不同填料性質對SMX 去除率的影響及微生物的響應特征

張啟文 楊紅薇 董曉明 羅景誠 江禹友

（西南交通大學地球科學與環境學院，四川成都 610031）

1 引言

近年來，隨著抗生素的大規模生產和持續使用，大量抗生素進入地表水和地下水體中，造成抗生素抗性基因和耐藥細菌的傳播，極大威脅著人類健康［1-2］。其中，磺胺甲 唑（Sulfamethoxazole，SMX）因具有復雜的分子結構和特殊的化學性質，在傳統的二級污水處理中難以高效去除［3］，是世界范圍內各城鎮二級污水處理廠出水中檢出頻率最高的抗生素［4-8］。城鎮污水處理廠作為抗生素進入自然水體中重要的防線之一，對防治抗生素進一步污染水環境具有重要作用，提高現有污水處理系統對抗生素的處理效率勢在必行。

人工快速滲濾系統（Constructed Rapid Infiltration System，CRI 系統）在河道微污染水凈化、二級生物處理出水深度凈化、分散農村生活污水處理等方面得到了廣泛的應用［9-11］。其中，滲濾系統中填料是核心，它既是吸附阻截污染物的主體，也是微生物附著生長的載體。針對傳統的土壤滲濾系統，秦可娜通過添加粉煤灰使系統對SMX 的去除率由72.04%提高到79.16%，對紅霉素的去除率由64.41%提高到68.11%［12］；劉芹芹采用陶粒混合粉質黏土、粗砂構建模擬柱使甲氧芐啶和SMX 的去除效率分別達到80%～90%和60%～70%［13］，證實了強化填料吸附性能改良系統功能的可行性。然而，填料吸附性增強帶來的去除效率提高持久性及對微生物附著生長的影響不甚明確。日本的He 等人模擬花崗巖土、石英砂等3 種填料滲濾系統對27 種微量藥物和個人護理品（PPCPs）的去除，結果表明，填料吸附的增強強化了系統運行效率，但對生物降解效果沒有影響［14］。因此，有必要針對滲濾填料吸附性與系統去除新興污染物的效果、系統微生物的響應狀況開展研究，以便于進一步明確滲濾系統凈化新興污染物的機理，為CRI 系統的進一步改進奠定基礎。

本文選取河沙、蛭石、火山巖和活性炭作為滲濾填料，構建了室內模擬系統，持續運行1 年左右。在了解CRI 系統對SMX 去除效果的基礎上，分別從填料種類和填料粒徑探究了其對CRI 系統去除SMX的影響機制及微生物的響應特征，為CRI 系統填料的優化和工程運行改進提供參考。

2 試驗材料與方法

2.1 填料

本試驗篩選了粗河沙、細河沙、蛭石、火山巖及活性炭作為備選填料，各填料的理化性質見表1。填料經自來水沖洗去除雜質后，在100～103 ℃烘干放至常溫，稱取適量填料裝入模擬柱中，填料高度為40 cm。

表1 填料性質及裝填參數

2.2 CRI 模擬試驗

2.2.1 模擬柱的構建

柱體試驗裝置如圖1 所示。試驗柱體為內徑5 cm、高50 cm 透明有機玻璃柱。為避免柱體內SMX 的光解，在柱體外表包裹錫紙。試驗從柱體頂端進水，以重力流方式從底端出水。

圖1 試驗模擬柱裝置示意

2.2.2 微生物接種及模擬柱的運行

系統正式運行前以豬糞水菌懸液和模擬廢水配制的接種液進行微生物接種。待系統氨氮去除率基本穩定后，在進水中添加抗生素開展試驗。以每天2個周期，水力負荷1.0 m3（/m2·d）運行；每周期進水10 min 后打開出水閥，收集周期內出水水樣，混勻后取1.5 mL 過0.22 μm 濾膜于棕色取樣瓶中，4 ℃保存待測。系統運行分成4 個階段，具體情況見表2。

