棉花內生細菌YUPP-10及其分泌蛋白CGTase對棉花枯萎病的防治作用及機理

周京龍，馮自力，魏鋒，趙麗紅，張亞林，周燚，馮鴻杰，朱荷琴

棉花內生細菌YUPP-10及其分泌蛋白CGTase對棉花枯萎病的防治作用及機理

1長江大學農學院，湖北荊州 434025；2中國農業科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽 455000

【】棉花枯萎病（Fusarium wilt）是棉花種植中較為嚴重的土傳病害之一，主要采用化學方法進行防治，但對環境和人畜安全造成一定影響。生物防治因其專一性強、安全性高的特點，成為防治棉花枯萎病的重要途徑。本研究旨在獲得一株高效拮抗細菌，并明確其防治機理，為棉花枯萎病生物防治提供技術支持。前期獲得一株能夠破壞-1，4糖苷鍵的棉花內生蠟狀芽孢桿菌（）YUPP-10，通過平板對峙培養、共培養法和懸滴法分別測試其對棉花枯萎病菌（尖鐮孢，）菌絲生長、產孢和孢子萌發的影響；利用YUPP-10菌液浸種處理，研究其對棉花生物量的影響；以尖鐮孢菌土為基質種植棉花，生長1周后，用LB液體培養基培養的YUPP-10制成不同濃度（分別為1×108、1×107和1×106cfu/mL）的生防菌劑灌根處理棉苗，于溫室中進行棉花枯萎病的防治效果研究；通過Fosmid文庫篩選到了YUPP-10關鍵抑菌物質為環糊精糖基轉移酶（CGTase，EC 2.4.1.19），研究其對尖鐮孢菌絲生長、產孢和孢子萌發的影響；利用擬南芥花序侵染法將其轉化擬南芥，獲得能夠穩定表達的轉基因株系，研究轉基因擬南芥對枯萎病的抗性，以及在病原脅迫下部分防御基因的轉錄。YUPP-10菌株發酵液對尖鐮孢菌絲生長、產孢和孢子萌發具有顯著的抑制作用，隨著發酵液濃度的升高，對尖鐮孢產孢量和孢子萌發的抑制率越高，最高抑制率分別為98.41%和51.65%。低濃度的YUPP-10菌液能促進棉花種子發芽、出苗和地上部分的生長。YUPP-10發酵液灌根處理后，棉苗的病情指數和病株率顯著降低，其中，1×107cfu/mL的YUPP-10發酵液對棉花枯萎病的防治效果最高，達到45.11%。YUPP-10菌株的關鍵抑菌物質CGTase能夠水解羧甲基纖維素和葡甘聚糖，表明其具有破壞-1,4糖苷鍵的能力，進而檢測了其對尖鐮孢的抑制效果，結果表明CGTase對尖鐮孢的菌絲生長、產孢和孢子萌發具有顯著的抑制作用，對產孢和孢子萌發的最高抑制率分別達到62.63%和30.83%。轉的擬南芥提高了對枯萎病的抗性，過表達的擬南芥在病原脅迫下部分防御基因的轉錄水平升高。蠟狀芽孢桿菌YUPP-10菌株能抑制尖鐮孢的生長、促進棉花部分生物量指標的增長并控制枯萎病的危害，CGTase能夠抑制尖鐮孢的生長，轉擬南芥對枯萎病的抗性增強。

