貯藏方式和貯藏時間對苜蓿干草霉菌數量和種類的影響

孫雷雷，趙桂琴*，柴繼寬，劉富淵, 聶秀美，王 軍

(1.甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅大業草產品研究所有限責任公司，甘肅 酒泉 735000)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是全球最重要的多年生豆科牧草之一，具有較高的營養價值和經濟價值，其主要利用方式為初花期收獲調制干草[1-2]。苜蓿在其收獲時往往會攜帶大量真菌，這些真菌在晾曬和打捆過程中如果沒有得到有效控制，就會在貯藏期間生長繁殖，霉菌的種類也會因貯藏過程中微環境的變化而發生改變，由田間真菌過渡到儲藏真菌，致使干草發霉變質。儲藏真菌多為曲霉屬和青霉屬的產毒真菌，會對草食家畜產生毒害[3-6]。因此，研究苜蓿干草貯藏過程中真菌種類和數量的變化對苜蓿干草的安全貯藏具有重要意義。

大多數苜蓿干草都貯藏在儲草棚內，但仍有部分干草由于儲草棚不足或沒有儲草棚而在露天貯藏，尤其是在冬春季干旱少雨的西北苜蓿產區，這種現象較為普遍。露天貯藏時，有的會在草垛頂部加一層苫布，有的沒有任何防護措施，干草受外界溫濕度影響較大[7]，給真菌的生長繁殖創造了良好的環境。

國內外對各種糧食作物的真菌區系作了很多研究[8-11]，但苜蓿干草貯藏過程中的真菌方面的研究較少[12]。高彩霞[13]研究表明，打捆后第10天，苜蓿干草的優勢真菌有鐮刀菌屬、青霉屬、曲霉屬、鏈格孢霉屬、莖點霉屬和木霉屬共6個菌屬；榮磊[14]研究發現，未添加防霉劑的高水分苜蓿草捆貯藏過程中主要優勢菌屬為鏈格孢屬、木霉屬、曲霉屬和鐮刀菌屬，次優勢菌屬為明枝霉屬、莖點霉屬、變胞屬和離孺孢屬。上述試驗都是針對高水分苜蓿干草捆的霉菌進行了鑒定，但只鑒定到屬。劉香萍[15]發現高水分苜蓿干草中有青霉屬8種，曲霉屬5種，鐮刀菌屬3種。這項研究是在打捆后30天取樣進行的，后續貯藏過程中霉菌種類會發生怎樣的變化還不清楚。而實際生產中苜蓿干草捆通常要貯藏3～6個月甚至一年左右，在此期間霉菌數量和種類會隨著貯藏時間和條件的變化而發生變化，因此有必要對整個貯藏期間的霉菌變化動態進行檢測，以了解和掌握其基本規律。

傳統的真菌鑒定方法主要有PDA平皿培養法和形態鑒定法。PDA平皿培養法既可以用于真菌的數量監測(需添加氯霉素抑制細菌的生長)，也可用于對純化真菌的菌落和鏡檢形態的鑒定[16]。形態鑒定法是觀察純化的真菌菌落的顏色、紋路、生長速度等特征，并挑取菌絲在光學顯微鏡下觀察菌絲結構以及分生孢子的特征。將其與真菌檢索表中的真菌特征逐一比較，如果吻合，就可以認為是同種[17-18]。然而真菌在形態、生理生化等方面的復雜性及其隨著環境變化而變化的特性，使得這些傳統的形態學鑒定具有一定的局限性[3]。

隨著分子生物學的發展，擴增真菌的rDNA-ITS片段進行真菌菌株種屬的鑒定及系統發育研究，已經變得越來越廣泛[19]。國內有學者以形態學觀察結合ITS基因序列的方法分別從儲藏稻谷中鑒定出一株菌核曲霉(A.sclerotiorum)和一株擴展青霉(Penicilliumoxalicum)[20-21]；何瑞芳等[22]利用形態鑒定法結合分子鑒定將進境的美國苜蓿干草中攜帶的真菌鑒定到37屬52種；王慧[23]也通過此法將苜蓿黃斑病的病原菌鑒定為苜蓿枝梗邊裂殼SporonemaphacidioidesDesmaz.(無性階段)和苜蓿小光殼Leptotrochilamedicaginis(Fckl.)H.Schiiepp(有性階段)。由此可見，利用形態鑒定法結合分子鑒定，可達到快速準確的鑒定目的。

