青海湖高寒草地土壤理化性質及微生物群落特征對模擬降水的響應

楊 陽，章 妮，蔣莉莉，陳克龍

(1.青海師范大學生命科學學院，青海 西寧 810008；2.青海省自然地理與環境過程重點實驗室，青海 西寧 810008)

全球氣候變化對生態系統產生了深刻影響，是當今人類社會面臨最為嚴重的環境問題之一[1]。降水改變是氣候變化的重要表現，政府間氣候變化專門委員會(The Intergovernmental Panel on Climate Change，IPCC)第5次報告指出1981～2010年期間全球破紀錄降水事件數量比自然變化情景的預測量增加12%，且氣候變化引發的區域極端降水事件對土地覆被生長產生威脅[2]。青藏高原已成為全球變暖背景下環境變化不確定性最大的地區[3]，其氣候變化的基本特征是暖濕化，近期降水量總體呈現增加趨勢，每10年增加約2.2%，預估近期(現今-2050年)和遠期(2051-2100年)年降水量分別比當前基準期增加10.4%～11.0%和14.2%～21.4%[4]。在全球持續增暖背景下，髙原降水量伴隨著髙原加速增溫而迅速增加[5]，將直接影響高原生態系統碳氮物質循環過程。

草地生態系統的物質循環過程受溫度和降水的影響劇烈[6]，草地生態系統對全球氣候變化的響應主要表現為生態系統生產力、植物群落結構和土壤生化過程等發生改變[7]。其中降水格局的改變對生態系統的影響主要是土壤水分隨著降水的改變而改變，從而加速或減緩土壤中各種營養物質的溶解，改變土壤中有機碳含量[8]，進而改變整個土壤環境。土壤環境因子是影響土壤微生物的重要因素[9]，同時土壤微生物參與了土壤碳氮循環，反作用于土壤環境過程[10]。土壤微生物作為土壤物質循環和生化過程的主要參與者與調節者，是陸地生態系統中最活躍的組分之一，能敏感地預警土壤生態系統發生的微小變化[11]，它們參與了土壤發生、發展、發育的全過程，在維持生態系統整體服務功能方面發揮著重要作用[12]。此外，土壤微生物作為穩定生態系統，監測土壤質量變化的敏感指標，其多樣性研究在評價生態系統、維護生態平衡中也發揮了巨大作用[13]。土壤微生物對降水變化的響應能敏感地反映土壤生態系統在不同降水情況下的變化程度與健康狀況[14]，目前許多學者在不同生態系統類型都進行了土壤微生物群落特征對不同降水梯度的響應研究。在半干旱農田[15]進行的研究發現土壤微生物群落對降水變化的響應規律并不一致；干旱半干旱草原[16]進行的研究發現干旱或極端降水對土壤細菌種群多樣性及豐度影響顯著；在溫帶草原[17]及中高緯度林地[18]進行的研究表明降水變化對土壤微生物相對豐度影響顯著而并未對其多樣性產生顯著影響。綜上，不同生態系統土壤微生物群落特征對不同降水變化的響應并不相同。青藏高原因其獨特的生態地理特征和敏感的氣候指示作用而具有更為重要的研究意義[19]。青藏高原高寒草地是草地生態系統中極易受氣候變化影響的敏感生態帶之一，過去幾十年其南部和北部地區降水顯著增加、中部地區降水減少[20]，探究青藏高原高寒草地生態系統對氣候變化的響應和反饋機理成為目前研究的熱門領域[21]。

青海湖流域位于青藏高原東北部，是青藏高原氣候變化的重要指示區域，對于氣候變化的響應十分敏感，探討青海湖流域高寒草地生態系統土壤理化因子及微生物群落特征對降水變化的響應，對于研究氣候變化對青藏高原高寒草地生態系統的影響具有重要意義。在青海湖鳥島高寒草地生態系統建立模擬降水梯度原位控制試驗樣地，分析不同降水條件下土壤理化性狀及微生物群落特征的變化情況，研究結果可為高寒草地生態系統對氣候變化的響應研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

