河北地區(qū)漢族心腦血管病患者ApoE和SLCO1B1基因多態(tài)性分析

何莎 茍東蕓 王文遠 劉紫倩 楊潔 王彥永 孫靜娜 張令怡 馬曉偉

目前腦卒中仍然是世界范圍內病死率較高的主要疾病［1］，其中缺血性卒中是由腦局部血液循環(huán)障礙所致中樞神經功能缺損綜合征，高脂血癥、動脈粥樣硬化、吸煙、高血糖及高血壓等疾病或不良嗜好是其重要危險因素。研究證實，缺血性卒中的發(fā)病過程受相關基因調控［2］，載脂蛋白E（ApoE）基因多態(tài)性則可能是其重要危險因素之一［3］。既往研究表明，ApoE基因多態(tài)性與缺血性卒中的發(fā)生存在相關性，尤其是攜帶ε4等位基因的亞洲人群發(fā)生缺血性卒中的風險明顯高于白種人［4-5］。他汀類藥物作為預防心腦血管病的重要藥物，在臨床上被廣泛應用［6］，但其降脂效果及患者臨床結局存在較大的個體差異，這種差異的部分原因可能與遺傳因素相關［7］，近年較受關注的基因類型即ApoE和SLCO1B1基因。研究表明，SLCO1B1基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）可通過改變藥物代謝酶和藥物轉運蛋白的轉運活性而影響藥物的血清濃度，誘發(fā)肌肉病。本研究采用聚合酶鏈反應（PCR）-熒光探針法從分子水平對河北地區(qū)漢族人群中心腦血管病患者ApoE和SLCO1B1基因多態(tài)性的分布特征進行分析，以為實現(xiàn)基因檢測手段服務于腦卒中的防治及他汀類藥物精準治療提供理論依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

1.納入標準（1）年齡17～100歲。（2）籍貫為河北地區(qū)漢族居民，無血緣關系以及異族通婚史。（3）依據(jù)《心血管內科疾病診療指南》［8］和《中國各類主要腦血管病診斷要點2019》［9］確診合并心血管病或腦血管病。（4）本研究經河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院倫理委員會審批（批準號：20190418），患者及其家屬對研究項目知情同意并簽署知情同意書。

2.排除標準（1）未檢測到基因表型者。（2）有肝、腎、血液系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病或肝功能異常者。（3）近3個月內參加其他臨床試驗者。

3.一般資料選擇2018年6月至2019年10月在我院神經內科和心內科就診的4193例心腦血管病患者，男性2314例，女性1879例；年齡31～97歲，平均（64.12±12.18）歲。

二、研究方法

1.儀器與試劑全自動核酸提純及熒光PCR分析儀Anadus9850、血液基因組DNA提取試劑盒均購自廈門安普利生物工程有限公司；人類SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒（批號：19052008，PCR-熒光探針法）由武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司提供。

2.基因組DNA提取抽取患者晨起空腹靜脈血2 ml，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，嚴格按照試劑盒說明書提取基因組DNA，同時，設置弱陽性對照和空白對照。分別于2 ml基因組DNA（5～15 ng/μl）、弱陽性對照及空白對照管中滴加4種PCR反 應 液（SLCO1B1*1b、SLCO1B1*5、ApoE2、ApoE4），進行PCR擴增。PCR反應總體系為25 μl［緩沖液、特異性引物和探針、內標引物、探針和模板、Taq酶和尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）］，配制后于離心半徑4.83 cm、2650 g/min離心2 min；反應條件為37℃10 min、95℃5 min；95℃15 s、60℃45 s，共40個循環(huán)。

3.PCR-熒光探針法擴增基因組DNA及信號采集按照以下條件進行PCR反應，UNG酶處理階段：37℃10 min循環(huán)1次；預變性階段：95℃5 min循環(huán)1次；PCR階段：95℃15 s、60℃45 s，共循環(huán)40次，于60℃時進行數(shù)據(jù)采集，熒光信號的收集定為FAM（SLCO1B1*1b388A、SLCO1B1*5521T、ApoE?2526C、ApoE?4388T）、VIC（SLCO1B1*1b388G、SLCO1B1*5521C、ApoE?2526T、ApoE?4388C）和ROX（內標）。根據(jù)不同等位基因數(shù)目和等位基因總數(shù)計算基因頻率：已知基因型個體數(shù)，計算某基因頻率=［該基因總數(shù)（A）/該基因及其等位基因的總數(shù)（A+a）］×100%；已知基因型頻率求某一等位基因的頻率＝該等位基因純合子的頻率（AA）+1/2×雜合子的頻率。