表2 模擬柱4 個階段運行的相關參數

2.2.3 試驗水質

試驗用水為含30～140 μg/L SMX 的人工模擬城鎮二級污水處理廠出水，配方見表3。

表3 人工模擬城鎮二級污水處理廠出水配方 mg/L

2.2.4 填料微生物采樣

系統運行穩定后，在模擬柱運行后期對附著于填料上的微生物開展了采樣。取各系統表層以下5 cm左右的土壤樣品各0.5 g，混勻后裝入經121 ℃高壓滅菌的離心管中，存放于－20 ℃冰箱用于DNA 提取。

2.3 動態吸附批量試驗

按照2.2.1 的方法裝填完成后，在水力負荷為1.0 m3/（m2·d）條件下開展吸附試驗。進水分6 次完成，每批出水水樣單獨收集，混勻后取樣1.5 mL 存于棕色試劑瓶中，于4 ℃冰箱存放待測。

2.4 試驗藥品及儀器

藥品及試劑：SMX（色譜純，上海羅恩試劑廠）；K2HPO4、可溶性淀粉、NaHCO3、NH4Cl、葡萄糖、Mg－SO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；甲醇、冰乙酸（色譜純，成都市科龍化工試劑廠）。

試驗儀器：高效液相色譜儀配紫外檢測器（Waters2695）；色譜柱（Symmetry C18，型號4.6 mm×150 mm）；電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司，FA224）；電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，101－3AB 型）；超純水機（四川優普超純科技有限公司）。

2.5 測試指標及檢測方法

pH 采用pH－10 筆式酸度計測試，水溫和電導率使用STARTER 3100c 電導率儀同時測定，氨氮采用UV－4802H 紫外分光光度計測定，測試方法為納式試劑法。

SMX 采用Waters 高效液相色譜儀配紫外檢測器檢測，測定條件為：Symmetry C18（4.6 mm×150 mm）色譜柱，柱溫30 ℃，進樣體積20 μL，恒定流速為0.8 μL/min，流動相為甲醇與1‰冰乙酸35 ∶65 的比例，于270 nm 波長下檢測，SMX 出峰時間在4.9 min左右。

基于Illumina 高通量測序技術對土壤樣品的16S rRNA 基因V4－V5 區進行微生物群落分析：采用Omega 公司的E.Z.N.A. Soil DNA Kit 試劑盒按說明書提取DNA，使用熒光分光光度計檢測DNA 濃度和質量，調整DNA 溶液濃度；參考Su 等的方法選取引物及PCR 擴增［15］。PCR 擴增產物通過1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并使用Axygen 公司凝膠試劑盒回收，回收產物用Microplate Reader（BioTek，FLx800）定量儀器進行熒光定量。最后采用Illumina TruSeq DNA 文庫制備實驗流程構建上機測序文庫。

3 結果與討論

3.1 粗、細河沙填料模擬柱運行結果對比（相同材質不同粒徑）

粗河沙（粒徑0.3～1.0 mm）和細河沙（粒徑小于0.3 mm）模擬柱運行各階段的去除效果見圖2a。運行期間，去除率在23.2%～51.6%之間波動。隨著運行時間的增加，去除率呈逐步降低的趨勢。細河沙模擬柱填料粒徑更小，污染物與填料的接觸表面積更大，初期吸附性能略好于粗河沙（見圖2b），但從整體運行效率來看，小粒徑帶來的初期吸附性能強化，對系統整體去除率并沒有顯著正效應，反而是粗河沙模擬柱中微生物作用更強（見圖2c），使得系統整體去除效率更高。這與粗河沙大粒徑導致的系統孔隙率（粗河沙孔隙率19%，細河沙孔隙率6%）更高有關。有研究表明，好氧條件更有利于SMX 降解［16］，更大的孔隙率更有利于微生物的附著生長和系統復氧。系統內微生物群落特征測試結果（見3.5）很好地印證了這一觀點，尤其是屬水平上的優勢菌群伯克氏菌屬比例（粗河沙21.6%＞細河沙17.8%）與單周期SMX 微生物平均去除量表現出良好的對應關系。