青海湖鳥島(36°57′～37°04′ N，99°44′～99°54′ E)位于青海湖國家級自然保護區西部，海拔3 194～3 226 m，總面積約600 km2，地勢西北高而東南低；屬于高原半干旱高寒氣候區，具有明顯的大陸性氣候特征，干旱、少雨、多風，太陽輻射強烈，氣溫日較差大，年均氣溫為—0.7℃，最熱月7月，平均氣溫為12.4℃，最冷月1月，平均氣溫為—12.7℃，極端最高氣溫28℃，極端最低氣溫—31℃；年均降水量為322.7 mm[22]，主要集中于6—8月份，年潛在蒸發量約為降水量的3.8倍，年大風日數在48 d以上，最多達78 d，年日照時數3 040 h。該地區植被類型主要是北溫帶草地植物，種類以禾本科(Gramineae)為主，其次為菊科(Compositae)和豆科(Leguminosae)，植物生長期只有90～100 d；土壤類型為干潤砂質新成土，土層較薄，石礫含量較高。

1.2 樣地與樣品采集

1.2.1試驗設計 青海湖鳥島模擬降水樣地選擇在蛋島東北部地形開闊、植物生長均勻且面積較大的低矮草地上，樣地選址遠離遷徙候鳥集中繁殖地，采樣完畢均會對采樣點進行回填處理，試驗活動并未對鳥類棲息地產生影響，樣地面積為40 m×40 m，共9塊3 m×3 m的試驗小區，完全隨機分布。每塊子樣地間有寬為3 m緩沖帶，樣地四周為5 m的緩沖帶，每個試驗小區四周有20 cm的防徑流帶，用雪花鐵皮插入地下25 cm以防止地表徑流。在樣方內設1 m×1 m固定樣方觀測區，南部為采樣區和隨機樣方觀測區。樣地于2018年6月投入使用，降雨水平設計為減少50%降雨量(NJ)、自然對照(NCK)、增加50%降雨量(NZ)3個降水梯度處理。增減雨裝置(圖1)利用傾斜設置的雨水導流槽收集雨水與匯流槽，再收集在臥箱中，經過噴淋裝置進行噴淋作業，其中雨水導流槽、匯流槽、臥箱、噴淋裝置的高度依次降低，即利用雨水自身的重力達到雨水收集和噴淋的效果，實現自動導水。每組噴淋管等間距設置有噴淋孔，雨水導流槽的底部距離地面1.5 m，匯流槽的底部距離地面1.4 m，匯流槽的側面高度為20 cm，防止雨水流入時發生外濺。臥箱的頂部距離地面1.2 m，臥箱高0.6 m，噴淋裝置放置于高度為10 cm的支架上，10個雨水導流槽每個寬10 cm，間距為20 cm，槽體第一擋板的第一上板和第一下板長度均為10 cm，雨水導流槽在地面上的投影寬度為20 cm，投影面積占該裝置頂部總面積的52.6%[23]。模擬降水控制試驗時間為2018年6月—2019年8月，試驗期間降雨量為386 mm。

圖1 鳥島高寒草地增減雨裝置示意圖

1.2.2樣品采集 2019年8月中旬生長盛期在每個樣點采用五點取樣法采集0～10 cm表層土壤(樣地土層深度最大僅為10 cm，以下均為石礫)，混勻并過篩，一部分裝入無菌EP管中由液氮罐帶回寄往北京組學生物公司進行高通量測序，另一部分用于土壤碳氮含量測定。土壤樣品采集的同時，在取樣點附近對1 m×1 m樣方采用四分法齊地面剪取地上生物量裝置于信封帶回實驗室烘干后稱重并計算單位面積質量；將采集的土壤過篩后清洗地下生物量，同樣烘干、稱重并計算單位面積質量。

1.3 試驗方法

1.3.2土壤微生物分析 采用土壤微生物總DNA提取試劑盒(PowerSoil DNA Isolation Kit)對DNA進行抽提，試劑盒來源于Mio-bio公司。瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量(OD260/OD280=1.7963)，于—80℃保存合格DNA，用于后續的PCR擴增過程。提取樣品的總基因組DNA后，選擇細菌的兩個高變區(V3+V4區)以及真菌的ITS區(ITS1，ITS2)通過保守區設計引物進行PCR擴增，再對V3區、V4區以及ITS區進行高通量測序分析。對細菌16S RNA的V3+V4區以及真菌的ITS區域進行擴增，正向引物分別為CCTAYGGGRBGCASCAG和CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA，反向引物分別為GGACTACNNGGGTATCTAAT和GCTGCGTTCTTCATCGATGC[26-27]。PCR擴增產物經純化、定量、均一化形成測序文庫，質檢后使用MetaVxTM文庫構建試劑盒(Inc.，South Plainfield，NJ，USA)構建測序文庫進行文庫測序，使用Agilent 2100 生物分析儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)檢測文庫質量，基于Illumina MiSeq平臺進行測序，MiSeq自帶的MiSeq Control Software(MCS)讀取序列信息。