蠟狀芽孢桿菌；棉花枯萎病；尖鐮孢萎蔫專化型病菌；環糊精糖基轉移酶；防治效果

0 引言

【研究意義】纖維是全球重要的經濟產品，棉花纖維占據了纖維產量的35%，中國作為世界纖維產量及消費大國，棉花產業對國民經濟具有重要意義[1]。然而，在棉花的整個生育期受到各種生物和非生物脅迫。由尖鐮孢萎蔫專化型病菌（f. sp.）引起的土傳維管束枯萎病（Fusarium wilt）能造成棉花毀滅性損失。棉花枯萎病的常規防控措施包括選育抗性品種、耕作管理以及化學殺真菌劑的應用。但是，棉花新品種的培育較為費時，而且由于病原體的變異性和適應寄主抗性的能力，常會導致喪失抗性[2]。化學藥劑重復使用，會使病原體產生抗藥性，且對某些有益生物產生負面影響[3]。應用有益微生物作為生物防治劑是控制植物病害的重要方法，也是減少化學農藥影響環境的有效手段。【前人研究進展】生物防治被認為是控制植物病害的一種可持續的防治方法。關于棉花枯萎病的生物防治，主要通過真菌和細菌對病原菌的拮抗作用或（和）誘導植株產生系統抗病性實現。張海軍等[4]研究表明，拮抗真菌綠色木霉（）GY20能夠使尖鐮孢原生質體濃縮和菌絲斷裂，盆栽試驗證明GY20對棉花枯萎病具有防治效果。內生細菌作為拮抗菌的重要來源，在植物病害的防治上已有諸多成功案例，其中，芽孢桿菌是研究最多的拮抗細菌，如枯草芽孢桿菌（）[5]、解淀粉芽孢桿菌（）[6]和蠟狀芽孢桿菌（）[7]等。關于拮抗細菌防治棉花枯萎病也有較多報道，從健康海島棉植株分離的短小芽孢桿菌（）KX-33能夠促進棉苗生長，抑制枯萎病菌，可作為種衣劑防治棉花枯萎病[8-9]；解淀粉芽孢桿菌SN06能夠顯著降低棉花枯萎病的病情指數，防治效果高達65.2%；壯觀鏈霉菌（）SC11可在棉花根際土壤和根部長期定殖，在大田中對棉花枯萎病的防治效果達到40%左右[10]。蠟狀芽孢桿菌作為生防菌可用于棉花立枯病、茄子黃萎病、鷹嘴豆灰霉病和番茄灰霉病等的防治[11-14]，但用于棉花枯萎病防治的研究較少。【本研究切入點】前期，利用葡甘聚糖作為培養基定向篩選出一株降解-1,4糖苷鍵的棉花內生蠟狀芽孢桿菌YUPP-10，其對棉花黃萎病具有較好的防治效果[15]，鑒于YUPP-10菌株具有降解-1,4糖苷鍵的能力，推測其對真菌病害具有廣譜防治效果。【擬解決的關鍵問題】研究YUPP-10發酵產物對尖鐮孢菌絲生長、產孢量、孢子萌發以及浸種處理對棉花生物量的影響，制成的生防菌劑對棉花枯萎病的防治效果。進一步鑒定其關鍵抑菌物質環糊精糖基轉移酶（cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase，EC 2.4.1.19）對尖鐮孢的抑制作用，為棉花枯萎病的生物防治提供新資源。

1 材料與方法

試驗于2016—2019年在中國農業科學院棉花研究所完成。

1.1 供試菌株及植物材料

棉花枯萎病病原菌分離自中國農業科學院棉花研究所大田（河南省安陽市），保存于中國農業科學院棉花研究所棉花病害實驗室（以下簡稱本實驗室）；棉花內生細菌蠟狀芽孢桿菌YUPP-10、CGTase原核表達菌株p、轉化擬南芥（）菌株p均來自本實驗室；試驗選用感病棉花品種冀棉11號和耐病品種魯棉研21號。

1.2 培養基

Luria-Bertani（LB）培養基：蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5g·L-1，NaCl 10 g·L-1，瓊脂14 g·L-1。加蒸餾水溶解，最后定容至1 L，調pH 7.0—7.2，分裝后高壓滅菌，液體培養基不加瓊脂。

Czapek培養基：NaNO32 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，FeSO4·7H2O 0.02 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，K2HPO41.31 g·L-1。加蒸餾水溶解，最后定容至1 L，調pH 7.0，分裝后高壓滅菌。

PDA培養基：200 g去皮馬鈴薯煮沸過濾液，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂14 g·L-1。加入蒸餾水溶解，最后定容至1 L，調pH 7.0—7.2，分裝后高壓滅菌。

