羊源產氣莢膜梭菌多重熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用

李一鳴，李 麗,2，張凱悅，張彥明*，姜艷芬*

(1.西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100；2.威海市文登區(qū)人才創(chuàng)新發(fā)展中心，山東 威海 264400)

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一種廣泛分布于環(huán)境和動物腸道中的革蘭陽性厭氧梭狀芽孢桿菌，屬于條件性致病菌[1-2]。當動物(機體)免疫力下降或環(huán)境劇烈變化引起應激時，可造成腸道菌群失調，產氣莢膜梭菌迅速繁殖，產生的大量毒素損壞腸黏膜上皮細胞的完整性，使腸道黏膜的通透性增加，細菌和毒素進入血液循環(huán)，造成壞死性腸炎和腸毒血癥等疾病[3-4]。該菌分為A～G 7個血清型[5]，其中A～E型引起羊發(fā)病，A型是引起羊“猝死癥”的主要原因，產生α毒素；B型是羔羊痢疾和綿羊出血性腸炎的病原，產生α、β和ε毒素；C型引起綿羊、山羊、羔羊等腸毒血癥，產生α和β毒素；D型引起山羊、綿羊腸毒血癥，產生α和ε毒素；E型主要引起羔羊腸毒血癥，產生α和ι毒素，我國目前還沒有關于E型菌株分離的報道。

目前，產氣莢膜梭菌病已廣泛分布于全國各地，以潛伏期短、發(fā)病急、死亡快為特點，嚴重危害中國畜牧業(yè)的發(fā)展[6-7]。據青海省海北州祁連縣綿羊發(fā)病死亡情況調查，平均3.9%的病死率中，致死率達到1.7%，接近綿羊發(fā)病死亡的50.0%[8]。近些年，隨著養(yǎng)羊業(yè)不斷向著集約化、規(guī)模化發(fā)展，該種疾病的報告病例呈上升趨勢，急需采取有效措施，切實做好防控工作[9]。因此，建立一種快速鑒別診斷方法已迫在眉睫。本研究建立了針對A、B、C、D型羊源產氣莢膜梭菌的α、β和ε毒素基因的多重熒光定量 PCR檢測方法，定量檢測不同型的產氣莢膜梭菌，為更好地防控產氣莢膜梭菌病，有效降低該類疫病的發(fā)病率提供科學支持。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株產氣莢膜梭菌A型(CVCC49)、B型(CVCC54)、C型(CVCC59)、D型(CVCC84)，均購自中國獸醫(yī)菌種保藏中心；鏈球菌(CVCC 1887)、沙門菌(CVCC2185)、大腸埃希菌(ATCC 25922)、腐敗梭菌(CVCC 60021)和金黃色葡萄球菌(ACCC 01011)均由西北農林科技大學獸醫(yī)公共衛(wèi)生實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器Premix Ex Taq 2×Probe qPCR購自寶生物(大連)公司；液體巰基乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)和腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(BHI)購自北京奧博星生物公司；糞便、細菌基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)公司；CFX96 Touch實時熒光定量PCR系統為美國Bio-Rad公司產品。

1.3 引物和探針的設計根據GenBank中收錄的產氣莢膜梭菌毒素基因序列，查閱并參考相關文獻[10]，應用Primer 5.0軟件分別設計了cpa、cpb和etx3種毒素基因特異性引物及TaqMan探針，由寶生物(大連)公司合成，引物及探針的序列、擴增長度見表1。

表1 熒光定量PCR引物及探針序列

1.4 陽性標準品的制備以B型產氣莢膜梭菌為模板，進行cpa、cpb和etx基因目的片段PCR擴增及產物純化回收。回收產物cpa與pMD18-T載體、cpb/etx與pGEM-T easy載體連接，轉化至DH5α感受態(tài)細胞培養(yǎng)。通過藍白斑篩選，挑取單克隆白色菌落進行PCR鑒定，檢測陽性的送西安擎科生物公司測序。測序結果與克隆基因目的片段完全一致的陽性克隆接種Amp+LB液體培養(yǎng)基，提取質粒。根據計算公式：質粒拷貝數(拷貝/μL)= 阿氏常數×質粒質量濃度(g/μL)/質粒相對分子質量(g/moL)，進行質粒拷貝數濃度換算，-20℃保存?zhèn)溆茫鳛闊晒舛縋CR的標準品。

