酸性電解水對蘋果表面毒死蜱降解效果及降解途徑分析

烏云達來，郝建雄，劉海杰

（1.呼和浩特民族學院化學與環境學院，內蒙古呼和浩特 010051；2.河北科技大學食品與生物學院，河北石家莊 050018；3.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

蘋果是世界四大水果之一，中國已成為世界最大的蘋果生產國和消費國，也是蘋果產品出口大國。2019 年中國蘋果園面積為197.81 萬公頃，蘋果產量達到4242.54 萬噸[1]。為了保證產量和質量，不可避免地會使用大量的農藥來控制病蟲害，這往往會誘發蘋果中的農藥殘留，從而增加對人類健康的潛在危害。

毒死蜱（Chlorpyrifos，CP）是一種硫代磷酸酯類廣譜性殺蟲劑[2]，具有觸殺和胃毒的作用[3]，是果樹生產上少數允許使用的有機磷農藥之一[4]，廣泛應用于蘋果種植過程中[5]。盡管毒死蜱在農業上對控制蟲害有利，但在食品和環境中暴露毒死蜱殘留物仍引起健康問題。越來越多的證據表明毒死蜱和其他有機磷對兒童具有神經毒性[6?8]。例如，Bouchard 等[6]進行了一項7 歲兒童出生隊列研究（n=329），報告稱與對照組相比接觸高水平毒死蜱的兒童智商較低。在國內外，經常在蘋果或其它果蔬中發生毒死蜱檢出和超標問題[9?10]。因此，探索有效、可行、低成本的降解果蔬中農藥殘留方法成為實際生產中亟待解決的問題。

大多數蔬菜和水果在收獲后通常用清水沖洗，以去除表面的污垢，在食用前通常要再洗一遍。清洗是大多數加工方法中的第一步，也是去除蔬菜和水果中農藥殘留研究最多的一步。近幾年，酸性電解水（Electrolyzed oxidizing water, EOW）作為一種新型消毒劑已廣泛應用于農業、牙科、醫療以及食品工業上[11]。EOW 一般分為強酸性電解水（Strong acidic electrolyzed water，AcEW, pH<3.0）和微酸性電解水（Slightly acidic electrolyzed water，SAEW，pH 為5.0～6.5）。EOW 因容易制備、生產成本低、對人體和環境無害等優點[12]，在消除降解果蔬農藥殘留領域，具有廣闊的應用前景。盡管大量的研究結果證實了EOW 具有降解農藥的效果[13?14]，但對蘋果中毒死蜱的降解實驗及降解產物分析未見報道。因此，本文使用EOW 清洗處理蘋果，研究了毒死蜱的降解效果及對其品質的影響，并分析了毒死蜱的降解產物和途徑，為蘋果加工產業提供消除農藥殘留的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅富士（Malus pumilaMill）蘋果 摘自北京市海淀區聶各莊果園，挑選新鮮飽滿, 成熟度和大小均勻, 無病蟲害, 無機械損傷的蘋果作為實驗材料；毒死蜱 40%，惠州市中訊化工有限公司；毒死蜱標準品1.0 mg/mL，中國計量科學研究院；乙腈、甲醇、二氯甲烷、丙酮 分析純，DIKMA 公司。

CE-7001 強酸性電解水發生裝置 廣州賽愛環境保護技術開發有限公司；微酸性電解水裝置 實驗室自制設備；GC/MS-QP2010 氣質聯用色譜儀 日本島津公司；CNWBOND HC-C18固相萃取柱（500 mg/3mL） 德國CNW 科技公司；HP-5MSUI 色譜柱 美國惠普公司；Agilent 6890N 氣相色譜儀美國安捷倫科技有限公司；Thermo Orion 5 star 型pH/電導率/ORP 綜合測試儀 美國Thermo 公司；RE-52AA 旋轉蒸發器 上海振捷實驗設備有限公司；PAL-1 糖度計 日本Atago 公司；794 Basic Titrino 酸堿電位滴定儀 瑞士Metrohm 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EOW 的制備 EOW 的制備方法參照烏云達來等[13]的方法，稍作改進。在不同發生條件下從電解水發生器產生的強酸性電解水（AcEW）和微酸性電解水（SAEW），使用稀HCl 調節pH 達到所需pH，通過蒸餾水稀釋方法獲得實驗所需的有效氯濃度（Available Chlorine Concentration，ACC）。EOW 的理化指標如表1 所示。