玉米蛭石培養基：玉米糝﹕蛭石=1﹕1（質量比），適量開水攪拌，分裝于克氏瓶中高壓滅菌。

1.3 YUPP-10對尖鐮孢的拮抗作用

1.3.1 對峙培養法測定YUPP-10對尖鐮孢的影響 將YUPP-10菌株在LB固體平板上活化，選取單菌落接種到LB液體培養基中，置于37℃，200 r/min振蕩培養箱中培養24 h作為菌種，以1%接種量接種到200 mL LB液體培養基中，37℃，200 r/min振蕩培養24 h，獲得YUPP-10培養液備用。在PDA平板培養基中心接種已經活化的直徑為5 mm的尖鐮孢菌餅，呈三角狀對稱在PDA平板中打孔，每孔距離中心20 mm，在其中兩孔接入100 μL YUPP-10培養液，剩余一個孔加入100 μL LB液體培養基作為對照，每個處理重復3次，25℃恒溫培養觀察抑菌情況，7 d后測量抑菌帶寬。

1.3.2 懸滴法[16]測定YUPP-10代謝產物對尖鐮孢孢子萌發的影響 將YUPP-10培養液（制備方法同1.3.1）在4℃，5 000 r/min離心10 min，用0.22 μm的濾芯過濾獲得無菌上清液，備用。在Czapek培養基中接種已經活化的直徑為5 mm的尖鐮孢菌餅，在25℃，180 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養7 d后，用4層醫用無菌紗布過濾，濾液即為尖鐮孢孢子懸浮液，利用血球計數板計算孢子濃度。取無菌濾液原液、1/2稀釋液和1/4稀釋液100 μL，與等量的尖鐮孢孢子懸浮液（2×103cfu/mL，Czapek培養液）均勻混合，取20 μL懸滴于載玻片上，在25℃下保濕培養，5 h后鏡檢孢子萌發情況，以LB培養液與尖鐮孢孢子懸浮液的等體積混合液為對照，每處理重復3次。

1.3.3 混合培養法測定YUPP-10代謝產物對尖鐮孢產孢量的影響 取YUPP-10無菌濾液原液、1/2稀釋液和1/4稀釋液（制備方法同1.3.2）500 μL，與等體積的尖鐮孢孢子懸浮液（制備方法同1.3.2）均勻混合，在25℃的恒溫振蕩培養箱中培養24 h，鏡檢，計算孢子濃度。

1.4 YUPP-10浸種處理對棉花種子發芽的影響

YUPP-10培養液的制備方法同 1.3.1。50 mL培養液置于50 mL離心管中，4℃，5 000 r/min離心收集菌體，用30 mL無菌水重懸菌體，4℃，5 000 r/min離心，重復洗滌3次，去除LB培養基。為了避免菌體沉淀，將洗滌后收集的菌體懸浮在等體積5%的羧甲基纖維素鈉溶液中，備用。取脫絨飽滿的魯棉研21號種子，75%酒精消毒30 s，無菌水洗滌3次，4%次氯酸鈉消毒4 min，無菌水洗滌3次。取50粒消毒后的種子在3種濃度（原液、1/2稀釋液和1/4稀釋液）的YUPP-10羧甲基纖維素鈉中浸種12 h，無菌水多次洗滌種子后置于培養皿中25℃保濕培養，2 d后檢測發芽率及芽長，以5%的羧甲基纖維素鈉溶液浸種處理為對照，每處理重復3次。

1.5 YUPP-10浸種處理對棉花出苗及生長的影響

種子消毒處理同1.4，取適量粒消毒后的種子在YUPP-10羧甲基纖維素鈉懸浮液（制備方法同1.4，OD600=0.2）浸種處理12 h，無菌水多次洗滌種子后，播種在滅菌的蛭石中，在溫度為23—30℃，相對濕度在60%以上的日光溫室中培養7 d后檢測出苗情況，15 d后檢測根長、莖長和棉苗鮮重，以羧甲基纖維素鈉浸種處理為對照，每處理重復3次。