1.5 單項熒光定量PCR方法的建立將引物和探針均稀釋為10 μmol/L(etx-Pr稀釋為5 μmol/L)，引物和探針的加入量分別為0.5,1.0，2.0 μL，退火溫度為53,54,55,56℃ 4個梯度，互相組合進行試驗。對所得的每個濃度梯度的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)進行比較，以產生Ct值最小和標準偏差最小值兩者綜合指數為依據選擇最佳引物、探針濃度和退火溫度。分別按照建立的單項熒光定量PCR反應條件進行敏感性、特異性及重復性試驗。

1.6 多重熒光定量PCR方法的建立

1.6.1反應體系條件的確立 依據已優(yōu)化的單項熒光定量PCR的引物濃度進行多重熒光定量PCR的引物和探針及退火溫度的優(yōu)化。

1.6.2敏感性試驗 按照已建立的多重熒光定量PCR反應條件，以10倍梯度稀釋制備成1×109～1×100拷貝/μL的質粒標準品為模板進行熒光定量PCR敏感性試驗，每個樣品重復3次，建立動力學擴增曲線和標準曲線。

1.6.3特異性試驗 按照已建立的反應條件對產氣莢膜梭菌A、B、C、D型菌、鏈球菌、沙門菌、大腸埃希菌、腐敗梭菌和金黃色葡萄球菌，以菌液為模板在相同條件下進行熒光定量PCR檢測，觀察反應的特異性。

1.7 基因組DNA和菌液熒光定量PCR敏感性檢測提取B型產氣莢膜梭菌DNA，測質量濃度后將其稀釋為1 mg/L，再以10倍梯度稀釋制備成1×10-1～1×10-9mg/L的DNA為模板，每個梯度重復3次進行擴增，檢測其靈敏度；另取100 μL B型菌液倍比稀釋8個梯度，以各梯度菌液為模板，每個梯度重復3次進行熒光定量PCR反應檢測其靈敏度；同時分別吸取10-4～10-7梯度菌液各100 μL涂布TSC平板，每個梯度2個重復，37℃厭氧培養(yǎng)24 h后進行菌落計數，計算原始菌液濃度及各梯度DNA所對應的菌落數。

1.8 臨床樣品檢測根據糞便基因組DNA提取試劑盒說明書，對采集的20份健康山羊糞便提取DNA，應用本研究建立的方法進行檢測，同時，根據GB 4789.13—2012《食品衛(wèi)生微生物學檢驗產氣莢膜梭菌》對樣品進行菌落計數及分離鑒定[11]，計算符合率，驗證該方法的實用性。

2 結果

2.1 陽性標準品的制備PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，在137,113,133 bp處分別有1條特異性條帶，擴增結果與設計的目的片段長度相符(圖1)。經純化回收、連接轉化、PCR鑒定，測序鑒定的陽性克隆接種Amp+LB液體培養(yǎng)基，提取質粒。測定質粒質量濃度：cpa-pMD18-T為259.12 mg/L，cpb-pGEM-T為243.86 mg/L，etx-pGEM-T為114.90 mg/L。計算的重組質粒拷貝數分別為8.35×1010,7.11×1010,3.33×1010拷貝/μL。將質粒標準品-20℃ 保存?zhèn)溆茫瑫r將質粒的一部分稀釋制備成1×109～1×100拷貝/μL的質粒標準品。

M.DL2000 DNA Marker;1～2.cpa;4～5.cpb；7～8.etx;3,6,9.陰性對照

2.2 單項熒光定量PCR方法的建立

2.2.1反應體系條件的確立 經優(yōu)化，最終確立的單項熒光定量PCR引物和探針的最佳濃度分別為cpa-F/R/P 0.4 μmol/L，cpb-F/R/P 0.8 μmol/L，etx-F/R 0.4 μmol/L，etx-P 0.2 μmol/L。退火溫度為55℃。反應程序同多重熒光定量PCR。

2.2.2敏感性和標準曲線的建立 敏感性試驗結果顯示，最低檢測限均為1×102拷貝/μL，除cpa-pMD18-T的1×101拷貝/μL有擴增曲線和熒光信號外(但Ct>36)(圖2B)，其他1×101～1×100拷貝/μL均無擴增曲線和熒光信號(圖2D，2F)。cpa-pMD18-T、cpb-pGEM-T和etx-pGEM-T的擴增效率分別為101.1%，91.6%，102.0%，R2分別為0.998，0.998，0.999(圖2A,C,E)。