表1 不同EOW 的理化指標Table 1 Physical and chemical indicators of different EOW

1.2.2 蘋果樣品前處理 實驗前將蘋果浸泡在濃度為100 mg/L 的毒死蜱溶液中, 充分浸泡2 h, 撈出后在 25 ℃的室溫下晾干后備用。每次實驗（重復）使用4 個蘋果，每顆蘋果約90 g。

1.2.3 EOW 降解蘋果表面毒死蜱殘留的研究

1.2.3.1 不同ACC 的AcEW 對蘋果表面毒死蜱的降解效果影響 為了研究不同ACC 的AcEW 對蘋果表面毒死蜱的降解效果的影響，設計了pH 相同（pH 2.80），而ACC 不同的AcEW 及自來水進行了浸泡實驗。將3.0 L AcEW 倒入體積為6 L 的塑料圓桶內，放入4 只蘋果，用不銹鋼網壓住蘋果，保證蘋果完全浸入水里；在室溫環境（23±1）℃下靜置浸泡處理15 min。處理結束后取出蘋果，切碎，勻漿，保存在?40 ℃，然后提取、凈化、GC 測定其農藥含量。實驗分五個處理，每個處理設3 個重復：無浸泡處理；自來水處理；AcEW 處理：ACC 10 mg/L；AcEW 處理：ACC 50 mg/L；AcEW 處理：ACC 100 mg/L。降解效果以農藥殘留率（%）或農藥降解率（%）表示。

1.2.3.2 AcEW 的處理時間對蘋果表面毒死蜱的降解效果影響 選擇ACC 為50 mg/L、pH 為2.80 的AcEW，取3.0 L 倒入6 L 塑料圓桶內，放入4 只蘋果，用不銹鋼網壓住，從而保證蘋果完全浸入水里，然后在（23±1）℃下靜置浸泡指定反應時間。實驗分五個處理：無浸泡處理；AcEW 浸泡5 min；AcEW 浸泡10 min；AcEW 浸泡15 min；AcEW 浸泡30 min。處理結束后取出蘋果，切碎，勻漿，保存在?40 ℃，然后提取、凈化、經GC 測定其農藥含量。

1.2.3.3 不同的清洗方法對AcEW 降解蘋果表面毒死蜱的影響 為了研究不同的清洗方法對AcEW 降解毒死蜱效果的影響，本實驗設計了不同的兩種清洗方法，即靜置浸泡和振蕩處理。每個處理方法隨機取出4 只蘋果，放入含有2.0 L AcEW（ACC 50 mg/L，pH 2.80）的體積為3 L 的塑料盒內，蓋上蓋，密封。實驗分兩個處理，每個處理重復三次：AcEW 靜置浸泡15 min；AcEW 振蕩處理（120 r/min，15 min）。處理結束后取出蘋果，切碎，勻漿，保存在-40 ℃，然后提取、凈化、經GC 測定其農藥含量。

1.2.3.4 AcEW 和SAEW 的毒死蜱降解效果比較為了比較AcEW 和SAEW 對毒死蜱的降解效果，實驗設計了ACC 為50 mg/L 的AcEW（pH 2.80）和SAEW（pH5.80）進行浸泡處理蘋果。實驗取不同的EOW 3.0 L 倒入10 L 塑料圓桶內，放入4 只蘋果，用不銹鋼網壓住蘋果，然后在（23±1）℃下靜置浸泡15 min。實驗分2 個處理，重復3 次：AcEW 浸泡15 min；SAEW 浸泡15 min。處理結束后取出蘋果，切碎，勻漿，保存在?40 ℃，然后提取、凈化、經GC 測定其農藥含量。