甘肅河西地區作為全國苜蓿商品草的主要產區，苜蓿干草在貯藏過程中霉菌是否會因貯藏條件和貯藏時間而發生變化，目前尚未見研究報道。因此本研究擬采用PDA平皿培養法、形態鑒定法結合rDNA-ITS序列分析法，對來自甘肅苜蓿主產區酒泉市肅州區不同貯藏方式和時間下的苜蓿干草捆進行霉菌數量和種類變化方面的研究，旨在為河西地區苜蓿干草生產和貯藏提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于酒泉市肅州區甘肅大業草產品研究所有限責任公司的場院內，地理位置為東經98°29′、北緯39°41′，海拔1 360 m，年平均降水量87.7 mm，年平均日照時數3 033.4 h，年平均氣溫7.3℃，7月份最高平均氣溫21.8℃，1月份最低平均氣溫—9.7℃。

1.2 試驗設計

采用甘肅大業草產品研究所有限責任公司2018年在上壩基地收獲的第一茬紫花苜蓿。經自然晾曬至含水量為15%后打成小方捆，草捆長為1.05 m，寬為0.45 m，高為0.35 m，打捆密度為150 kg·m-3。分露天貯藏、苫布貯藏和儲草棚貯藏3種貯藏方式。在干燥的水泥地面碼垛，堆成尖頂方形垛，或露天放置(露天貯藏)，或在頂部加上苫布(苫布貯藏)，或直接在就近的儲草棚內碼垛(儲草棚貯藏)。貯藏期從2018年6月3日到2019年5月28日，分別在貯藏的第0 d，30 d，60 d，90 d，150 d，210 d，270 d，360 d，用電動取樣器在草垛的4個面分上、中、下3層取樣，每層取4個樣混合均勻，然后裝入帶有冰袋的保溫盒中，帶回實驗室后立刻放入-20℃超低溫冰箱中，盡快測定霉菌數量。

1.3 測定內容與方法

1.3.1草樣菌懸液制備 稱干草樣10 g于盛100 mL無菌水的三角瓶中，上旋轉式搖床(200 r·min-1)充分振蕩(10 min)，取菌懸液1 mL放入9 mL無菌水的試管中，配成10-1的菌懸液，再從10-1濃度的菌懸液試管中吸1 mL加入另一支9 mL無菌水的試管中，配成10-2濃度的菌懸液。以此類推，配成10-3濃度的菌懸液。

1.3.2霉菌數量檢測 采用平板計數法測定。取10-2，10-3兩個濃度的稀釋液各0.4 mL在事先倒好的虎紅瓊脂培養基上，用涂布棒將菌液在培養基上涂抹均勻，每個稀釋度重復3次，同時作空白對照，于28℃恒溫培養箱中培養，72 h后待長出米粒大小白色菌落時進行計數。

計算公式為：N=au/v。

式中：N為1 g干草樣的菌數；a為培養皿中平均菌落數；u為稀釋倍數；v為每個培養皿中加菌懸液的體積(mL)。

1.3.3霉菌的分離和純化 將上述菌落再培養2 d，待菌落長出顏色，能區分開不同菌落時挑取菌絲至新鮮PDA培養基上分離、純化菌落，純化后的菌株于-20℃保存備用。

1.3.4霉菌的形態學觀察 參照《真菌鑒定手冊》[24]和《真菌分類學》[25]，把分離純化得到的真菌接種在PDA培養基上，25℃下培養7 d，觀察菌落的顏色、紋路、生長速度等特征，并挑取分生孢子用無菌水制作水裝片，觀察孢子的形態特征，進行真菌的初步鑒定。

