羊棲菜多糖提取條件優化

冉宇晴， 陸海濱， 姚湛江， 高麗， 南春容， 金月玲

(溫州醫科大學 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

羊棲菜(Sargassumfusiforme)又名海大麥、鹿角尖等，隸屬褐藻門圓子綱墨角藻目馬尾藻科馬尾藻屬，是藥食兩用的大型海藻，素有“長壽菜”之美譽[1-2]。羊棲菜主要生長于太平洋西北部，在我國北至遼東半島南至廣東雷州半島的沿海區域以及日本和朝鮮南岸均有分布[3]。目前，羊棲菜在浙江溫州洞頭海區有大量的人工養殖，是一種重要的出口創匯海藻資源。羊棲菜含有豐富的多糖、粗纖維、維生素和礦物質等營養物質，羊棲菜多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂和免疫調節等多種藥理活性[4-5]。

本試驗以羊棲菜為原料，通過單因素試驗研究料液比、Na2CO3濃度、提取溫度、提取時間和提取次數對羊棲菜多糖提取工藝的影響，在單因素試驗的基礎上，利用正交試驗優化提取工藝并確定最佳條件，旨在為羊棲菜多糖資源深度開發與利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

羊棲菜采自溫州洞頭，洗凈、去除雜質后于60 ℃烘箱中干燥至恒重，研碎過40目篩，裝袋備用；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、無水Na2CO3粉末，均為分析純。

DGG-9070B型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)、TDL-80-2B低速離心機(上海安亭科學儀器廠)、TGL-16B高速離心機(上海安亭科學儀器廠)、家用粉碎機、DK-booB電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)、HWS-24電熱恒溫水浴鍋(上海恒科學儀器有限公司)、722s可見分光光度計(上海儀電分析儀器制造)。

1.2 方法

以苯酚-硫酸法測定羊棲菜提取液中多糖含量[6]。標準曲線的繪制：分別取濃度為0.1 g·L-1的葡萄糖標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL于6支具塞試管中，加入蒸餾水補至1.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL硫酸，靜置10 min。振蕩搖勻，30 ℃水浴反應20 min，于490 nm測吸光度。以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為A=0.84C+0.007 7，R2=0.998 2。

多糖含量的測定：取稀釋后的濾液1.0 mL，加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL硫酸，靜置10 min。振蕩搖勻，30 ℃水浴反應20 min，于490 nm測吸光度。將吸光度換算成濃度，計算多糖得率。

1.2.1 料液比對羊棲菜多糖得率的影響

準確稱取羊棲菜粉末5份，每份10.0 g，設定Na2CO3濃度為2.0%，水浴溫度為80 ℃，提取時間為3 h，在料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶80的條件下熱水浴提取2次，計算多糖得率。

1.2.2 Na2CO3濃度對羊棲菜多糖得率的影響

準確稱取羊棲菜粉末8份，每份10.0 g，固定水浴溫度為80 ℃，提取時間為3 h，根據試驗1.2.1節結果，料液比為1∶30，在Na2CO3濃度分別為0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%的條件下熱水浴提取2次，計算多糖得率。

1.2.3 提取時間對羊棲菜多糖得率的影響

準確稱取羊棲菜粉末10.0 g，根據試驗1.2.2節的結果，在Na2CO3濃度為1.0%，提取溫度為80 ℃，料液比為1∶30的條件下進行熱水浴提取，在提取時間分別為0.5、1、2、3、4和5 h時，取提取液計算多糖得率。

1.2.4 提取溫度對羊棲菜多糖得率的影響

準確稱取羊棲菜粉末3份，每份10.0 g，根據前面試驗的結果，將Na2CO3濃度設為1.0%，提取時間設為3 h，料液比設為1∶30，在提取溫度分別為65、80和95 ℃的條件下熱水浴提取2次，計算多糖得率。

1.2.5 羊棲菜多糖正交試驗設計

根據單因素試驗結果，以料液比、Na2CO3濃度、提取溫度及提取時間為考察對象，以總糖得率為指標，進行4因素3水平正交試驗確定最佳提取工藝條件。

1.2.6 浸提次數對羊棲菜多糖得率的影響

準確稱取羊棲菜粉末2份，每份10.0 g，分別編號為A、B，在Na2CO3濃度為1.0%、提取溫度為95 ℃、提取時間為3 h、料液比為1∶30的條件下，熱水浴提取3次，分別計算多糖得率。