1.2.4 EOW 處理對蘋果品質變化的影響 取實驗用水3.0 L 倒入6 L 塑料圓桶內，放入蘋果，用不銹鋼網壓住蘋果，目的是保證蘋果完全浸入水里，然后在（23±1）℃下靜置浸泡指定反應時間。實驗分六個處理：無浸泡處理；自來水處理15 min；ACC 為50 mg/L的AcEW（pH 2.80）浸泡15 min；ACC 為50 mg/L的SAEW（pH 5.80）浸泡15 min；ACC 為100 mg/L的AcEW（pH 2.80）浸泡15 min；ACC 為100 mg/L的AcEW（pH 5.80）浸泡30 min。處理結束后取出蘋果，分別測定其Vc、總酚、花青素、可溶性固形物以及可滴定酸含量。

1.2.5 AcEW 降解毒死蜱產物分析 取5.0 mL AcEW（pH 2.80、ACC 10 mg/L），加入100 μL 毒死蜱（100.0 mg/L），使溶液中的最終農藥達到約2.0 mg/L，在漩渦振蕩器中漩渦振蕩5 s，靜置至指定反應時間（1 min 和10 min），然后立即加入0.5 mmol/L 的硫代硫酸鈉100 μL，振蕩30 s，終止其降解反應。降解實驗結束后經固相萃取提取、凈化，通過GC-MS 分析降解產物。

1.2.6 從蘋果中提取與檢測毒死蜱 參考農業標準NY/T 761-2008，并略作改進。將樣品切碎，勻漿2 min。準確稱取20.0 g 樣本勻漿置于200 mL 具塞三角瓶中，加50.0 mL 乙腈進入樣品中，震蕩提取20 min。過濾，將濾液收集到裝有7.0 g NaCl 的100 mL 具塞量瓶中，蓋上塞子劇烈振蕩1 min，室溫下靜置10 min，是乙腈和水相分層。吸取10.0 mL 乙腈相溶液，40 ℃下濃縮至近干，用1.00 mL 丙酮定容，用GC-FPD 檢測。

氣相色譜檢測條件為：色譜柱30 m×0.32 mm×0.25 μm，柱溫100 ℃，進樣口溫度250 ℃，FPD 檢測器溫度：250 ℃；升溫程序：100 ℃初溫保持1 min，以20.0 ℃/min 的速度升至180 ℃，保持 1 min，再以10.0 ℃/min 的速度升至230 ℃，然后以20.0 ℃/min的速度升至250 ℃；氣流條件：載氣（N2）流速：1.5 mL/min；氫氣（H2）流速：80 mL/min；助燃氣（Air）流速：120 mL/min; 進氧量：1 μL；進樣方式：不分流進樣。定量方式：峰面積法。

對毒死蜱殘留率及降解率的計算方法：

1.2.7 浸泡處理液中毒死蜱的提取與檢測 在毒死蜱的降解產物分析實驗中，蘋果浸泡液中毒死蜱的提取和凈化采取固相萃取方法。參照NY/T 761-2008 以 及 Yao 等[15]的 方 法， 并 略 作 改 進。CNWBOND HC-C18固相萃取柱（500 mg/3mL），依次用5.0 mL 乙腈、5.0 mL 甲醇和10.0 mL 水預處理，將樣品用0.1 mol/L HCl 調節pH 到2.0，取樣品溶液過固相萃取柱，過完柱后真空干燥柱30 min，用5 mL 的甲醇洗脫2 次，收集洗脫液。洗脫液減壓濃縮，用二氯甲烷定容至1.0 mL 作為供試品溶液。

氣相色譜檢測條件為：色譜柱HP-5MSUI（長度30 m，直徑0.25 mm，壁厚0.25 μm）；載氣：高純氦氣（99.999%）；柱流量：1.5 mL/min，采用恒壓控制模式；進樣量：1.0 μL，進樣方式：不分流進樣；進樣口溫度230 ℃；色譜柱升溫程序：35 ℃初溫保持1 min，8.0 ℃/min 的速度升至190 ℃，再2.0 ℃/min 的速度升至220 ℃，20 ℃/min 的速度到280 ℃，保持1.63 min。質譜條件：電子轟擊離子源（EI），單四級桿質量分析器，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃；檢測方式：全掃描，掃描質量范圍40～400 m/z。