1.3.5霉菌的分子生物學鑒定 將分離純化的霉菌在PDA培養基培養7 d左右后，采用真菌基因組Omega試劑盒提取各干草霉菌DNA，并利用真菌ITS通用引物對ITS1和ITS4進行擴增，反應體系為50 μL：2×Taq PCR Master Mix溶液25 μL，10 μmol·L-1上下游引物各2 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 16 μL。反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，34個循環；72℃終延伸7 min。將PCR產物經電泳檢測后送樣進行測序，測序結果與GenBank庫中的核酸序列進行同源性比對，并通過Mega 7.0軟件以鄰接法(Neighbor joining，NJ)進行菌株的親緣關系分析。

1.4 數據處理

利用Excel 2007，SPSS 19.0專業版數據分析軟件進行數據處理、方差分析及相關分析，用BLAST軟件將上傳序列與NCBI同源序列對比分析，下載與其相似度較高的菌株序列作為參考，采用Mega 7.0軟件鄰接法(Neighbor Joining，NJ)構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 苜蓿干草貯藏過程中霉菌數量的動態變化

隨著貯藏時間的延長，苜蓿干草的霉菌數量總體呈先上升后逐漸下降再明顯上升的趨勢(圖1)。在貯藏過程中，環境溫度呈先上升后下降再上升的趨勢，濕度變化與溫度類似。貯藏6個月時溫度達到最低(參照貯藏期間肅州區的氣象數據)。貯藏0 d時，3種貯藏方式下的霉菌數量無明顯差異。貯藏30 d時，露天貯藏的霉菌數量急劇上升，增加了2倍左右；苫布貯藏的也顯著增加，較一個月前增加了132.54%；儲草棚內的苜蓿干草霉菌數量也有所增加(33.25%)。隨后各處理的霉菌數量逐漸開始下降，到貯藏210 d時降至最低。這時露天貯藏的苜蓿干草霉菌數量仍然最高(7.41×103個·g-1，P<0.05)，苫布貯藏的次之，儲草棚內的霉菌數量仍然最低(3.31×103個·g-1)。隨后苜蓿干草的霉菌數量又有所上升，到270 d時，露天貯藏、苫布貯藏和儲草棚貯藏3個處理的霉菌數量均較210 d有所增加，增幅分別為10.13%，2.22%和51.85%。當貯藏時間延長至360 d，苜蓿干草的霉菌數量達到一年中的最大值，分別為：露天貯藏1.74×104個·g-1，苫布貯藏1.18×104個·g-1，儲草棚貯藏7.29×103個·g-1；3個處理間的差距進一步拉大，露天貯藏的苜蓿干草霉菌數量是儲草棚貯藏的2.39倍。另外，由圖1可知，在一年的貯藏過程中，儲草棚內的苜蓿干草霉菌數量變化幅度最小，波動曲線較為平緩(3.31×103～7.29×103個·g-1)；露天貯藏的變幅最大(4.57×103～1.74×104個·g-1)，而且其霉菌數量一直顯著高于其他兩個處理。

圖1 不同貯藏方式下苜蓿干草霉菌數量變化情況

2.2 苜蓿干草中真菌形態學觀察

分離純化的真菌在PDA培養基培養7 d后，觀察和描述菌落形態和分生孢子形態特征。部分菌落和孢子形態如圖2。

球孢白僵菌(Beauveriabassiana，圖2 A-C)在PDA培養基上生長較慢，直徑約23 mm。菌落前期絨毛狀，后期粉末狀，中間凸起厚粉末，正面白色，背面橘黃色。分生孢子球形，直徑為1.5～2.5 μm，孢子聚集時呈球形的孢子簇。

枝狀枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides，圖2 D-F)在PDA培養基上生長緩慢，直徑約21 mm。菌落稍微隆起，中央有裂紋，呈粉狀，邊緣呈白色，正面橄欖綠色，背面橄欖褐色。分生孢子單生或串生，呈近球形或卵形，大小為(2.8～7.6)μm×(2.0～3.5)μm。

