糖基化大豆分離蛋白納米乳液的制備及其穩定性研究

趙晨宇，布冠好，陳復生，于 珍

河南工業大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001

大豆蛋白來源豐富，價格低廉，具有較高的營養價值[1]和較好的功能性質[2-3]，是一種比較理想的植物蛋白類乳化劑，但在極端環境中蛋白質容易變性，難以維持體系的穩定性，因此通常與其他乳化劑結合[4]或采用改性等方式[5-6]，提高體系對抗環境變化的能力。糖基化是一種綠色、安全的改性技術，通過適當的干熱或濕熱處理，能夠促使蛋白質的游離氨基與還原糖的羰基共價結合[7]，改變蛋白質的空間結構，有利于提高蛋白質的乳化特性[8]。通常分子量較小的單糖或二糖具有較高的反應活性，能夠在短時間內生成更多的共價復合物[9-10]，同時也很容易生成美拉德反應副產物[11]；分子量較大的多糖具有較高的空間位阻效應，對蛋白質乳化特性的改善效果更好，但接枝效率較低，反應時間較長[12-14]。

低聚半乳糖是一類由半乳糖基和葡萄糖基構成的寡糖類混合物，在人母乳中含量較多[15]。因具有調節腸道菌群、改善腸道功能、調節免疫的能力[16-18]，一般用于生產嬰幼兒配方乳粉。另外，低聚半乳糖分子量適中，具有較好的酸、熱穩定性，并且能與蛋白質發生美拉德反應[19]，有效降低蛋白質的致敏性[20]。因此，作者旨在通過濕熱糖基化制備大豆分離蛋白-低聚半乳糖共價復合物，再以復合物為乳化劑制備納米乳液，研究酸、鹽離子、溫度對乳液穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白：河南省鯤華生物技術有限公司；低聚半乳糖：上海源葉生物科技有限公司；大豆油：益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；其余試劑：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DYY-6D型電泳儀：北京市六一儀器廠；TU-1901紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；AH-BASIC 100高壓均質機：德國ATS儀器公司；ZS90納米粒度電位儀：英國Malvern Instruments Ltd。

1.3 方法

1.3.1 糖基化產物的制備

稱取一定質量的大豆分離蛋白溶于0.05 mmol/L、pH 10.0的硼砂緩沖液中，配制成質量分數4%的溶液，攪拌過夜，按照質量比1∶ 1添加低聚半乳糖，磁力攪拌30 min后，80 ℃恒溫水浴一定時間，立即采用冰水浴終止反應，4 ℃下透析48 h，冷凍干燥，得到不同反應程度的糖基化產物，儲存于-20 ℃的冰箱備用。

1.3.2 納米乳液的制備

稱取質量分數0.5%的樣品和0.02%的疊氮鈉，添加去離子水，磁力攪拌2 h后，加入5% (V/V)的大豆油，以12 000 r/min剪切2 min，然后在50 MPa條件下均質1 min，得到納米乳液[21]。

1.3.3 接枝度的測定

采用鄰苯二甲醛法。參考Wang等[6]的方法略有改動，根據賴氨酸標準曲線，計算游離氨基含量。每個時間點下糖基化產物的接枝度按下式計算。

式中：C0和Ci分別表示反應時間為0 min和imin的游離氨基含量，mol/L。

1.3.4 褐變程度及中間產物的測定

參考Kim等[22]的方法略有改動。以10% SDS和0.05 mol/L硼砂的溶液為稀釋液，褐變程度以420 nm處的吸光度表示，中間產物以294 nm處的吸光度表示。

1.3.5 溶解度的測定

采用考馬斯亮藍G250染色法。參考周洋瑩等[23]的方法略做修改，配制5 mg/mL的蛋白溶液，4 500 r/min離心10 min，上清液為試樣待測液。根據牛血清蛋白標準曲線，計算出樣品中蛋白質含量。蛋白質溶解度按下式計算。

1.3.6 乳化特性的測定

參考Ma等[5]的方法略做修改。乳化活性(EAI)和乳化穩定性(ESI)按下式計算。

式中：N表示稀釋倍數；θ表示油相體積比；L表示比色皿厚度，cm；C表示蛋白質質量濃度，mg/mL；A0、A10分別表示0 min和10 min的吸光度；10為2次測定的時間間隔，min。

1.3.7 SDS-PAGE測定

參考曹靜等[12]的方法略做修改。配制蛋白質量濃度為2 mg/mL的樣品溶液，選用4%的濃縮膠和8%的分離膠，采用考馬斯亮藍染色液對凝膠進行染色。

1.3.8 乳液粒徑、分散指數(PDI)及電位的測定

采用納米粒度及Zeta電位分析儀測定乳液的平均粒徑、PDI及Zeta電位。儀器參數：折射率1.450，測試溫度25 ℃，平衡時間120 s，每個樣品測試3次[4]。