1.2.8 指標測定 AcEW 樣品的pH 和氧化還原電位（oxidation reduction potential，ORP）采用Thermo Orion 5 star 型pH/電導率/ORP 綜合測試儀（Thermo公司）進行測定；ACC 采用碘量法進行測定[16]；果實蔬菜維生素C 含量測定采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[17]；總酚（TPC）含量的測定采用福林-肖卡法[18]；花青素含量的測定采用示差法[19]；蘋果可溶性固形物含量采用糖度計（PAL-1, Atago, Japan）測定；可滴定酸含量采用酸堿電位滴定儀測定。

1.3 數據處理

數據處理采用SPSS 16.0 軟件（Statistical Product and Service Solutions，SPSS）。每組實驗重復三次，結果以平均值±標準差表示。處理間差異采用鄧肯氏（Duncan’s test）多重比較，顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 EOW 對蘋果表面毒死蜱消除效果

2.1.1 不同ACC 的AcEW 對毒死蜱的降解效果影響 設計了不同ACC 的AcEW 浸泡蘋果15 min。圖1 表示不同的處理方法對毒死蜱的降解效果的影響。未清洗處理組（無處理組）的蘋果經檢測含有968 μg/kg 毒死蜱；經自來水浸泡15 min 后降解了17.2%的毒死蜱（殘留率為82.85%）；AcEW 處理組中隨著ACC 的增加，毒死蜱的降解效果也顯著提高，ACC 10 mg/L 時降解了27.1%（殘留率為72.9%），ACC 50 mg/L 時降解了56.4%（殘留率為43.6%），ACC 為100 mg/L 時降解了72.3%（殘留率為27.7%）。方差分析表明，各處理組之間有顯著性差異（P<0.05）。蘋果表面的毒死蜱殘留量隨著AcEW 的有效氯濃度的增加而降低，當ACC 為50 mg/L 時毒死蜱的降解效果可達極顯著水平（P<0.01）。

圖1 ACC 對蘋果表面毒死蜱的降解效果Fig.1 Effects of ACC on the degradation of chlorpyrifos on apples surface

2.1.2 AcEW 的處理時間對毒死蜱的降解效果的影響 使用ACC 為50 mg/L 的AcEW（pH 2.80），在不同的處理時間浸泡蘋果。其結果如表2 所示。由表2 可以看出，未浸泡處理蘋果表面毒死蜱含量為（968±63）μg/kg（100%）；蘋果表面的毒死蜱殘留隨著AcEW 作用時間的延長有所降低，在浸泡時間達到5 min 時，降解效果可達顯著水平（P<0.05）。在清洗處理30 min 時AcEW 的對毒死蜱的降解率達到69%以上（殘留率31%以下）。實驗結果說明AcEW 降解蘋果表面毒死蜱的過程是一個化學反應的過程，隨著時間的延長，反應能夠充分進行，降解效果會更好。

表2 AcEW 浸泡后的蘋果毒死蜱農藥殘留Table 2 The residues chlorpyrifos in apple after AcEW treatment

2.1.3 不同清洗方法對毒死蜱降解效果的影響AcEW 浸泡處理和震蕩處理對降解蘋果表面毒死蜱殘留的效果進行了比較，實驗結果如圖2 所示。從圖2 中可以看出，使用pH2.80，ACC 50 mg/L 的AcEW 靜置浸泡和振蕩處理15 min，對蘋果毒死蜱消除效果差別不大，無顯著性差異（P<0.05）。出現這種情況的原因，可能是由EOW 的理化性質所決定的。當儲藏于開口容器中，并伴隨攪拌和透光時，有效氯濃度的損失最大。當儲藏容器處于開口狀態，氯的損失符合一級動力學規律，但光照對氯的影響并不顯著[20]。在密閉避光的條件下EOW 的儲藏穩定性最高，而且SAEW 的儲藏穩定性要好于AcEW[20]。雖然震蕩處理可以使EOW 與蘋果表面的接觸更加充分，但是由于AcEW 的化學性質都不是很穩定，與空氣的充分接觸容易使其理化性質發生改變，從而可能影響其對農藥殘留的降解效果。

圖2 不同清洗方法對毒死蜱的降解效果的影響Fig.2 Effect of treatment type of AcEW on degradation of chlorpyrifos

