蚯蚓糞和活性污泥浸提液對馬鈴薯致病菌的抑制作用

趙娜娜，潘瀟涵，陳 清，常瑞雪，陳 碩，崔建宇，慕康國

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，北京 100193；2. 農(nóng)田土壤污染防控與修復北京市重點實驗室，北京 100193）

0 引 言

馬鈴薯是中國重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟作物之一，近年來隨著馬鈴薯種植面積逐漸擴大，單一連作較為普遍，常年連作會導致土壤環(huán)境惡化，土傳病害日益嚴重，嚴重制約了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。目前，防治馬鈴薯土傳病害主要以輪作、選擇耐性品種、合理施肥等農(nóng)業(yè)防治以及噴灑農(nóng)藥等化學防治為主[2]，存在效率低、田間管理難度大和污染環(huán)境等問題。因此，開發(fā)一種經(jīng)濟有效、環(huán)境友好的防治方法受到廣泛關(guān)注和研究。

有機廢棄物中含有大量的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)以及活體微生物，可以有效的防治土傳病害[3-7]。有機廢棄物防治植物病害的主要機制包括：利用活體微生物（生防放線菌、真菌、細菌）的拮抗、競爭、重寄生作用等機制抑制病原菌的生長繁殖、削弱其致病能力，或誘導宿主植物抗病性[8-9]；利用抑菌活性物質(zhì)抑制土傳病原菌生長，緩解土壤連作障礙，促進植物生長，提高植物抗病性[10]。因此，開發(fā)有機廢棄物的生物活性功能符合可持續(xù)發(fā)展理念，不僅能抑制土傳病害的發(fā)生，還可提高有機廢棄物資源化利用程度，具有較高的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益。

蚯蚓糞和活性污泥是2種極具代表性的有機廢棄物，是當前生物防治研究的熱點。蚯蚓糞是通過蚯蚓降解有機廢棄物而產(chǎn)生的顆粒，有機物經(jīng)蚯蚓消化后微生物群落發(fā)生改變，而且形成的蚯蚓糞具有較高的孔隙度和較大的表面積，含有豐富的活性微生物，包括鏈霉菌、木霉和芽孢桿菌等，因此蚯蚓糞廣泛用于抑制土傳病害，修復土壤連作障礙[11-15]。Simsek等研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓糞能抑制黃瓜立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、卷心菜和西紅柿根系煙草疫霉菌（Phytophthora nicothianae）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）[16]。而且，將蚯蚓糞施入土壤中，可以提高土壤中微生物的數(shù)量和活性，增強病土自身對病原菌的抵抗能力。活性污泥主要由水和干物質(zhì)組成，干物質(zhì)分解會產(chǎn)生大量的營養(yǎng)物質(zhì)和有機物，通過增加土壤中的有機質(zhì)和養(yǎng)分含量來改善土壤團聚體的物理和化學性質(zhì)，此外還可以促進植物生長和防治土傳病害[17-18]。Ghini等通過大田長期定位試驗系統(tǒng)研究了活性污泥對土傳病原菌——番茄尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、大豆齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）、番茄核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、蘿卜立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、黃 瓜 腐 霉 菌（Pythium aphanidermatum）和番茄青枯假單胞菌（Pseudomonas solanacearum）的抑菌效果。結(jié)果顯示，活性污泥施用有利于改善土壤的化學、物理和生物特性，同時表現(xiàn)出對植物土傳病原菌不同程度的抑制作用[19]。

本文以2株馬鈴薯土傳病原菌真菌立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）為靶標病原菌，探究了有機廢棄物活性污泥和蚯蚓糞的浸提液對馬鈴薯土傳病原菌的抑制作用。并通過盆栽試驗分析對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的馬鈴薯莖潰瘍病的防治效果，以及對馬鈴薯幼苗的促生作用。期望為馬鈴薯農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及有機廢棄物資源化利用提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試活性有機廢棄物：蚯蚓糞，以秸稈和牛糞為原料進行堆制，青島齊沃農(nóng)業(yè)科技有限公司提供；活性污泥，是加工味精產(chǎn)生的污水經(jīng)厭氧發(fā)酵后的沉淀物，由山東一家味精企業(yè)提供（表1）。