2.2.3特異性與重復性 結果顯示，在有效循環(huán)內除了以1×1010拷貝/μL標準品為模板的PCR反應起峰外，以鏈球菌、沙門菌、大腸埃希菌、腐敗梭菌和金黃色葡萄球菌菌液為模板和陰性對照的PCR反應均無擴增曲線出現。通過計算，批內和批間重復試驗的CV值均小于4%。

A,B.藍色為cpa-pMD18-T;C,D.綠色為cpb-pGEM-T;E,F.橙色為etx-pGEM-T

2.3 多重熒光定量PCR方法的建立

2.3.1反應體系及條件的確立 經優(yōu)化，最終確立的多重熒光定量PCR反應體系：Premix Ex Taq 2×Probe qPCR 12.5 μL，cpa-F/R/P(10 μmol/L)各1 μL，cpb-F/R/P(20 μmol/L)各1 μL，etx-F/R(20 μmol/L)各0.5 μL，etx-P(5 μmol/L)1 μL，cpa-pMD18-T、cpb-pGEM-T、etx-pGEM-T各1 μL，最后用ddH2O將反應體積補至25 μL。反應程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 10 s，40個循環(huán)；在退火階段檢測熒光信號。

2.3.2敏感性和標準曲線的建立 多重熒光定量PCR敏感性試驗結果顯示，最低檢測限均為1×102拷貝/μL，除etx-pGEM-T的1×101拷貝/μL有擴增曲線和熒光信號外(但Ct>36)，其他1×101～1×100拷貝/μL均無擴增曲線和熒光信號(圖3B)。結果與單項熒光定量PCR基本一致。cpa-pMD18-T、cpb-pGEM-T和etx-pGEM-T的擴增效率分別為95.0%，91.2.%,101.3%，R2分別為0.990，0.991,0.999(圖3A)。

a.cpa-pMD18-T；b.cpb-pGEM-T；c.etx-pGEM-T

2.3.3特異性 多重熒光定量PCR特異性檢測結果顯示，A(α毒素)、B(α、β和ε毒素)、C(α和β毒素)、D(α和ε毒素)型產氣莢膜梭菌均出現cpa擴增曲線，同時B型菌出現cpb和etx2條擴增曲線，C和D型菌分別出現cpb和etx擴增曲線，以其他常見細菌菌液為模板和陰性對照的PCR反應均無擴增曲線出現(圖4)，說明該方法具有良好的特異性。

1.cpa-pMD18-T、cpb-pGEM-T和etx-pGEM-T；2.A型菌；3.B型菌；4.C型菌；5.D型菌；6.ddH2O；7.鏈球菌；8.沙門菌；9.大腸埃希菌；10.腐敗梭菌；11.金黃色葡萄球菌

2.3.4重復性 通過計算，批內重復試驗cpa、cpb和etx的CV值分別為0.27%～0.85%,1.02%～2.08%,1.23%～2.26%。批間重復試驗cpa、cpb和etx的CV值分別為0.44%～1.88%,1.00%～2.30%,0.44%～2.08%。以上CV值均小于4%，說明該方法具有良好的重復性。

2.3.5菌液和基因組DNA熒光定量PCR敏感性檢測 熒光定量PCR檢測結果顯示，B型菌液稀釋至5.0×106～5.0×102CFU/mL，具有較好擴增曲線及線性關系，因此，其檢測限為5.0×102CFU/mL。cpa、cpb和etx的擴增效率分別為101.5%，94.8%,92.1%，R2分別為0.994，0.997,0.999(圖5A，B)。基因組DNA稀釋至1.0×100～1.0×10-4mg/L，其對應的菌落數為2.91×106～2.91×102CFU/mL，具有較好的擴增曲線及線性關系，因此，其檢測限為100 μg/L和2.91×102CFU/mL。cpa、cpb和etx的擴增效率分別為82.3%,73.4%,79.6%，R2分別為0.999,0.996,0.999(圖5C，D)。

