：首先沒有明確造模的核心菌群；其次僅僅以動物感染與否分組，未對動物模型進行量化分級，即按照病情輕重程度進行分層隨機，因而存在假陽性可能；此外，引起BV的不同菌株如能在抗菌試驗中發現對指定藥物的敏感性，將有利于進一步指導臨床應用[17]。

2 實驗動物的選擇及應用

各種動物先后被用于構建BV模型，不同動物的陰道解剖結構、微環境、菌群分布遷移、生物習性等方面存在不同，因此在陰道內環境及應用上各有優缺點，見表1。

表1 BV模型動物選擇的優點和缺點

2.1 鼠

2.1.1 小鼠小鼠作為易獲取、價格便宜、易飼養的實驗動物，具有造模時間短，發展快的優勢，被廣泛用于BV模型研究。張冬梅等[9]以無菌PBS液處理小鼠陰道后建立大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的陰道混合感染模型，用于探討黃柏堿對BV的治療。ZHOU等[27]將小鼠陰道雌激素化處理后成功建立了大腸桿菌種植感染的BV造模實驗。NICOLE等[26,28]則發現在BV相關細菌引起小鼠陰道內感染的實驗中，其臨床診斷與人類疾病相似，并證明G菌可能與BV的病因、表型及相關并發癥有關。學者[4,26]在小鼠G菌感染的BV模型上進行改良，建立了更符合人類微生物特性的小鼠G菌+P菌共感染BV模型，確定了G菌在與其他BV相關細菌共感染時可引起類似BV的表現，進一步證明G菌是BV的直接促成因素。盡管小鼠BV模型研究應用廣泛，但仍存在不能反映人類陰道中乳酸桿菌優勢地位，對陰道溶解素偏好等屬性不同等方面的局限性。

2.1.2 大鼠大鼠在BV模型選擇上兼具了經濟性，又因體型稍大，取材較方便，解決了小鼠模型的部分局限性。黃瑜[16]給大鼠陰道內注入大腸桿菌、金葡萄球菌以建立混合感染模型，觀察到縮醛磷脂可改善大鼠陰道氧化應激及感染情況。黃嬋等[12]進一步以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及綠膿桿菌混合的大鼠BV模型進行野西瓜乙醇提取物的藥效學研究。向麗等[10]等應用大鼠陰道感染模型探索苦參凝膠對陰道黏膜衍生因子(SDF)-1/CXC去化因子受體(CXCR)4軸的作用。WANG等[29]的實驗不僅對耐環丙沙星的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性進行了研究，還首次表明了BF-30(Cathelicidin BF)對大鼠BV模型的保護作用。但大鼠的順應性差，陰道組織脆弱，操作中易造成嚴重損傷及難度增加，從而因非實驗因素影響實驗結果的準確性。

2.2 兔兔作為易獲取及飼養的哺乳動物，體型適宜，操作、取材方便，具有與人類相似的陰道結構。有研究[15,30]應用發情處理后家兔陰道模型研究陰道黏膜細胞的凋亡情況和炎癥細胞增殖情況；陸珍等[13]將皮下注射醋酸甲羥孕酮發情的日本大耳兔優化陰道刺激模型用于研究藥物的免疫炎癥毒性。付佳瑤等[21]進一步用脫污染處理后進行大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌混合感染的家兔模型，證明了乳酸桿菌及其裂解物可用于BV的臨床治療。付瑤[14]還選用苯甲酸雌二醇假發情后的新西蘭大白兔模型以研究復方替硝唑栓治療細菌性、霉菌性陰道炎的作用。相關的兔陰道模型研究提示費用稍貴，其陰道菌群分布與人類也有所不同，因此還需要在預防及治療BV的研究方面有更多的改進和應用。

2.3 豬豬的陰道上皮是與人類相類似的鱗狀上皮，可作為體外研究BV的理想候選材料。田芳等[31]通過應用小型豬陰道黏膜進行實驗，證實尼非韋羅微乳熱敏凝膠可作為陰道外用殺菌劑使用。LAURA等[32]進一步將從6月齡豬陰道內分離出的陰道黏膜、1×104CFU/mL的彎曲乳酸桿菌以及1×104CFU/mL的淋病奈瑟雙球菌或G菌，于37℃厭氧或有氧條件下共同培育，成功制備了2種菌感染的BV模型，并證實彎曲乳酸桿菌具有治療BV的作用。雖然目前關于豬BV陰道模型的研究并不多，但豬陰道具有能夠攜帶人類陰道細菌并反映相應細菌數量變化的優點，所以可作為研究陰道共生病原微生物及BF形成機制的動物模型未來方向[24-32]。

2.4 狐貍國內報道的一種人獸共患病——狐貍陰道加德納氏菌病(Gardnerella vaginalis of fox，GVF)[33]，提示了狐貍作為BV模型的可能性。時文健[34]觀察患GVF的狐貍，發現與人類相同的BV臨床表現，通過收集陰道分泌物或洗液進行檢驗，證實狐貍GVF和人類BV都主要表現為陰道中乳酸桿菌減少，葡萄球菌、類桿菌、腸桿菌過度增長，光鏡、電鏡下表現為陰道黏膜局部炎癥反應較輕的菌群失調癥，狐貍陰道加德納氏菌屬G菌的亞種之一。同時通過分離鑒定，建立了小鼠的BV致病模型。

GVF作為研究人類BV的動物模型在病原學和病理學上存在一致性，在臨床癥狀和流行病學方面也具有類似性[34-35]，如多發生在性活躍期及通過性交傳播，致病靶器官均為泌尿生殖系統，都可以直接產生腥臭味的陰道分泌物，還可以導致流產、早產及不孕等不良后果。但目前對于GVF的研究大多仍局限于畜牧業范疇，與人類BV進一步的相關性研究存在較大空缺。

2.5 猴子猴子是目前發現的與人類在陰道結構、化學和生物學方面最為相似的BV動物模型。M?RDH等[36]提出灰白猴靈長類動物可以用于BV研究，并從人類BV中分離的不同菌株進行分組接種于其陰道內。發現G菌+LCR(未分類厭氧曲桿菌長變異體)組出現了BV癥狀且在觀察期結束時未消失；LCR組4～5周后陰道分泌物輕微增加；G菌+CR(未分類厭氧曲桿菌)組12 d后陰道恢復正常狀態，而G菌組在整個觀察期均可觀察到G菌。JOHNSON等[37]對豬尾獼猴、狨猴和黑猩猩行G菌陰道接種定植11～39 d未能成功，雖表明其不適合作為G菌相關動物模型，但有助于研究G菌與陰道黏膜的黏附及相互作用機制。同時也有選用猴子作為模型成功開展的EcoilD1S7(大腸埃希菌)陰道定植實驗[38]。猴子等靈長類動物與人類在生殖道結構及機能方面最為相似的優勢，可以使其具有被用于研究多種因素對于BV影響的潛力。

3 展望

目前關于BV的特異性診斷及發病機制的研究尚不明確，高復發率也表明對于BV仍然缺乏有效預防措施，因此迫切需要更為理想的BV動物模型進行深入的研究。而相關的動物模型研究還存在對BV的概念認知不清的問題，如何篩選合適的動物制作BV動物實驗模型，找到引起BV的特征細菌種類是關鍵。G菌目前在BV的研究中趨于重要位置。今后應拓展思路，選擇更簡便、更具有代表性的BV動物模型，兼顧標準性、可重復性及穩定性，為BV及其他類型陰道炎提供實驗基礎。