圖2 粗、細河沙填料模擬柱性能對比

總的來說，相同材質（河沙）條件下，小于0.3 mm的粒徑雖然吸附性能優于0.3～1.0 mm 的粒徑范圍，但由于孔隙率偏低，不利于CRI 系統內的氧擴散和微生物降解，反而不利于SMX 的綜合去除。

3.2 細河沙、蛭石填料模擬柱運行結果對比（相同粒徑不同材質）

細河沙和蛭石填料模擬柱性能對比見圖3。

圖3 細河沙和蛭石填料模擬柱性能對比

細河沙和蛭石填料粒徑均小于0.3 mm，二者的運行結果如圖3a 所示。整體來看，蛭石系統去除效果在前3 個階段略優于細河沙柱體，這與蛭石吸附性能優于細河沙有關，但隨著運行時間的持續，吸附趨于飽和，微生物作用逐漸突顯，導致運行后期即階段4 細河沙柱體去除效果優于蛭石。從微生物對SMX 單周期去除量來看，細河沙明顯優于蛭石（見圖3c）。考慮到蛭石和細河沙系統孔隙率（蛭石9%、細河沙6%）均處于極低水平，系統復氧困難，不利于微生物降解SMX 的情況，觀察填料表面狀況（見圖4），發現蛭石表面為光滑層狀結構，與河沙相比，不利于微生物附著，這可能是導致其微生物作用整體較河沙弱的主要原因。

圖4 河沙和蛭石填料SEM 表面結構

總的來說，相同粒徑范圍不同材質條件下，模擬系統效能受吸附性能和微生物作用的綜合影響。當吸附性能差異不大（＜5%）時，長期運行（＞1 年）系統效能將主要受微生物影響，有利于微生物附著生長的填料去除效果更好。

3.3 粗河沙、火山巖填料模擬柱運行結果對比（吸附能力相似，不同粒徑）

以粗河沙（粒徑0.3～1.0 mm）和火山巖（粒徑1.0～2.0 mm）為填料的模擬柱運行情況如圖5a所示。火山巖的SMX 去除率在30.2%～51.6%之間，隨時間的變化總體趨勢仍是逐步降低，但火山巖模擬柱初期吸附性能略好，且微生物作用也較強，導致整體運行情況均優于粗河沙。比較而言，微生物作用的貢獻優于吸附，說明粒徑更大的火山巖（孔隙率35%）比粗河沙（孔隙率19%）更有利于微生物的附著和降解，與3.1 中粗河沙去除效果優于細河沙的規律一致。對照微生物響應狀況，更大孔隙率的火山巖單周期SMX 微生物平均去除量表現更好（見圖5c），對應屬水平上的優勢菌群伯克氏菌屬比例也更高（火山巖26.3%＞粗河沙21.6%）。

圖5 粗河沙和火山巖填料模擬柱性能對比

總的來說，在填料對SMX 的吸附性能略好的情況下，若填料粒徑更大，孔隙率更高，系統的整體表現將更好。

3.4 火山巖、活性炭填料模擬柱運行結果對比（相同粒徑，吸附能力差異巨大）

火山巖和活性炭填料模擬柱性能對比見圖6。

圖6 火山巖和活性炭填料模擬柱性能對比

火山巖和活性炭（粒徑均為1.0～2.0 mm）模擬柱運行情況見圖6a，二者顯示出高達50%左右的去除率差異。活性炭對SMX 的吸附能力顯著高于火山巖是其整體去除效果遠優于火山巖的主要原因，但另一方面，火山巖雖然孔隙率（35%） 高于活性炭（25%），但其微生物作用效果卻不如活性炭，分析認為這是在孔隙率達到一定程度，系統復氧差異不大的情況下，生物作用效率高低就取決于有效微生物豐度。對照微生物群落多樣性測試結果，活性炭系統內屬水平上的優勢菌伯克氏菌屬豐度占比更高（活性炭達51.2%，火山巖僅26.3%），證實了上述分析。顯然，活性炭的微生物降解效率也高于火山巖，系統整體表現更好。由此認為活性炭可作為改進CRI 系統去除新興污染物效率的備選填料。