2.3.6臨床樣品檢測 熒光定量PCR結果顯示，20份樣品中16份樣品檢測到cpa，其中2份樣品檢測到etx，B型DNA作陽性對照擴增出cpa、cpb和etx，其他樣品cpa、cpb和etx均為陰性(圖6)。D型菌株DNA標準曲線顯示cpa比etx的Ct值大1.7左右，etx的表達量高于cpa。然而，2份樣品出現etx的Ct值大于cpa，cpa的表達量高于etx，推測樣品中既含A型又含D型菌。根據B型標準曲線，計算出樣品中產氣莢膜梭菌菌落數為102～104CFU/g，2份含D型菌樣品的A和D型菌菌落數均為102CFU/g，與菌落計數結果相比符合率達90%。樣品經分離純化，陽性分離率為80%且均為A型菌，與熒光定量PCR結果相比，1株熒光定量PCR檢測陽性但細菌分離鑒定結果為陰性，另有1株細菌分離鑒定為陽性但熒光定量PCR檢測為陰性，因此，該符合率為90%。說明此方法有良好的實用價值，且方便快捷可對羊源產氣莢膜梭菌進行分型及定量檢測。

A.菌液標準曲線；B.菌液敏感性；C.DNA標準曲線；D.DNA敏感性(藍色.cpa；綠色.cpb；橙色.etx)

1～3.B型DNA cpa、cpb、etx擴增曲線；4.陽性糞便樣品；5.陰性糞便樣品和陰性對照

3 討論

產氣莢膜梭菌不僅能引起多種動物的多種疾病和造成家畜的大量死亡，而且也直接危害著人類的健康。目前，已知羊源產氣莢膜梭菌主要引起羔羊和幼齡羊患病，對其他年齡段的羊只也有影響，但癥狀并不嚴重，雖然該病的發(fā)病率較低，但病死率卻很高。盡管接種疫苗大大降低了該病的發(fā)病率，但該病仍經常發(fā)生[12]，給我國養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴重的經濟損失，嚴重危害我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展。

現階段關于產氣莢膜梭菌的檢測方法主要包括多重PCR、LAMP、熒光定量PCR等[13-15]，但多重PCR檢測耗時長、流程較繁瑣，LAMP需要設計多條特異性引物、且易產生假陽性。而TaqMan熒光定量PCR技術是一種擁有較多優(yōu)勢的分子生物學方法，既可定性又可達到定量的目的。因此，建立針對A、B、C、D型羊源產氣莢膜梭菌的α、β和ε毒素基因的多重熒光定量PCR檢測方法。該方法可在1個體系內同時對96個樣品進行3個毒素的檢測，在臨床中，對液體樣品(飲水、污水或羊奶等)或經初步FTG厭氧培養(yǎng)的樣品直接檢測，固體樣品(糞便或飼料等)可提取總DNA后檢測[16]，依據建立的菌液和基因組DNA標準曲線，對樣品實現實時定量監(jiān)測。

本研究建立的熒光定量方法在敏感性方面，cpa、cpb和etx質粒拷貝數均可達1×102拷貝/μL(3.1×10-7mg/L)，而張蓉蓉等[17]建立的方法檢測限為1.5×10-5mg/L。菌液檢測限為5.0×102CFU/mL，DNA檢測限為100 μg/L，WISE等[18]建立的實時熒光定量PCR的靈敏度為50 μg/L，與本實驗室建立的多重PCR檢測方法的靈敏度(2.6×104CFU/mL)相比提高了100倍[13]。試驗結果表明，該方法具有良好的敏感性、特異性和重復性。

應用建立的多重熒光定量PCR方法，在采集的20份健康山羊糞便樣品中，14份檢測到A型，2份檢測到既含A型又含D型菌。然而，經分離純化鑒定均為A型菌。傳統分離鑒定方法雖無靈敏度限制，只要樣品中含目的菌，就可檢測到，但純化過程由于只挑取單個菌落，存在漏檢情況，導致最終結果不準確，同時，樣品菌落計數需要進行厭氧培養(yǎng)24 h以及菌落的鑒定，耗時長，過程繁瑣。本研究建立的方法可以彌補傳統方法存在的弊端，不僅準確快速地對樣品中產氣莢膜梭菌進行分型，而且可以實時監(jiān)測。該方法不僅為產氣莢膜梭菌引發(fā)疾病的生物安全提供快速便捷的技術支持，也為這些疾病的臨床檢測提供輔助手段。