1.6 YUPP-10對棉花枯萎病的防治效果

將PDA平板活化的尖鐮孢接種在Czapek培養基中，在25℃、160 r/min的恒溫搖床中振蕩培養4 d，將尖鐮孢接種在滅菌的蛭石玉米培養基中，25℃下培養，直至菌絲長滿克氏瓶，取出培養物，在陰涼處風干，備用。取脫絨飽滿的冀棉11號種子，75%酒精消毒30 s，無菌水洗滌3次，4%次氯酸鈉消毒4 min，無菌水洗滌3次，在室溫下無菌水浸種處理24 h，棉苗培育方法參照朱荷琴等[17]使用的蛭石沙子無底紙缽定量蘸菌液法，其中將制備好的尖鐮孢蛭石玉米培養物以0.6%（質量比）的接種量混到蛭石沙土基質中。播種后7 d，用200 mL不同濃度的YUPP-10培養液（分別為1×108、1×107和1×106cfu/mL）進行灌根處理，每6個營養缽為一個處理，每處理重復4次，以LB液體培養基處理為對照。棉苗在日光溫室中培養，環境溫度控制在20—30℃，土壤相對濕度在60%以上，光照良好。在棉苗生長25 d左右觀察發病情況，調查病情指數，統計防治效果。棉花苗期枯萎病的分級按國際標準進行。

病情指數=[ Σ（病害級數×各病級株數）/（調查的總株數×4）] ×100；防治效果（%）=[（對照病情指數-處理病情指數/對照病情指數）] ×100。

1.7 CGTase的水解活性

制作羧甲基纖維素（1.2 g·L-1）和葡甘聚糖（1.2 g·L-1）固體平板，對稱放置4個牛津杯，其中兩孔加0.48 mg·mL-1的CGTase蛋白溶液100 μL，剩余兩孔加100 μL蛋白緩沖液（50 mmol·L-1Tris HCl，150 mmol·L-1NaCl，pH 7.5）作為對照，置于37℃暗培養12 h，移除牛津杯，在培養皿中添加10 ml碘-碘化鉀（0.2%﹕2%）染液，5 min后棄掉染液，透明圈即表示蛋白對兩種物質的水解能力。

1.8 CGTase的抑菌活性

在PDA平板培養基中心接種已經活化的直徑為5 mm的尖鐮孢菌餅，對稱在PDA平板上打兩孔，25℃恒溫培養3 d后，在其中一孔接入0.48 mg·mL-1CGTase蛋白溶液50 μL，另一孔加入50 μL蛋白緩沖液作為對照，繼續培養觀察抑菌情況，2 d后測量抑菌帶寬。取0.12、0.24和0.48 mg·mL-1CGTase作為處理，蛋白緩沖液作為對照進行產孢和孢子萌發試驗，其他處理同方法 1.3.2和1.3.3。

1.9 轉CGTase擬南芥的抗病能力

為明確CGTase是否可作為利用基因工程進行抗病育種的資源，利用Floral dip法[18]進行擬南芥的轉化，使擬南芥能夠表達，用含有p的農桿菌（）GV3101侵染擬南芥花序，獲得過表達植株，通過卡那霉素抗性篩選3代，獲得純合株系，將轉擬南芥和野生型擬南芥（WT）種植在含有尖鐮孢的土中，進行抗枯萎病能力研究，菌土為尖鐮孢蛭石玉米培養物以0.6%（質量比）的接種量混到營養土基質中。

1.10 轉CGTase擬南芥防御基因的表達

種植野生型和轉擬南芥，14 d后接種尖鐮孢孢子液，通過qPCR分析接菌后6、12、24、48和72 h防御基因（F：AAACCGTGTCATACGAACCA；R：ATCAATGGTGGTGAATGCAA）、（F：ACCCTTATCTTCGCTGCTCTTG；R：ATGTCCCACT TGGCTTCTCG）、（F：GTATGGCTTCTCGTTCAC AT；R：CTAAGAGGCAACTGCAGACT）和（F：GCTTCCTTCTTCAACCACACAGC；R：CGTTGATG TACCGGAATCTGAC）的表達量，以（F：AACTTTGGTTTGTGTTTTGG；R：TCGACTTGTCAT TAGAAAGAAAGAGATAA）作為內參基因。