1.4 數據處理

采用FLASH v1.2.7軟件[28]進行PE reads拼接得到原始Tags數據(Raw tags)，QIIME(Version 1.9.1)[29]在序列的相似性高于97%的程度上分別基于Silva(細菌)[30]和UNITE(真菌)[31]聚類得到OTU數目以及豐度柱狀圖，同時生成不同分類水平的物種豐度表。利用R語言工具繪制群落結構圖并進行Heatmap聚類分析，采用Mothur軟件[32]評估α-多樣性，Qiime軟件進行β-多樣性分析。SPSS 21.0對不同處理下不同類型數據作進行方差齊性檢驗和正態性檢驗。對土壤樣品進行高通量測序，測序結果經過處理后得到有效測序數據，在序列相似度97%水平下劃分OTU。土壤微生物多樣性指數中，土壤細菌及真菌的豐富度用Ace指數及Chao1指數表示，多樣性指數由Simpson指數及Shannon指數表示。土壤理化因子與微生物群落多樣性相關分析采用Canoco 5軟件進行。

2 結果與分析

2.1 模擬降水對土壤理化因子及生物量的影響

NZ處理降低了土壤溫度(P<0.05)，提高了土壤含水量，NJ處理降低了土壤含水量但對土壤溫度并沒有顯著影響；不同降水處理對地上生物量、地下生物量也產生影響，其中NZ處理增加了地上生物量和地下生物量(P<0.05)，而NJ處理條件下地上生物量、地下生物量均呈減少趨勢(P<0.05)。

圖2 不同降水處理下土壤理化因子及生物量

2.2 模擬降水對土壤微生物Alpha多樣性的影響

本試驗共得到1 691個細菌OTU以及70個真菌OTU。土壤細菌群落在不同降水處理下的OTU個數分別為NCK 1 689個、NZ 1 688個、NJ 1 690個，土壤真菌群落不同降水處理下OTU個數分別為NCK 64個、NZ 66個、NJ 69個。各樣品的稀釋曲線已經趨于平緩，即樣本的OTU的覆蓋度已基本飽和，表明測序深度已經包含樣品中所有物種，測序數據量達到反應樣品中物種多樣性的需求(圖3)。

圖3 不同處理下土壤細菌(A)及真菌(B)稀釋曲線

鳥島高寒草地土壤微生物群落多樣性對模擬降水變化的響應較明顯，其中細菌群落的Ace指數、Chao1指數和Shannon指數在NZ，NJ處理下均增大，Simpson指數在NZ，NJ處理下均降低，表明NJ，NZ處理均增加了細菌群落的豐富度但降低了細菌群落的多樣性。真菌群落在NJ處理下Ace指數、Chao1指數及Shannon指數增加，Simpson指數降低；NZ處理下Ace指數、Chao1指數及Shannon指數均降低，Simpson指數增加，表明NJ處理增加真菌群落的豐富度但降低了真菌群落的多樣性，NZ處理增加了真菌群落的多樣性但降低了真菌群落的豐富度。整體而言，NJ，NZ兩種降水處理對細菌群落多樣性和豐富度的影響相同但對真菌群落的影響相反，真菌群落多樣性變化更加顯著(表1)。

表1 鳥島土壤細菌、真菌群落多樣性指數

2.3 降水變化對土壤微生物群落結構的影響

土壤微生物群落相對豐度圖(圖4)顯示，土壤細菌門水平上優勢菌群(圖4A)為變形菌門(Proteobacteria，52.54%)、酸桿菌門(Acidobacteria，16.96%)和放線菌門(Actinobacteria，9.50%)，相對豐度之和為79%(圖4A)；真菌目水平優勢菌群為格孢菌目(Pleosporales，39.23%)、煤炱目(Capnodiales，11.71%)、未知菌群(Unknown，9.59%)，總相對豐度達到了60.53%(圖4B)。