2.1.4 不同EOW 對毒死蜱降解效果的影響 研究了AcEW 和SAEW 對毒死蜱的降解效果，實驗結果顯示（圖3），在相同的ACC（50 mg/L）下總體上表現出AcEW 降解效果比SAEW 好的趨勢。毒死蜱在AcEW 和SAEW 的殘留率分別為33.6%和36.6%，但無顯著性差異（P>0.05）。

圖3 AcEW 和SAEW 對毒死蜱降解效果的比較Fig.3 Degradation effect of chlorpyrifos treated with AcEW

2.2 EOW 處理對蘋果品質變化的影響

研究了EOW 浸泡處理蘋果后對蘋果的品質變化的影響，實驗結果顯示（表2），在ACC 為50 mg/L的AcEW 和SAEW 浸泡處理蘋果15 min，對蘋果的Vc、總酚、花青素、可溶性固形物、可滴定酸的含量沒有影響，數據之間無顯著性差異（P>0.05）。在ACC 為100 mg/L 的AcEW 分別浸泡15 min 和30 min 后，處理沒有對蘋果的Vc、總酚、花青素、可溶性固形物、可滴定酸等引起變化（表4），數據之間無顯著性差異（P>0.05）。因此使用ACC 為100 mg/L范圍內的AcEW 浸泡處理30 min 以內，不會引起蘋果品質變化。

表4 AcEW 的不同處理時間對蘋果品質變化的影響Table 4 Effects of treatment time of AcEW on qualities of apple

2.3 毒死蜱在EOW 中的降解產物分析

使用AcEW（pH2.8、ACC 10 mg/L）對初始濃度為2 mg/L 的毒死蜱進行了降解實驗，并在反應時間為1 min 和10 min 時取樣，進行GC-MS 分析。在反應時間1 min 時候，在總離子流圖（Total ion chromatogram, 簡稱TIC）中除了毒死蜱（Chlorpyrifos; 簡稱CP），還發現了降解產物毒死蜱氧化物（Chlorpyrifosoxon; Phosphoric acid, diethyl 3,5,6-trichloro-2-pyridyl ester; 簡稱CPO）和3,5,6-三氯吡啶-2-醇（3,5,6-trichloro-2-pyridinol; 簡稱TCP）。從圖4 看出，TCP 的保留時間為17.360 min，CPO 的保留時間26.641 min，CP 的保留時間為26.897 min。圖5、圖6、圖7 分別表示CP、TCP、CPO 的質譜圖和NIST 05 質譜庫檢索結果（匹配度>90%）。

圖4 毒死蜱降解產物總離子流圖Fig.4 The TIC spectra of chlorpyrifos

圖5 毒死蜱（CP）質譜圖Fig.5 GC/MS spectra ofchlorpyrifos

圖6 TCP 的質譜圖Fig.6 GC/MS spectra of TCP

圖7 CPO 質譜圖Fig.7 GC/MS spectra of CPO

表3 不同的EOW 對蘋果品質變化的影響Table 3 Effects of EOW treatments on qualities of apple

在反應時間為10 min 時，總離子流圖里沒有發現毒死蜱，而繼續發現了TCP 和CPO（圖8）。TCP和CPO 的保留時間分別為17.347 min 和26.599 min，經NIST 05 庫驗證確定為TCP 和CPO（匹配度>90%）。從圖4 和圖8 中可以看出，毒死蜱在通過pH2.8、ACC 10 mg/L 的AcEW 降解后，其反應時間1 min 時還有毒死蜱的色譜峰，但反應時間10 min時，毒死蜱全部已降解；而降解產物TCP 和CPO 的色譜峰高度在10 min 時明顯高于1 min，說明降解率隨著時間的延長而增加。

圖8 毒死蜱降解產物總離子流圖Fig.8 The TIC spectra of chlorpyrifos

關于毒死蜱在各種降解方法中產生的降解產物TCP 和CPO 的報道很多。其中，Wu 等[20]在研究毒死蜱在次氯酸鹽里的降解規律時，發現TCP 和CPO 是毒死蜱的主要降解產物。Zhang 等[21]在使用超聲波處理蘋果濃縮汁里的毒死蜱時也認為毒死蜱的主要降解產物是CPO。張慶芳等[22]使用γ射線輻射毒死蜱研究其輻射效果及產物分析，毒死蜱經輻射處理后發現4 種降解產物，其中就有TCP 和CPO，TCP 也是毒死蜱環境微生物降解產物[23]。因此可以認為，TCP 和CPO 是毒死蜱氧化和水解過程中常有的中間產物，本實驗的結果也證明了這一點。