表1 有機廢棄物浸提液的理化性狀指標Table 1 Physical and chemical properties of organic waste extraction

供試病原菌：立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）（R.solani）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）（F.oxysporum），均分離自馬鈴薯土傳真菌病害，由中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院提供。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基，即馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 活性有機廢棄物浸提液制備

采用水浸提法制備浸提液[20]，分別稱取10 g過0.2 mm篩的蚯蚓糞和活性污泥于250 mL 三角瓶中，加蒸餾水100 mL，置于25 ℃、200 r/min搖床，振蕩培養(yǎng)90 min，然后用15μm孔徑濾紙過濾，得到有機廢棄物浸提液（固液比1∶10（kg∶L）），于4℃冰箱冷藏保存，備用。

1.3 廢棄物浸提液皿內(nèi)抑菌試驗

用無菌水將蚯蚓糞浸提液、活性污泥浸提液及其1∶1復配液稀釋至所需濃度，具體試驗設(shè)置見表2。采用生長速率法測定抑菌效果，用無菌槍頭吸取100μL稀釋液，均勻涂布在PDA平板表面上，空白對照為加入等體積的無菌水。用打孔器將生長良好的立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌制成5 mm菌餅，接種在含有浸提液的平板中央，每個平板中放1個菌餅，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)3～10 d（視菌落生長情況而定），用十字交叉法測量菌落直徑，并計算菌絲生長的抑制率，每個處理5次重復。

表2 活性有機廢棄物浸提液稀釋倍數(shù)Table 2 Dilution ratio setting of active organic waste extraction

1.4 蚯蚓糞和活性污泥浸提液對馬鈴薯莖潰瘍病的防效

1）供試作物及預(yù)處理

馬鈴薯，品種為費烏瑞它荷蘭15號，用0.1%的NaClO溶液浸泡消毒20 min后用蒸餾水清洗，置于暗室催芽2～3周，挑選幼芽長短、大小一致的薯塊切下用于盆栽試驗。

2）供試土壤與病原接種體制備

供試土壤采自北京市房山，土壤基本理化性質(zhì)見表 3。將土壤曬干、過篩，按照1∶1比例（V/V）將蛭石和土混合均勻，160 ℃下滅菌300 min后備用。

表3 供試土壤的基本理化性狀Table 3 Basic physical and chemical properties of soil

病原菌接種體制備[21]：去皮小麥仁用蒸餾水沖洗2～3次并浸泡過夜，風干后置于錐形瓶內(nèi)，每瓶150～200粒，121 ℃高溫濕熱滅菌40 min，冷卻后備用；將立枯絲核菌接種于PDA平板上，28 ℃活化3～4 d，然后將滅菌的小麥仁均勻撒落在菌落上，繼續(xù)培養(yǎng)5～8 d，作為接種體。

3）盆栽試驗

將帶芽薯塊定植于14 cm×16 cm的塑料盆中，每盆裝土1 kg（干土質(zhì)量），在馬鈴薯幼芽正上方的土層上擺放1粒接種體，最后以無菌土覆蓋。試驗共設(shè)置11個處理（表4），每個處理5盆，每盆2株。定植當天澆灌各處理液100 mL，并在播種后15、30 d追施各處理液，澆灌于植株的根部，每盆每次澆灌100 mL。試驗周期為40 d，第41 天收樣。

表4 馬鈴薯苗期施加的浸提液及處理方式Table 4 The extraction and application method applied at the seedling stage of potato

1.5 指標測定

采用十字交叉法分別測量處理和對照的病原菌菌落直徑。病原菌生長抑制率RI（%），計算公式

根據(jù)馬鈴薯黑痣病病情分級標準，統(tǒng)計盆栽馬鈴薯病情指數(shù)。計算公式如下

病害分級標準：0級，健康；1級，潰瘍面積<10%；2級，潰瘍面積10%～50%；3級，潰瘍面積>50%；4級，植株死亡。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 2017軟件作圖，采用 SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚯蚓糞和活性污泥浸提液對病原菌生長的抑制作用