圖4 鳥島土壤細菌(A)及真菌(B)群落物種相對豐度

與NCK相比，降水處理NZ,NJ均增加了細菌群落的相對豐度，但變化幅度并不顯著。相對而言，NJ處理下增加幅度大于NZ處理，擬桿菌門(Bacteroidetes)變化幅度最大(在NJ下增加71.37%)。與NCK相比，NZ處理下酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、己科河菌門(Rokubacteria)、藍藻門(Cyanobacteria)及匿桿菌門(Latescibacteria)相對豐度均增加；NJ處理下的變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、己科河菌門(Rokubacteria)、匿桿菌門(Latescibacteria)相對豐度增加。兩種降水變化下，細菌群落的豐度變化既有相似性也有差異性。其中相似性體現在擬桿菌門(Bacteroidetes)、己科河菌門(Rokubacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和匿桿菌門(Latescibacteria)在NJ，NZ兩種處理條件下相對豐度均增加；差異性體現在NZ處理下真菌群落酸桿菌門(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和藍藻門(Cyanobacteria)豐度增加較明顯，而在NJ處理下變形菌門(Proteobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)豐度增加較明顯。

真菌群落在NJ處理下整體相對豐度升高，且主要菌群相對豐度變化顯著(P<0.05)，肉座菌目(Hypocreales)變化幅度最大(NJ下增加62.95%)，其余菌群雞油菌目(Cantharellales)、黑粉菌目(Ustilaginales)、糞殼菌目(Sordariales)及未知菌群等的相對豐度均增加；NZ處理下真菌群落整體相對豐度有所下降，雖然腔菌目(Pleosporales)、煤炱目(Capnodiales)、傘菌目(Agaricales)、雞油菌目(Cantharellales)、Coniochaetales、黑粉菌目(Ustilaginales)、Myrmecridiales，Melanosporales、糞殼菌目(Sordariales)相對豐度均增加，但其余菌群相對豐度降低，整體相對豐度處于降低趨勢。土壤微生物群落整體相對豐度變化表明，土壤真菌群落結構組成對降水變化的響應更加顯著。

2.4 土壤微生物Beta多樣性

ANOSIM分析結果(test statistic=0.644，P=0.016)表明組間差異較大，組內差異較小，分組效果較好，且各樣本分組之間的差異較顯著。對不同降水處理下樣品進行差異性分析(圖5)得出：土壤細菌(圖5A)及真菌(圖5B)的不同樣品間均存在差異，土壤細菌(圖5A)表現為相同樣地不同采樣點的樣品差異較大，表明細菌樣品同一試驗處理的不同重復之間差異性較大。相同樣地不同采樣點間真菌差異較小，表明降水差異對鳥島草地土壤真菌群落影響較大。因此，不同降水條件與相同降水條件下不同取樣點對青海湖鳥島土壤微生物群落多樣性均具有較大影響，而土壤細菌群落對降水變化響應不顯著可能是試驗周期過短或者采樣點太少、采樣隨機性太大造成的。