1.3.9 納米乳液穩定性測定

酸處理：取適量乳液用0.1 mol/L HCl溶液調節pH至6.0。采用1.3.8中的方法測定乳液粒徑變化，然后取5 mL于比色管中，室溫(25 ℃±2 ℃)放置1周后記錄乳液外觀。

熱處理：取適量乳液在80 ℃條件下處理30 min，冷卻至室溫，然后按上述方法測定乳液穩定性。

鹽離子處理：取適量乳液與300 mmol/L NaCl溶液等體積混合，然后按上述方法測定乳液穩定性。

1.3.10 數據分析

采用SPSS 20.0和Origin 2019軟件進行統計分析及作圖，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 糖基化反應程度

反應時間對接枝度、褐變程度及中間產物的影響如圖1所示。隨著反應時間的延長，SPI與GOS的接枝度逐漸增加，最高達到43.23%；褐變程度及中間產物均呈現先增加后趨于穩定的趨勢。原因可能是在反應初期，SPI的游離氨基基團不斷暴露，并與GOS的羰基基團發生反應，引起接枝度、褐變程度及中間產物的增加；而在反應180 min后，接枝度持續增加，褐變程度趨于穩定，而中間產物有所減少，說明糖基化反應可能向著更高的階段進行[24]。

注：不同字母表示同一組數據之間存在顯著性差異，P<0.05。圖1 反應時間對接枝度、褐變程度及中間產物的影響Fig.1 Effect of reaction time on grafting degree, browning degree and intermediate products

2.2 糖基化產物的功能特性

2.2.1 溶解度

蛋白質的溶解度決定了其在食品中的應用范圍。由圖2可知，糖基化反應可顯著提高SPI在酸性條件下的溶解度。在pH 5條件下，溶解度的提高最為顯著，且隨著反應時間的增加而升高，反應240 min時溶解度為35.67%，相比同條件下SPI溶解度(0.26%)，提高了136倍。這與趙城彬等[9]采用葡萄糖和麥芽糖對大豆分離蛋白進行糖基化改性的研究結果一致。Saatchi等[25]認為這可能是因為糖基化反應導致蛋白質分子結合的親水性羥基增加，減弱了蛋白質與蛋白質的相互作用，增強了蛋白質與水分子的親和力，從而改善了蛋白質的溶解度。

注：SPI為大豆分離蛋白；SPI-GOS 90～240 min為不同反應時間的糖基化大豆分離蛋白。不同字母表示同一pH值下各樣品之間存在顯著性差異，P<0.05。圖2 不同pH值下SPI及其糖基化產物的溶解度Fig.2 Solubility of SPI and glycated products at different pH values

2.2.2 乳化特性

由圖3可知，糖基化產物的乳化活性隨著反應時間的增加，呈現先上升后下降的趨勢，乳化活性最高達到20.73 m2/g，較SPI(18.26 m2/g)提高了13.52%；乳化穩定性隨反應時間的增加也有一定程度的提高，乳化穩定性最高達到17.84 min，較SPI(14.62 min)提高了22.02%，這與周洋瑩等[23]的研究結果一致。一方面，糖基化反應提高了蛋白質在水相中的溶解度，可能加速了蛋白質在油水界面的吸附速率；另一方面，糖基化反應導致蛋白質構象的變化，這也是乳化性提高的原因之一[26]。

注：不同字母表示同一組數據之間存在顯著性差異，P<0.05。圖3 反應時間對糖基化產物乳化特性的影響Fig.3 Effect of reaction time on emulsification of glycated products

2.3 糖基化產物的分子量分布

由圖4可知，SPI與GOS經糖基化反應后，各亞基條帶顏色逐漸變淺，而在濃縮膠與分離膠交界處產生了新的條帶，說明蛋白與糖發生反應生成了大分子聚合物；隨著反應時間的延長，濃縮膠與分離膠交界處的條帶逐漸變淺，說明隨著糖基化反應的進行，可能生成了更多的大分子聚合物，且由于分子量較大難以進入分離膠[27]。

注：M為標準分子質量蛋白；1-7分別為SPI、SPI-GOS(反應時間分別為90、120、150、180、210、240 min)糖基化產物。圖4 不同反應時間下糖基化產物的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE of glycated products at different reaction time

2.4 納米乳液的理化特性表征

2.4.1 平均粒徑、PDI及Zeta電位

納米乳液的平均粒徑、PDI及Zeta電位如表1所示，與單獨SPI穩定的納米乳液相比，SPI-GOS共價復合物穩定的納米乳液平均粒徑及PDI均顯著減小，Zeta電位絕對值顯著增加。說明SPI-GOS共價復合物具有更好的乳化能力，可能是共價接枝的糖鏈提高了乳滴之間的靜電斥力，從而使乳液更加穩定。