1.11 數據處理及分析

試驗數據采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 YUPP-10對尖鐮孢的抑制作用

2.1.1 對菌絲生長的抑制作用 將YUPP-10菌株與尖鐮孢對峙培養7 d時測量抑菌帶寬，發現在接種細菌的處理中，菌絲生長受到抑制（圖1），平均抑菌帶寬為0.56 cm。結果表明YUPP-10菌株對尖鐮孢菌絲生長具有顯著的抑制作用。

2.1.2 對產孢的抑制作用 混合培養尖鐮孢孢子液與YUPP-10發酵產物的無菌濾液，暗培養24 h，利用光學顯微鏡和血球計數板觀察孢子數量。結果表明對照的孢子數為33.40 cfu/mL，無菌濾液原液、1/2稀釋液和1/4稀釋液對孢子萌發的抑制率分別98.41%、54.49%和56.49%，處理與對照之間存在顯著差異（表1）。

2.1.3 對孢子萌發的抑制作用 利用懸滴法培養尖鐮孢孢子液與YUPP-10發酵產物的混合液，5 h后通過光學顯微鏡觀察孢子萌發情況，芽管長度超過孢子長度的一半，視為萌發，通過數據分析結果表明，對照組的孢子萌發率為52.87%，無菌濾液原液、1/2稀釋液和1/4稀釋液對孢子萌發的抑制率分別為51.65%、35.30%和27.75%，在供試濃度范圍內均表現出顯著差異（表1）。

A、B：YUPP-10處理 Treated by YUPP-10；C：LB培養基處理 Treated by LB medium

表1 YUPP-10處理后對產孢和孢子萌發的影響

數據后不同字母表示差異顯著（＜0.05）。下同Data with different letters indicate significant difference at＜0.05 level. the same as below

2.2 YUPP-10對棉花生長的影響

2.2.1 菌體懸浮液浸種處理對棉花種子發芽的影響 高濃度的YUPP-10羧甲基纖維素鈉菌體懸浮液對種子發芽具有抑制作用，而1/2和1/4稀釋液對種子發芽具有顯著的促進作用。同樣，高濃度YUPP-10處理后，種子的芽長低于對照，用稀釋的YUPP-10菌體懸浮液處理后，芽長大于對照，但差異不顯著（表2）。

2.2.2 菌體懸浮液浸種處理對棉花出苗及生長的影響 鑒于高濃度的YUPP-10抑制種子萌發，采用低濃度的YUPP-10羧甲基纖維素鈉懸浮液（OD600=0.2）浸種處理后播種，統計出苗情況、根長、莖長和植株鮮重等指標，結果表明使用YUPP-10浸種后，能顯著促進棉花種子的出苗率，棉花的莖長顯著高于對照，對根長和總鮮重無顯著影響（表3）。

2.3 YUPP-10發酵液對棉花枯萎病的防治效果

YUPP-10發酵液濃度為1×107cfu/mL時對棉花枯萎病的防治效果最好，防治效果達到45.11%，供試的3個濃度中，1×108和1×107cfu/mL處理后的病情指數和病株率顯著低于對照（表4、圖2）。

表2 YUPP-10浸種對種子發芽的影響

2.4 CGTase的水解活性

通過分析YUPP-10菌株的Fosmid文庫，發現能夠水解-1,4糖苷鍵的物質為YUPP-10菌株的分泌蛋白環糊精糖基轉移酶（CGTase），為驗證CGTase具有降解-1,4糖苷鍵的能力，檢測了其對羧甲基纖維素和葡甘聚糖的降解活性，經I-KI染色后，出現了透明圈（圖3），表明CGTase具有水解活性。

表3 YUPP-10浸種處理對棉花生長的影響

表4 YUPP-10菌劑處理對棉花枯萎病病株率、病情指數的影響及防治效果

圖2 YUPP-10處理棉花對枯萎病的防治效果

2.5 CGTase的抑菌活性

在長有尖鐮孢的平板上添加CGTase后，抑制了菌絲的生長（圖4），通過共培養和懸滴法測定CGTase對尖鐮孢產孢和孢子萌發的影響，結果表明CGTase對兩者均具有顯著的抑制作用（表5）。