圖5 土壤細菌(A)及真菌(B)差異性分析熱圖

2.5 土壤微生物群落與理化因子相關分析

圖6 土壤微生物多樣性指數與土壤理化因子RDA分析

圖7 土壤細菌(A)及真菌(B)群落與土壤理化因子RDA分析

3 討論

3.1 降水變化對土壤理化因子及生物量的影響

降水是影響土壤溫度及水分含量的重要因子，不同干濕狀況及不同植被類型下土壤對降水變化的響應也不盡相同[33]。本研究發現增雨處理降低了土壤溫度，提高了土壤含水量，減雨處理降低了土壤含水量，即土壤濕度與降水量呈正相關關系[34]。降水量變化通過影響土壤含水量，進而影響土壤的碳氮含量[35]，土壤碳氮含量反映了土壤肥力與生態系統的循環能力，對氣候變化與環境變化敏感，是土壤質量變化的重要指標[36]。大多學者的研究表明土壤碳氮含量受土壤含水量影響顯著，何容等[37]通過研究武夷山植被帶土壤碳氮含量沿海拔梯度的變化，發現隨著海拔的升高，年均土壤濕度逐漸增大，碳氮含量增高，因此認為土壤碳氮含量與土壤濕度密切相關，本研究通過降水控制試驗模擬不同降水梯度下土壤理化因子的變化情況，得出與上述研究相似的結論，即土壤碳氮含量與土壤濕度密切相關。Hui等[38]通過對內蒙古半干旱草原長期研究發現，極端缺雨可以增加土壤氮含量，但對碳含量的影響不顯著，而本研究結果則表明減雨降低了土壤全碳全氮及銨態氮含量，增加了硝態氮含量，與上述學者研究結果略有差異，原因可能是減雨處理下由于草地土壤水分減少，土壤氧氣含量相應增大，有利于硝化作用進行[39]。還有學者研究發現降水變化對土壤碳氮含量影響并不顯著，如許華等[39]在騰格里沙漠做模擬降水控制試驗研究發現降水量的變化對土壤碳氮含量的影響并不顯著，Zhang等[41]在黃土高原荒漠草原設置的模擬降水控制試驗研究結果得到與許華等人相同的結論，與本研究結果中降水改變對土壤全氮全碳含量影響并不顯著的結論相似。降水模式的變化還引起植物營養環境的改變，從而導致生物量的變化[42]，本研究結果表明增雨處理條件下地上生物量與地下生物量均高于自然狀態，而減雨處理下生物量低于自然狀態，在對內蒙古典型草原群落[42]地上生物量長期動態監測數據分析結果表明群落生物量與生長季降水量、降水集中度呈顯著的正相關關系，還有學者在黃土高原4種植被帶[43]通過測定草本群落物種多樣性和生物量并分析它們對降水變化的響應規律，得出地下/地上生物量與年均降水量之間存在顯著正相關關系的結論，均與本研究結果一致，即植被群落生物量與降水量和降水集中程度均呈顯著正相關關系。

3.2 降水變化對土壤微生物群落的影響

長期的降水變化對土壤微生物群落多樣性的影響主要通過引起土壤理化性質、地上植被的生長狀態和多樣性發生改變，促使微生物生長環境發生變化，進而影響到微生物種群結構的穩定性[44]，土壤水分變化引起的其他土壤理化因子的改變導致土壤中氧化還原條件發生變化，從而影響土壤微生物群落結構和功能[45]。由于土壤中微生物受環境影響，本身對當地氣候環境產生了一定的適應能力[46]。降水變化是土壤微生物群落的重要影響因子，降水增多導致的土壤水分含量較高對土壤微生物多樣性具有明顯抑制作用[47]，且如果土壤水分處于近飽和狀態，即使少量的降水也會抑制土壤微生物多樣性[48]。本研究發現在NZ(增多降水50%)或NJ(減少降水50%)處理條件下，細菌真菌群落多樣性均降低，與土壤水分抑制土壤微生物多樣性的結論一致。但本研究結果表明土壤細菌群落多樣性變化對降水梯度的響應并不顯著，部分學者在通過相似試驗得出與本研究相同的結論，Cruz-Martínez等[49]在進行了連續5年的降水試驗后發現，降水增加未對土壤細菌群落產生顯著影響；Banu等[50]在澳大利亞新南威爾士州草地也發現了同樣結論，即降雨量對土壤微生物多樣性并沒有顯著影響。在土壤微生物群落結構變化方面，本研究發現相同降水變化下土壤真菌群落的群落結構組成變化比細菌群落更加顯著。岳淏偉[51]通過在青藏高原海北站進行連續兩年的降水變化控制試驗得出，降水的增加和減少，對不同的菌類有不同的影響，整體來說，真菌門水平的變化情況較為顯著，而細菌門水平對降水變化的響應并不明顯，與本研究結果相近。王譽陶等[52]發現不同水分處理對土壤中細菌多樣性的影響不大，但增雨和減雨處理都會增大真菌均勻度指數和豐富度指數，得出真菌對降水處理的響應與細菌相比更為敏感的結論，進一步驗證了本研究的結果，造成不同菌群對降水變化響應差異的原因，可能是細菌和真菌在不同土壤環境中生理差異，也可能是土壤細菌和真菌群落對不同土壤水分下土壤理化因素(如土壤碳氮含量、養分有效性)的不同響應[52]。而Cruz-Martínez[49]和Banu等[50]的研究表明降水的變化并未對土壤微生物群落結構產生顯著影響，與本研究結果有差異，可能與土壤特征變化的大小有關，也可能是因為不同研究區域土壤微生物對環境變化的適應性并不相同[54]。

4 結論