4.統(tǒng)計分析方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。計數(shù)資料以相對數(shù)構成比（%）或率（%）表示，ApoE和SLCO1B1基因多態(tài)性位點是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡和組間基因型分布的差異性，行χ2檢驗。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、ApoE和SLCO1B1基因多態(tài)性等位基因頻率及基因型分布

分析結果顯示，河北地區(qū)漢族心腦血管病患者ApoE及SLCO1B1基因多態(tài)性位點突變頻率觀察值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，提示該樣本來自同一總體，具有群體代表性（表1）；且男女之間ApoE基因多態(tài)性位點388T＞C、526C＞T，SLCO1B1基因多態(tài)性位點388A＞G、521T＞C分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；表2，3）。

表1 ApoE和SLCO1B1基因等位基因頻率及Hardy-Weinberg平衡檢驗Table 1.Allele frequency of ApoE and SLCO1B1 genes and the test of Hardy-Weinberg balance

表2 不同性別心腦血管病患者ApoE基因多態(tài)性頻率分布的比較［例（%）］Table 2.Frequency distribution of ApoE genotypes of patients with curlar-cerebrovascular disease in different gender[case(%)]

二、基因多態(tài)性分布

1.ApoE基因多態(tài)性分布河北地區(qū)漢族心腦血管病患者ApoE基因的6種表型中，以?3/?3、?3/?4所占比例最高，分別為68.57%（2875/4193）、15.48%（649/4193）；?2/?2、?2/?3、?2/?4、?4/?4比例為0.48%（20/4193）、12.81%（537/4193）、1.69%（71/4193）和0.98%（41/4193）。不同性別之間ApoE各表型差異無統(tǒng)計學意義（χ2=6.971，P=0.223；表4）。

表4 不同性別心腦血管病患者ApoE基因表型分布［例（%）］Table 4.Genotypes of ApoE gene of patients with curlar-cerebrovascular disease in different gender[case(%)]

2.SLCO1B1基因多態(tài)性分布河北地區(qū)漢族心腦血管病患者SLCO1B1基因的7種表型之中，*1a/*1a、*1b/*1b、*1a/*1b、*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15、*15/*15所占比例分別為7.20%（302/4193）、39.57%（1659/4193）、31.05%（1302/4193）、0.02%（1/4193）、6.42%（269/4193）、14.31%（600/4193）和1.43%（60/4193）。不同性別之間SLCO1B1基因表型差異無統(tǒng)計學意義（χ2=11.354，P=0.078；表5）。

表5 不同性別心腦血管病患者SLCO1B1基因表型分布［例（%）］Table 5.Genotypes of SLCO1B1 gene of patients with curlar-cerebrovascular disease in different gender[case(%)]

討 論

腦卒中是一種受多基因、多因素影響的腦血管病，其中遺傳和環(huán)境因素共同影響其病理生理學機制［3］。研究顯示，中國漢族人群中ApoE?4等位基因及?2/?4、?3/?4、?4/?4基因表型可能是缺血性卒中的危險及遺傳易感因素［10］。他汀類藥物是目前防治冠心病、腦卒中及高脂血癥等疾病的首選藥物，但其降低膽固醇的幅度仍然存在很大的個體差異，約有1/3的患者經調整調脂藥物后仍達不到降脂目標［11］，這種降低膽固醇的效果表現(xiàn)出相對較大的個體差異，與患者的病情、治療依從性及遺傳因素有關［12］。研究發(fā)現(xiàn)，SLCO1B1基因的常見變異與他汀類藥物引起的肌病密切相關，SLCO1B1基因突變可增加他汀類藥物的血漿濃度，從而導致肌病的發(fā)生風險上升［13-14］。