2 結果與分析

2.1 料液比對羊棲菜多糖得率的影響

進行預試驗時發現，料液比低于1∶30時提取液過于黏稠而無法分離濾液，故試驗設計料液比最低為1∶30。料液比為1∶30時多糖得率最高，第一次提取為17.1%，第二次提取多糖得率為8.5%，總糖得率為25.6%。隨料液比增加，多糖得率呈下降趨勢，當料液比增加到1∶40時，2次提取的多糖總得率下降為21.0%(圖1)。

圖1 料液比對羊棲菜多糖得率的影響

2.2 Na2CO3濃度對羊棲菜多糖得率的影響

在Na2CO3濃度為0～1.0%時，羊棲菜總糖得率隨著Na2CO3濃度的增加而迅速提高。當Na2CO3濃度達到1.0%時，第一次提取多糖得率為19.3%，第二次提取為5.5%，總糖得率達24.8%。Na2CO3濃度為1.0%～4.0%時，總糖得率基本維持不變(圖2)。

圖2 Na2CO3濃度對羊棲菜多糖得率的影響

2.3 提取時間對羊棲菜多糖得率的影響

隨著提取時間的增加，羊棲菜多糖得率呈上升趨勢。2 h內多糖得率迅速上升，2 h后得率升高的趨勢趨于平緩，提取時間達3 h后得率基本不再增加。本試驗條件下提取時間3 h時多糖得率最高，為11.4%(圖3)。

圖3 提取時間對羊棲菜多糖得率的影響

2.4 提取溫度對羊棲菜多糖得率的影響

隨著提取溫度的升高，羊棲菜總糖得率明顯增加(圖4)。在提取溫度為65、80和95 ℃時，第一次提取的多糖得率分別為10.95%、11.35%和16.63%；第二次提取得率分別為9.37%、12.80%和10.24%，總糖得率分別為20.3%、24.4%和26.9%。可見羊棲菜多糖提取率隨著提取溫度的升高而增加。

圖4 提取溫度對羊棲菜多糖得率的影響

2.5 羊棲菜多糖提取正交試驗

由表1可知，影響多糖得率的因素由大到小依次排列為C>B>D>A，即Na2CO3濃度>提取時間>料液比>提取溫度，同時可知各因素的優化工藝參數為A3B3C2D1。即提取溫度為95 ℃，提取時間為3 h，Na2CO3濃度為1.0%，料液比為1∶30。正交試驗結果顯示，最佳工藝條件下多糖單次得率為16.6%，此結果與試驗1.2.4結果一致。

表1 熱水浴堿解提取羊棲菜多糖的正交試驗結果

2.6 浸提次數對羊棲菜多糖得率的影響

在本試驗最優提取條件下，第一次提取多糖的平均得率為17.1%，第二次提取為8.5%，第三次提取為2.8%，3次提取得率比為6∶3∶1(表2)。受植物體內多糖含量的影響，浸提到達一定次數時，其多糖的濃度會到達一個極限[7-8]。綜合來看，進行2次浸提就已經能提取出絕大部分多糖，考慮到人力物力條件，進行2次提取較為適宜。

表2 不同浸提次數的羊棲菜多糖得率

3 小結

不同提取方法和工藝對植物多糖提取效果具有顯著差異。王凌云[3]在80 ℃、加水量50倍、pH值為5的酸性條件下提取5 h，羊棲菜多糖得率為10.9%。寧亞靜[9]在85 ℃、料液比分別為1∶30和1∶20的條件下，進行2次時間為3 h和2 h的熱水提取，羊棲菜多糖最高得率為20.4%。其試驗方法與本試驗相似，但設定的提取溫度比本試驗最佳提取溫度低，多糖得率也比本試驗低，說明本試驗的提取條件具有一定的優越性。丁浩淼等[10]采用循環超聲法提取羊棲菜多糖，得率為10.5%。宋偉康等[11]根據Box-Behnken試驗設計，考察液料比、提取時間、提取溫度3個工藝條件，確定了超聲波輔助稀堿提取葉托馬尾藻多糖的最佳工藝參數為液料比48.56∶1、提取時間5.78 h、提取溫度70.91 ℃。與本試驗確定的最佳提取條件相比，其最佳工藝條件數值較低，可能是因為有超聲波的輔助。本試驗采用熱水浸提法提取羊棲菜多糖，所得多糖提取液以苯酚-硫酸法測定糖含量，此方法所需儀器、藥品價格低廉，操作方便，通過精密度、重復性試驗結果可以看出此方法適合羊棲菜多糖的提取。

試驗結果表明，影響羊棲菜多糖得率的因素由大到小依次排列為Na2CO3濃度>提取時間>料液比>提取溫度；羊棲菜多糖最佳提取工藝條件為：料液比1∶30、Na2CO3濃度1.0%、提取溫度95 ℃、提取時間3 h、浸提次數2次，其多糖得率為25.6%。