2.4.2 粒徑分布

SPI及其糖基化反應產物穩定的納米乳液粒徑分布如圖5所示。從圖5可以看出，單獨SPI穩定的納米乳液粒徑呈雙峰分布，糖基化產物穩定的納米乳液均呈單峰分布，且都偏向粒徑較小的方向，這與表1相對應。

圖5 SPI及其糖基化產物納米乳液的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of nanoemulsions stabilized by SPI and glycated products

表1 SPI及糖基化產物納米乳液的平均粒徑、PDI及Zeta電位Table 1 Average particle size, PDI and Zeta potential of nanoemulsions stabilized by SPI and glycated products

2.5 納米乳液穩定性分析

2.5.1 酸穩定性

酸處理對SPI及其糖基化產物穩定的納米乳液平均粒徑、PDI及粒徑分布的影響如圖6所示。

由圖6a可知，在酸性環境中，SPI穩定的納米乳液的平均粒徑和PDI與處理前相比(表1)明顯增大，而糖基化產物穩定的納米乳液均無明顯變化。從圖6b可以看出，經酸處理后，SPI穩定的乳液粒徑分布明顯向著粒徑較大的方向移動，而糖基化產物穩定的乳液仍呈單峰分布。

圖6 酸處理后納米乳液的平均粒徑、PDI及粒徑分布Fig.6 Average particle size, PDI and particle size distribution of acid-treated nanoemulsion

2.5.2 鹽離子穩定性

鹽離子對SPI及其糖基化產物穩定的納米乳液平均粒徑、PDI及粒徑分布的影響如圖7所示。由圖7a可知，加入鹽離子后，SPI及糖基化產物穩定的納米乳液的平均粒徑、PDI相比處理前(表1)均有不同程度的增加，但隨著反應時間的延長，糖基化產物穩定的納米乳液變化幅度逐漸減小。從圖7b可以看出，經鹽離子處理后，所有乳液的粒徑分布均呈現雙峰特征，但糖基化產物穩定的乳液粒徑分布更偏向于粒徑較小的方向。

圖7 鹽離子處理后納米乳液的平均粒徑、PDI及粒徑分布Fig.7 Average particle size, PDI and particle size distribution of salt ion-treated nanoemulsion

2.5.3 熱穩定性

熱處理對SPI及其糖基化產物穩定的納米乳液平均粒徑、PDI及粒徑分布的影響如圖8所示。如圖8a所示，80 ℃處理30 min后，所有乳液的平均粒徑及PDI相比處理前(表1)變化較小。從圖8b可以看出，經熱處理后，所有乳液的粒徑均呈雙峰分布，但糖基化產物穩定的乳液粒徑分布更偏向于粒徑較小的方向。

圖8 熱處理后納米乳液的平均粒徑、PDI及粒徑分布Fig.8 Average particle size, PDI and particle size distribution of heat-treated nanoemulsion

2.5.4 乳液外觀

酸、鹽離子及熱處理對SPI及其糖基化產物穩定的納米乳液外觀的影響如圖9所示。從圖9a、9b可以看出，SPI穩定的乳液在酸性和高離子濃度環境中放置1周后，出現了明顯的絮凝現象，而糖基化產物穩定的乳液均未出現絮凝，說明糖基化反應能有效提高大豆蛋白基納米乳液的酸穩定性和鹽離子穩定性，這可能與糖鏈的空間位阻效應有關[28]。從圖9c可以看出，經熱處理后所有樣品均未出現明顯的分層現象，只有SPI的試管底部出現了輕微的乳析現象。

圖9 酸、鹽離子及熱處理后納米乳液的外觀Fig.9 Appearance of nanoemulsion after acid, salt ions and heat treatment

3 結論

選用低聚半乳糖對大豆分離蛋白進行糖基化改性，以糖基化產物為乳化劑，制備納米乳液，研究反應時間對大豆分離蛋白及其納米乳液特性的影響。隨著反應時間的延長，接枝度逐漸增加，反應240 min，接枝度達到43.23%；褐變程度及中間產物先增加，后趨于穩定；糖基化之后大豆分離蛋白的溶解度最高提高了136倍，乳化活性最高提高了13.52%，乳化穩定性最高提高了22.02%；SDS-PAGE表明糖基化反應生成了大分子聚合物；粒徑及Zeta電位分析表明，糖基化產物穩定的納米乳液粒徑較小，具有更高的靜電斥力，且反應時間越長，糖鏈的空間位阻效應越明顯，乳液的酸、鹽離子及熱穩定性越好。因此，通過糖基化改性，提高了大豆蛋白基納米乳液的加工環境穩定性，對于生物活性物質在納米乳液體系中的包埋、傳遞具有重要意義。