細交鏈孢(Alternariaalternate，圖2 G-I)在PDA培養基上生長快，直徑約81 mm。菌落中央隆起，呈粗絨狀，正面棕褐色，背面灰褐色。分生孢子單生，呈倒梨形、倒棒狀，淡黃褐色，具橫隔1～4個，縱隔0～2個，部分含有短喙，大小為(8.1～17.2)μm×(2.4～6.5)μm。

赭曲霉(Aspergillusochraceus，圖2 J-L)在PDA培養基上生長較快，菌落直徑達68 mm，菌絲體白色，菌落淡黃色，菌落絲絨狀，有同心輪紋，無滲出液，菌落反面淡黃褐色。分生孢子梗粗糙有麻點，分生孢子單生，呈球形，直徑2.0～3.2 μm。

苜蓿莖點霉(Phomamedicaginis，圖2 M-O)在PDA培養基上生長較快，直徑約43 mm。菌落呈氈狀，中央略凸起，正面褐色，邊緣具白色絮狀，背面黑褐色。菌絲透明，有分隔，分生孢子單生或串生，大小6.0～11.7 μm×2.5～4.8 μm，常變為雙胞。

變黑輪枝菌(Gibellulopsisnigrescens，圖2 P-R)在PDA培養基上初期菌落為白色，氣生菌絲不發達，培養后期菌落表面產生淺白色粉塵，其上具有黑褐色大小不等的斑塊。分生孢子梗多為二次分枝，分生孢子橢圓形透明，單胞；可產生球形的黑色厚垣孢子，直徑為4.4～5.6 μm。

三隔鐮刀菌(Fusariumtricinctum，圖2 S-U)在PDA培養基上生長較快，直徑約65 mm，菌絲為白色，子座呈玫瑰紅色，培養基背面呈現白紅相間的同心圓；大型分生孢子呈鐮刀形，多3個隔膜，大小為29 μm×2.9 μm，少數為4～5個隔膜，大小為36 μm×3.5 μm。

圖2 菌落和分生孢子的形態特征

2.3 苜蓿干草中真菌分子生物學鑒定

對PDA培養基分離出的所有表觀形態特征略有差異的78株分離菌株進行分子生物學鑒定。基于ITS序列，采用鄰接法將所有分離菌種構建系統發育樹，對分離菌種的種屬進一步確認。

由圖3可知，河西地區貯藏的苜蓿干草共檢出真菌16屬41種。屬水平分別為鏈格孢屬(Alternariasp)、枝孢屬(Cladosporiumsp)、鐮刀菌屬(Fusariumsp)、輪枝孢屬(Gibellulopsissp)、毛霉屬(Mucorsp)、莖點霉屬(Phomasp)、根霉屬(Rhizopussp)、籃狀菌屬(Talaromycessp)、白僵菌屬(Beauveriasp)、漆斑菌屬(Myrotheciumsp)、青霉屬(Penicilliumsp)、曲霉屬(Aspergillussp)、織球殼屬(Plectosphaerellasp)、枝頂孢屬(Acremoniumsp)、帚枝霉屬(Sarocladiumsp)和Alfaria屬；其中曲霉屬真菌種類最多，為10種，鐮刀菌屬和青霉屬次之，分別為5種和4種。

圖3 苜蓿干草貯藏過程中真菌的系統發育樹

2.4 不同貯藏方式下苜蓿干草真菌種類的變化

露天貯藏的苜蓿干草在為期一年的貯藏過程中共檢出15屬35種真菌(表1)，苫布貯藏的苜蓿干草在貯藏期內共檢出13屬33種真菌(表2)，儲草棚貯藏的苜蓿干草共檢出13屬33種真菌(表3)。3種貯藏方式下，每個采樣時間點均能檢出的霉菌有細交鏈孢(Alternariaalternata)和枝狀枝孢菌(Cladosporiumcladosporioides)兩種，8個時間點中檢出5次以上的真菌有產黃青霉(Penicilliμmchrysogenum)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)。細極鏈格孢(Alternariatenuissima)和禾谷漆斑菌(Myrotheciumgramineum)只在貯藏的前期檢出，150 d后再未檢出。