2.6 轉CGTase擬南芥對枯萎病的抗性評價

在模式植物擬南芥中過表達，并獲得純合植株。在含有尖鐮孢的基質中生長，野生型幼苗表現出葉片黃化，甚至整株壞死，而過表達植株抗病能力顯著高于野生型（圖5）。

2.7 病原脅迫下擬南芥防御基因的表達

、、和在植物抗病性中起重要作用，利用qPCR方法檢測擬南芥在尖鐮孢脅迫下防御相關基因的表達。在抗病關鍵時期，轉基因擬南芥防御基因在病原脅迫下的表達量顯著高于野生型（圖6）。

A：羧甲基纖維素carboxymethyl cellulose；B：葡甘聚糖glucomannan

圖4 CGTase的抑菌活性

表5 CGTase處理后對產孢和孢子萌發的影響

圖5 CGTase過表達擬南芥的抗病能力

3 討論

植物與細菌的協同作用已有較多研究，由于細菌種類和數量巨大，對植物的微生態環境具有調節作用，從而影響植物的健康和生長。在長期的進化中，植物也會“選擇”對自己有利的細菌定殖，包括在植物組織內部的定殖[19-21]。內生細菌能促進寄主植物生長并防止病原物入侵，且在不同的環境條件下，內生細菌比根際細菌更能有效地與寄主植物互作[22-23]。分離自健康棉花組織中的內生蠟狀芽孢桿菌YUPP-10能夠利用葡甘聚糖作為碳源[15]，表明其能夠水解-1,4糖苷鍵[24-26]，真菌細胞壁主要成分幾丁質是通過-1,4糖苷鍵聚合N-乙酰葡糖胺形成的線性聚合物[27]，能夠利用葡甘聚糖作為碳源的細菌也具有水解幾丁質-1,4糖苷鍵的活性，從而破壞病原真菌的細胞壁，起到抑制病菌生長的作用。本研究表明，YUPP-10發酵產物對枯萎病病原菌尖鐮孢的菌絲生長、產孢和孢子萌發均具有顯著的抑制作用。孢子是已知的抗逆性較強的真菌生命形式之一，可以承受高溫、強酸、高壓等環境脅迫[28]，能夠直接發育成新個體，因此有效抑制孢子的萌發和產孢對抑制病原菌的繁殖力和侵染最有重要作用。

圖6 病原脅迫下擬南芥防御基因的表達

Nejad等報道了內生細菌能夠顯著改善油菜和番茄的生長發育[29]，本研究也發現在適宜的濃度下，YUPP-10菌體懸浮液能夠有效促進種子發芽和幼胚生長，因此YUPP-10菌株具有用作種子包衣劑的潛力。促植物生長是增強植物自身抵抗病蟲害侵染的有效措施，在本研究中，低濃度的YUPP-10浸種處理的棉花種子，其出苗率有顯著的提高，地上部分的生長也有明顯的加強，這也進一步證明YUPP-10作為種子包衣劑是合適的選擇。

使用YUPP-10液體菌劑灌根處理，在使用的3個濃度中，1×107cfu/mL對棉花枯萎病的防治效果最好，為大田的應用提供了施用參考濃度。蠟狀芽孢桿菌作為枯萎病的防治劑也有相關報道，如用于番茄枯萎病[30-31]、西瓜枯萎病[32]和香蕉枯萎病[33]的防治。

通過Fosmid文庫，獲得了YUPP-10中能夠降解-1,4糖苷鍵的物質為環糊精糖基轉移酶（CGTase）[34]。CGTase能夠抑制尖鐮孢菌絲生長、產孢和孢子萌發。在擬南芥中過表達，能夠增強植株對枯萎病的抗性。相較于野生型擬南芥，轉基因植株、、和等防御基因的表達量顯著升高。是JA/ET信號通路的標志基因[35]，PR1/2是SA信號通路的標志基因[36]，qPCR結果顯示，CGTase可能通過激發植物SA和JA信號通路抵抗病原菌的侵染。