2.1.1 蚯蚓糞浸提液對病原菌生長的抑制作用

不同稀釋倍數(shù)的蚯蚓糞浸提液對立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的抑制作用見圖1a。蚯蚓糞浸提液對病原菌的抑制作用隨著稀釋倍數(shù)的降低而增強，其中蚯蚓糞浸提液稀釋100倍時，對立枯絲核菌的抑制率為78.3%，對尖孢鐮刀菌的抑制率為60.1%。蚯蚓糞浸提液稀釋1 000倍，對立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的抑制率分別為62.8%和27.6%，對立枯絲核菌的抑制率與稀釋20倍相比無顯著差異，對尖孢鐮刀菌抑制作用效果極大地降低。

圖1 b表示滅菌后的蚯蚓糞浸提液對立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的抑制作用效果。蚯蚓糞浸提液高溫滅菌后對病原菌的抑制作用極大降低，病原菌菌落直徑與空白對照相比差別不大。蚯蚓糞浸提液稀釋100倍對立枯絲核菌的抑制率為18.4%，對尖孢鐮刀菌的抑制率僅為5.3%。浸提液高溫滅菌后對病原菌的抑制作用顯著降低，可能是由于高溫殺滅了蚯蚓糞中的微生物，使其喪失了對病原菌的抑制能力。胡艷霞等從蚯蚓糞中分離得到了兩株鏈霉菌，其對多種病原真菌均有一定抑制作用[22]。穆靜娟等從蚯蚓糞中篩選出一株具有廣譜拮抗病原真菌的枯草芽孢桿菌M29，該菌株對10種病原菌均有抑制作用[23]。

2.1.2 活性污泥浸提液對病原菌生長的抑制作用

不同稀釋倍數(shù)的活性污泥浸提液對立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的抑制作用見圖2a。活性污泥浸提液稀釋10 000倍仍然顯示出較高的抑菌活性，顯著地抑制了病原菌的生長。隨著浸提液稀釋倍數(shù)降低，活性污泥浸提液對病原菌的抑制作用增強。活性污泥浸提液稀釋100倍后對立枯絲核菌的抑制率為98.8%，對尖孢鐮刀菌的抑制率為75.8%。活性污泥對立枯絲核菌的生長抑制作用極強，可能由于污泥中的成分對不同病原菌的作用程度不同，或與供試病原菌自身屬性有關(guān)[24]。

由圖2b滅菌后的活性污泥浸提液對立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌的抑制作用效果可知，活性污泥浸提液高溫滅菌后對病原菌的抑制作用降低，菌落直徑與空白對照相比差別不大。浸提液稀釋100倍后對立枯絲核菌的抑制率為20.3%，對尖孢鐮刀菌的抑制率為9.2%，表明污泥對病原菌的抑制作用主要是微生物的作用，Scheuerell等研究也表明，堆肥浸提液的生防效果與浸提液中的微生物數(shù)量有關(guān)[25]。

2.1.3 蚯蚓糞和活性污泥浸提液1∶1復配對病原菌生長的抑制作用

浸提液復配處理對立枯絲核菌和尖孢鐮刀的生長的抑制作用見圖3。與蚯蚓糞、活性污泥浸提液單獨處理相比，同一稀釋倍數(shù)浸提液復配處理后對病原菌的抑制作用提高。浸提液稀釋1 000倍復配后，對立枯絲核菌的抑制率為98.6%，比蚯蚓糞浸提液單獨處理提高約65.2%，比活性污泥浸提液單獨處理提高18.8%；對尖孢鐮刀菌的抑制率為72.6%，比蚯蚓糞浸提液單獨處理提高216%，比活性污泥浸提液單獨處理提高18.0%。