值得注意的是，活性炭對30～140 μg/L 的SMX高達100%的吸附效率，不但沒有表現出對附著微生物的顯著抑制效應，反而提高了微生物群落中有利于SMX 降解的專性菌的占比，說明了抗生素SMX強烈的定向篩選作用。有學者研究顯示，包含SMX在內的20 種藥物化合物在0～500 μg/L 濃度水平下，微生物酶活性未受到抗生素抑制［17］，這與本試驗中微生物未受抑制的現象相符。

3.5 模擬CRI 系統內微生物群落特征與SMX 去除的關系分析

模擬柱運行后期，對各系統填料表面微生物進行采樣并開展Illumina 高通量測序分析。表4 列出了指示微生物多樣性的Shannon 指數。可以發現，活性炭填料上的微生物群落多樣性顯著低于其他模擬柱，這是由于活性炭吸附大量SMX 后對微生物產生強烈的定向篩選作用，導致微生物多樣性偏低。而SMX 去除效率相近的填料（如粗河沙和火山巖，細河沙和蛭石）其Shannon 指數也更接近。分析認為這一多樣性特征受到系統復氧狀況的影響，粗河沙和火山巖系統孔隙率大，復氧能力更強，微生物受到SMX和氧的雙重條件定向篩選，導致微生物多樣性偏低。

表4 5 個模擬系統中微生物物種豐富度和多樣性

圖7 對5 個模擬系統在門水平上的微生物群落進行了比較。5 個樣品共獲得27 個菌門，系統內優勢菌群為變形菌門，平均豐度達56.8%，其中，在活性炭中該菌門相對豐度最高（79.0%），其余幾種填料中該菌門豐度差異較小（48.0%～57.9%）。變形菌門在去除抗菌和抗炎物質方面有重要的促進作用［18］，在SMX 存在的情況下相對豐度最大，說明它具有耐藥性［19］。但值得注意的是，門水平的優勢菌群豐度與前述各模擬柱運行后期的單周期生物作用SMX平均去除量并沒有很好的對應關系。

圖7 各模擬系統微生物群落在門水平上的差異

進一步觀察屬水平上的優勢菌微生物豐度水平，見圖8。可以看出，屬水平上的優勢微生物伯克氏菌屬的豐度水平與各填料微生物作用強弱表現出良好的對應關系，說明伯克氏菌屬可能是模擬系統內降解SMX 的主要微生物。

圖8 各模擬系統微生物群落在屬水平上的差異

4 結論

通過不同填料的模擬CRI 系統試驗，分析系統中填料粒徑、初始SMX 吸附能力的影響及系統內微生物的響應特征，主要得出以下結論：

在1.0 m3/（m2·d）的水力負荷、每周期水力停留時間0.4～2 h 的條件下，粗河沙、細河沙、蛭石和火山巖的模擬CRI 系統對SMX 的總體平均去除率為23.2%～51.6%，隨時間呈顯著下降的趨勢，1 年后去除率僅為初始階段的50%左右。

在30～140 μg/L 的SMX 進水濃度下，活性炭持續表現出高于92.5%的SMX 平均去除率；系統微生物多樣性測定表明，伯克氏菌屬豐度占比高達51.2%，表現出顯著的微生物定向篩選作用。活性炭可作為改進CRI 系統去除新興污染物效率的備選填料。

在0.3～2.0 mm 的粒徑范圍吸附量差異不大的填料，裝填孔隙率偏大更有利于微生物對SMX 的去除，對應表現出優勢微生物伯克氏菌屬的豐度更高。

值得注意的是，經過約1 年的SMX 定向篩選作用，各模擬柱運行后期的SMX 生物降解量，與各填料上附著微生物在門水平上的優勢菌群豐度并沒有很好的對應關系，卻與屬水平上的優勢微生物伯克氏菌屬的豐度水平有著良好的對應關系，該現象可為利用屬水平的優勢微生物豐度指示系統微生物作用強弱提供參考。