表1 苜蓿干草露天貯藏過程中真菌種類的變化

表2 苜蓿干草苫布貯藏過程中真菌的種類變化

甜菜莖點霉(phomabetae)、疣孢漆斑菌(Myrotheciumverrucaria)、凍土毛霉(Mucorhiemalis)、易脆毛霉(Mucorfragilis)、赤曲霉(Aspergillusruber)和緊密帚枝霉(Sarocladiumstrictum)僅在露天貯藏的苜蓿干草中檢出。雪曲霉(Aspergillusniveoglaucus)僅在苫布貯藏的處理中檢出。斯氏青霉(Penicilliμmsteckii)、Acremoniumfusidioides和交互枝頂孢(Acremoniumalternatum)僅在儲草棚內的苜蓿干草中檢出。雜色曲霉(Aspergillusversicolor)在露天未檢出，在儲草棚和苫布貯藏條件下各檢出一次。露濕漆斑菌(Myrotheciumroridum)在苫布貯藏中未檢出，在露天和儲草棚貯藏的干草中各檢出1次。Alfariaterrestris在儲草棚貯藏中未檢出，在露天和苫布貯藏中各檢出一次。

由表1、表2和表3可知，苜蓿干草的帶菌種類數都隨貯藏時間的延長呈先增加后降低再增加的趨勢，但不同貯藏方式下具體的變化各有特點。露天貯藏方式下，苜蓿干草的霉菌種類在貯藏60 d時即達到峰值(22種)，90 d時為21種，隨后下降至17種，到360 d時增至19種。苫布貯藏方式下，苜蓿干草的霉菌種類在貯藏90 d時達到最高(20種)，隨后急劇下降至13種，隨后在貯藏270 d時增至17種，直到貯藏360 d再未增加。儲草棚內的苜蓿干草霉菌種類在貯藏30 d即達到較高值(16種)，但隨后幾乎沒有變化(僅在60 d時減少1種)，直到儲藏360 d時增加了1種，和其他兩種貯藏方式相比波動最小。

表3 苜蓿干草在儲草棚貯藏過程中真菌的種類變化

3 討論

3.1 貯藏方式和貯藏時間對苜蓿干草霉菌數量的影響

貯藏方式和貯藏時間對苜蓿干草的霉菌數量有顯著影響。隨著貯藏時間的延長，苜蓿干草的霉菌數量總體呈增加的趨勢。這是因為在貯藏初期，苜蓿干草攜帶的真菌多為田間真菌，且數量不多，隨著貯藏時間的延長，真菌開始快速繁殖，達到一個小高峰；之后由于環境的惡化(冬季低溫)，真菌的數量又開始降低；隨著春季冰雪消融，氣溫上升，貯藏環境適宜真菌的生長繁殖，因此真菌數量又快速上升。史瑩華等[26]也發現，貯藏時間越長，苜蓿干草捆中霉菌數量越多。含水量較高(20%)的苜蓿干草貯藏半個月后霉菌數量最高可達9.17×104個·g-1[27]。苜蓿草顆粒中如果不添加防霉劑，7天后霉菌數量可達9.60×104個·g-1[28]。露天貯藏方式下的干草真菌數量較同期苫布和儲草棚貯藏的真菌數量顯著增多，儲草棚內的苜蓿干草霉菌數量變幅最小。露天貯藏受外界環境的影響最大，因此在一年的貯藏期內霉菌數量變化劇烈。李改英等[29]在進行不同淋雨模式對苜蓿霉菌生長規律影響的研究時發現，未淋雨的對照組苜蓿草霉菌數量變化不大，而間隔淋雨的苜蓿草(相當于露天貯藏)在第3天霉菌就開始大量生長。