農藥的降解過程是很復雜的化學反應過程，本實驗的總離子流圖里發現了很多降解產物，但某些成分因無法確定其化學結構，未能在本論文里進行詳細討論。有些降解產物可能在提取過程中因不易溶于提取溶劑或在其它提取過程中被流失，從而在質譜分析中可能會出現應值較低或沒有相應。

2.4 AcEW 降解毒死蜱降解途徑分析

在本研究中，AcEW 降解毒死蜱后發現了降解產物CPO 和TCP。AcEW 的主要有效成分為HOCl，HOCl 具有很強的氧化性和親電子性質[24?25]。

光催化降解有機磷農藥過程中·OH 攻擊有機磷農藥的P=S 鍵而把原來的P=S 鍵轉換成P=O 鍵，這是光催化降解有機磷農藥的一個反應特性[26]。Mahmod 等[27]在納米材料光催化降解毒死蜱的研究中認為其降解產物CPO 和TCP 是由·OH、-O2·引起的。在AcEW 降解農藥是個復雜的化學反應過程，作者認為pH2.8 的低pH 值下毒死蜱降解成CPO和TCP 可能與HOCl 和·OH 共同參與的結果。如下為毒死蜱在AcEW 中降解途徑的假設（圖9）。

圖9 毒死蜱在AcEW 中的降解途徑假設Fig.9 Proposed degradation pathways of main chlorpyrifos in AcEW

從毒死蜱到CPO，可能有兩種途徑；一是從（1）→（2）→（4）→（5），即HOCl 攻擊（1）的P=S 鍵，-H 加到S 上，-OCl 加到P 上，然后產生中間產物（4），中間產物（4）丟失S 而產生產物（5）。第二種可能途徑是從（1）→（3）→（4）→（5），即·OH 攻擊（1）的p=S 鍵，-OH 加到P 上，S 被活化，產生中間產物（3），中間產物（3）進一步脫氫，轉換為中間產物（4），中間產物（4）脫硫產生產物（5）。

從CPO 到TCP，·OH 攻擊（5）的-P=O 旁邊的P-O 鍵，導致產生產物（6）和含有OH-P=S 結構的產物（7）；或者·OH 攻擊（5）的-P=O 旁邊的P-O 鍵，導致產生產物（6）和含有H-P=S 結構的產物（8）。

3 結論

采用模擬污染蘋果方法，制備表面含有毒死蜱的蘋果樣品。通過強酸性電解水降解蘋果表面的毒死蜱實驗，發現其降解效率與反應時間、有效氯濃度有直接關系，隨著反應時間的延長或有效氯濃度的增加，降解效率也增加。當有效氯濃度達到50 mg/L時，浸泡15 min 會降解55%以上的毒死蜱殘留，并且與對照組自來水浸泡有極顯著差異（P<0.01）。當有效氯濃度為100 mg/L 時對毒死蜱的降解率超過了70%。在相同條件下強酸性電解與水微酸性電解水在降解毒死蜱的效果上無顯著差異，并且振蕩處理和浸泡處理對實驗結果沒有明顯影響。使用ACC 為100 mg/L 范圍內的AcEW 浸泡處理30 min以內，不會引起蘋果品質變化。

經GC-MS 分析，毒死蜱被強酸性電解水降解后，在降解產物中發現3,5,6-三氯吡啶-2-醇（TCP）和毒死蜱氧化物（CPO）。其可能的降解途徑認為是毒死蜱被HOCl 和·OH 共同作用后，毒死蜱→毒死蜱氧化物→3,5,6-三氯吡啶-2-醇→小分子有機物→無機物。本研究證明通過酸性電解水浸泡清洗蘋果能夠有效消除蘋果表面的毒死蜱殘留，為蘋果種植及加工產業提供參考。