4 結論

蠟狀芽孢桿菌菌株YUPP-10能夠有效防治棉花枯萎病，且具有促生長能力。從YUPP-10中篩選到的關鍵抑菌物質CGTase也能夠抑制棉花枯萎病病原菌尖鐮孢生長，轉擬南芥部分防御基因在病原脅迫下的表達量顯著高于野生型，從而增強了植株對病害的耐受性。YUPP-10菌株和分別具有作為棉花枯萎病生防制劑和轉基因育種候選基因防治枯萎病資源的前景。

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Biocontrol Effect and Mechanism of Cotton Endophytic Bacterium YUPP-10 and Its Secretory Protein CGTase Against Fusarium Wilt in Cotton

ZHOU JingLong1,2, FENG ZiLi2, WEI Feng2, ZHAO LiHong2, ZHANG YaLin2, ZHOU Yi1, FENG HongJie2, ZHU HeQin2

1College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei;2Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan

【】Fusarium wilt is one of the most important soil-borne diseases in cotton planting. Chemical methods are mainly used to control this disease, however, it has certain impact on the environment, human and animal safety. Biological control has become an important way to control cotton Fusarium wilt because of its high specificity and safety. The objective of this study is to screen an efficient antagonistic bacteria, and characterize the biocontrol mechanism of bacteria against Fusarium wilt, thus providing a technical basis for cotton Fusarium wilt control with biocontrol bacteria.【】In a previous study, an endophytic bacteriumYUPP-10 was isolated from vascular of cotton, which can hydrolyze polysaccharides with-1,4 linkage. The effects of YUPP-10 on hyphal growth, sporulation, and spore germination ofwere tested using the confront culture method, enclosed chamber test and hanging drop method, respectively. The seeds were soaked by YUPP-10, and then, the seeding germination and the biomass of cotton were detected. The cotton were cultivated in substrate with, and after a week of growth, YUPP-10 cultured with LB liquid medium was treated at different concentrations (1×108, 1×107and 1×106cfu/mL, respectively), and the control efficacy against Fusarium wilt was studied in the greenhouse. The key antibacterial substances of YUPP-10 were obtained by Fosmid library, and the direct effects of recombinant cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) onhyphal growth, sporulation, and spore germination were studied. The overexpression vector was transformed intoCol-0 via the floral dip method. The resistance of-overexpressing transgenic plants against Fusarium wilt was assessed with antechnique. The transcriptional levels of some defense genes were analyzed under pathogen challenge.【】YUPP-10 significantly inhibited the hyphal growth, sporulation, and spore germination of, the most inhibition rate of spore yield and germination was 98.41% and 51.65%, respectively. Low concentration of YUPP-10 could promote the germination rate, emergence rate and stem length of cotton seeds. After the treatment of YUPP-10, the diseased plant rate and disease index were significantly lower than those of the control group. The control efficacy was 45.11% at the concentration of 1×107cfu/mL. CGTase was the key antimicrobial substance of YUPP-10, the effects of added CGTase on the transparent circles of carboxymethyl cellulose and glucomannan were measured, the results showed that CGTase could hydrolyze polysaccharides with-1,4 linkage. CGTase also had significant inhibitory effects on the growth, sporulation and spore germination of the pathogen, the most inhibition rate of spore yield and germination was 62.63% and 30.83%, respectively. The-overexpressingenhanced disease resistance by enhancing the expression of defense genes.【】YUPP-10 is an efficient biocontrol agent that inhibits thegrowth, promots germination rate, emergence rate and stem length of cotton seeds, and protects cotton plant frominfection. CGTase can inhibit the growth of, and its transgenicenhances the resistance to Fusarium wilt.

; cotton Fusarium wilt;f. sp.; cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase); control efficacy

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.17.011

2020-11-14；

2020-12-03

國家自然科學基金（31901938）、中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（1610162021031）、中國農業科學院科技創新工程

周京龍，E-mail：zhoujl510@163.com。通信作者朱荷琴，E-mail：heqinanyang@163.com。通信作者周燚，E-mail：zhouyi@yangtzeu.edu.cn

（責任編輯 岳梅）