3.2 貯藏方式和貯藏時間對苜蓿干草霉菌種類的影響

在真菌種類的鑒定方面，目前通常采用的是形態學和分子生物學技術相結合的方法[19]。將分離純化的菌株接種到PDA培養基上25℃黑暗培養3～5天，觀察菌落形態、生長速度、顏色、大小等，結合菌絲的形態和分生孢子的有無及其特點進行初步鑒定[17-18]，然后用真菌的通用型引物ITS[30]進行擴增測序，精準鑒定。本研究用形態特征結合分子鑒定發現，在為期一年的貯藏期內，從苜蓿干草中共檢測出16屬41種真菌，其中曲霉屬真菌10種，鐮刀菌屬5種、青霉屬4種。在貯藏初期，3種貯藏方式下的苜蓿干草都檢出了鏈格孢屬、枝孢屬、鐮刀菌屬的真菌，這些都屬于田間真菌，對水活度要求相對較高。貯藏中后期，隨著苜蓿干草含水量進一步降低，田間真菌的數量開始下降，而對水活度要求相對寬泛的過渡真菌開始增多。3種貯藏方式下的苜蓿干草中曲霉屬、青霉屬的真菌成為優勢菌，檢出率都較高，這些都屬于儲藏真菌，對水活度要求相對較低[6]。

苜蓿干草的帶菌種類數都隨貯藏時間的延長呈先增加后降低再增加的趨勢。儲草棚內的苜蓿干草帶菌種類變化最小，露天貯藏的苜蓿干草帶菌種類最多、波動最大，共檢出15屬35種，而苫布貯藏和草棚貯藏的都是13屬。鏈格孢屬的細交鏈孢和枝孢屬的枝狀枝孢菌在3種貯藏方式下的各貯藏時期都有檢出，體現了其優勢屬的地位。曲霉屬在整個貯藏過程中一共檢出了10個種，也為優勢屬。另外，有6種真菌僅在露天貯藏的苜蓿干草中檢出，而苫布貯藏和儲草棚貯藏下只有1種和3種，進一步體現出露天貯藏的苜蓿干草不僅霉菌數量最多，獨有的種類也最多。

檢出的苜蓿莖點霉和鏈格孢屬的真菌都屬于常見的植物病原真菌，而匍枝根霉、黑曲霉、青霉屬的幾種真菌都屬于常見的腐生性真菌。在貯藏前期，3種貯藏方式下的苜蓿干草中都檢出了變黑輪枝菌，前人曾從發白矮化的苜蓿植株上分離得到這種菌，該菌可引起苜蓿出現葉片發白、節間縮短、植株矮化等癥狀[31]。貯藏中后期，在露天貯藏方式下檢出了2種毛霉屬真菌：凍土毛霉和易脆毛霉。這兩種真菌在苫布和草棚貯藏下都未檢出，可能是因為苫布和草棚降低了雨雪對苜蓿干草水分含量變化的影響。劉香萍[32]在對不同含水量的苜蓿干草進行真菌種類研究時發現，同一取樣時期，高水分苜蓿草捆檢測出了毛霉，而低水分苜蓿草捆未檢出。在整個貯藏過程中，3種貯藏方式下都檢出了白僵菌屬的蟲生真菌，且在露天貯藏的苜蓿干草中檢出率更高，可能是露天貯藏的苜蓿干草給昆蟲提供了庇護所。此外，本研究還檢出了漆斑菌屬的3種真菌和織球殼屬的1種真菌，屬首次報道，因為有研究認為其未在中國種植的苜蓿草上分布[22]。

4 結論

貯藏方式和貯藏時間對苜蓿干草的霉菌數量有顯著影響。隨著貯藏時間的延長，苜蓿干草的霉菌數量總體呈增加趨勢，露天貯藏的霉菌數量最多，苫布貯藏的次之，儲草棚內的苜蓿干草霉菌數量最低、變化最小。

貯藏方式和貯藏時間對苜蓿干草霉菌種類也有顯著影響。隨著貯藏時間的延長，苜蓿干草的霉菌種類呈先增后降再增的趨勢，儲草棚貯藏的苜蓿干草霉菌種類變化最小。共檢出16屬41種真菌，其中露天貯藏的苜蓿干草檢出15屬35種，苫布貯藏和儲草棚貯藏均檢出13屬33種。優勢屬為鏈格孢屬、枝孢屬和曲霉屬。

在甘肅河西地區，苜蓿干草宜采用儲草棚貯藏，貯藏期不宜超過7個月。