2.2 蚯蚓糞和活性污泥浸提液對馬鈴薯莖潰瘍病的盆栽效果

蚯蚓糞和活性污泥浸提液對馬鈴薯幼苗莖潰瘍病的防治效果見圖4。蚯蚓糞和活性污泥浸提液均能夠防治馬鈴薯苗期莖潰瘍病，防治程度與浸提液稀釋倍數(shù)相關(guān)，浸提液稀釋倍數(shù)越小，對馬鈴薯莖潰瘍病的防治效果越好。稀釋倍數(shù)為50時，蚯蚓糞和活性污泥浸提液對病害的防治效果分別達75.0%和81.3%。有研究表明，廢棄物中的微生物活性、營養(yǎng)元素以及其他的物理化學性質(zhì)等幾種因素共同發(fā)揮作用，抑制病原菌的繁殖，促進植株生長[26-28]。

蚯蚓糞與活性污泥浸提液混合處理對立枯絲核菌感染的馬鈴薯苗期病害的抑制效果與單一浸提液處理效果相比更好。混合液稀釋倍數(shù)為200時，防效可達69.0%，與單獨施用蚯蚓糞和活性污泥浸提液相比防效分別提高38.0%和21.1%。因此，活性污泥和蚯蚓糞混合施用對馬鈴薯幼苗生長的促進作用也起到了協(xié)同增效的效果。

圖5 表示不同處理對馬鈴薯幼生長的影響。與病原菌對照相比，稀釋50、200倍的蚯蚓糞浸提液對馬鈴薯幼苗的株高和莖粗具有顯著的促進作用，株高分別較對照提高109.5%和42.9%，莖粗分別較對照提高95.6%和63.0%。活性污泥浸提液稀釋50、200、400倍對馬鈴薯幼苗的株高和莖粗均具有顯著促進作用，株高與病原菌對照相比分別提高81.6%、61.9%和47.6%，莖粗與對照相比分別提高81.4%、69%和60.8%。二者復配液稀釋50、200倍對馬鈴薯幼苗的株高和莖粗具有顯著的促進作用。其中，200倍稀釋液施用后，與病原菌對照相比株高增長了56.8%，但兩者復配對馬鈴薯幼苗的株高未表現(xiàn)出協(xié)同作用。

有機廢棄物浸提液對馬鈴薯質(zhì)量的影響如圖5c和5d所示。稀釋50倍、200倍的蚯蚓糞浸提液對馬鈴薯幼苗的干重具有顯著的促進作用，質(zhì)量分別較病原菌對照提高97.6%和77.6%。活性污泥浸提液稀釋50、200、400倍對馬鈴薯幼苗的質(zhì)量均具有顯著促進作用，干重與對照相比分別提高78.0%、48.8%和36.6%。

3 結(jié) 論

本研究采用生長速率法測定蚯蚓糞、活性污泥浸提液及二者混和液的抑菌作用，并通過盆栽試驗分析對馬鈴薯莖潰瘍病防治作用和對馬鈴薯幼苗生長的促進作用，得出以下結(jié)論：

1）蚯蚓糞和活性污泥浸提液均能顯著抑制病原菌生長，其抑制率隨著稀釋倍數(shù)降低而增強，且與蚯蚓糞和活性污泥浸提液單獨處理相比，同一稀釋倍數(shù)浸提液復配后對病原菌抑制作用有協(xié)同增效作用。

2）將有機廢棄物浸提液高溫滅菌后，對病原菌抑制效果極大的下降，與空白對照相比相差較小。蚯蚓糞浸提液稀釋100倍對尖孢鐮刀菌的抑制率僅為5.3%，活性污泥浸提液稀釋100倍對尖孢鐮刀菌的抑制率為9.2%。

3）施用蚯蚓糞和活性污泥浸提液對馬鈴薯莖潰瘍病有良好的防治效果，且兩者混施起到了協(xié)同防治馬鈴薯莖潰瘍病的效果，混合液稀釋倍數(shù)為200時，與單獨施用蚯蚓糞和活性污泥浸提液相比防效分別提高38.0%和21.1%。同時，有機廢棄物浸提液灌根施用能促進馬鈴薯幼苗的生長。

綜上，有機廢棄物蚯蚓糞和活性污泥浸提液對馬鈴薯的2株致病菌具有抑制效果，且混合施用具有協(xié)同增效作用。因此，可將蚯蚓糞與活性污泥浸提液用于馬鈴薯土傳病害的防治。