ApoE是一種存在于血漿中可以參與脂蛋白運輸和代謝、腦磷脂代謝及維持神經細胞間脂類代謝的載脂蛋白［15］。ApoE有兩種常見單核苷酸多態(tài)性，526C＞T和388T＞C，二者共形成3種等位基因（?2、?3、?4）和6種基因表型（?3/?3、?3/?4、?2/?3、?2/?4、?4/?4、?2/?2）［16］。本研究顯示，不同性別間ApoE基因單核苷酸多態(tài)性位點388T＞C、526C＞T分布及基因表型分布差異無統(tǒng)計學意義，提示ApoE基因多態(tài)性與性別無關。大量研究結果表明，ApoEε4可能是中國漢族人群缺血性卒中的重要遺傳因素［10，17-18］，Jin等［17］對漢族人群ApoE基因多態(tài)性和缺血性卒中相關性進行觀察，發(fā)現(xiàn)與ApoE3/3型受試者相比，ApoE4/4攜帶者發(fā)生缺血性卒中的風險增加2.1倍，且缺血性卒中組患者ApoE?4等位基因頻率明顯高于對照組，表明ε4是中國漢族人群缺血性卒中的危險因素，其與缺血性卒中病情進展密切相關［17-18］。

表3 不同性別心腦血管病患者SLCO1B1基因多態(tài)性頻率分布的比較［例（%）］Table 3.Frequency distribution of SLCO1B1 genotypes of patients with curlar-cerebrovascular disease in different gender[case(%)]

以往研究顯示，不同民族之間ApoE基因多態(tài)性的基因型頻率和等位基因頻率存在差異［19］。本研究對河北地區(qū)漢族心腦血管病患者的觀察顯示，ApoE?4等位基因頻率所占比例為9.56%（802/8386），?3和?2的比例分別為82.71%（6936/8386）和7.73%（648/8386；而與?4相關的基因表型?3/?4、?2/?4、?4/?4占比分別為15.48%（649/4193）、1.69%（71/4193）和0.98%（41/4193），與中國南部客家族［20］及華中地區(qū)漢族人群［21］的研究結果相似，提示河北地區(qū)漢族心腦血管病患者中約20%的人存在罹患缺血性卒中的潛在風險。對此類人群應該進行健康教育宣傳并盡早做好預防，從而避免缺血性卒中的發(fā)生。

SLCO1B1基因是指導合成有機陰離子轉運多肽1B1（OATP1B1）的基因，其多態(tài)性可以導致OATP1B1的轉運功能下降并可增加藥物不良反應，SLCO1B1基因位點有兩個常見、非同義單核苷酸多態(tài)性位點顯示藥物運輸功能改變，分別是521T＞C和388A＞G［14］。兩種單核苷酸多態(tài)性共形成4種單倍型（*1a、*1b、*5、*15）以及9種表型（*1a/*1a、*1b/*1b、*1a/*1b、*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15、*15/*15、*5/*5、*5/*15）。本研究僅檢測到7種表型，未檢測到*5/*5和*5/*15，且不同性別之間SLCO1B1基因單核苷酸多態(tài)性位點388A＞G、521T＞C分布及基因表型分布差異并無統(tǒng)計學意義，提示SLCO1B1基因多態(tài)性與性別無關。SLCO1B1基因的功能突變（包括SLCO1B1單核苷酸多態(tài)性388A＞G、521T＞C）在世界各地均以高頻率廣泛分布，且在群體內部的多樣性大于在群體之間的多樣性［22］。本研究納入的河北漢族心腦血管病患者，SLCO1B1388A＞G與521T＞C基因突變頻率分別為74.04%（6209/8386）和11.81%（990/8386），與中國南方客家族的74.18%（1362/1836）和10.95%（201/1836）［20］，以及華中地區(qū)漢族人群的74.99%（4873/6498）和12.37%（804/6498）［21］突變頻率相似。與國外相關人群相比，河北地區(qū)漢族心腦血管病患者SLCO1B1388A＞G基因突變頻率與非洲人群相近（70%～80%），且高于高加索人群（30%～45%）。相比中國漢族人群，SLCO1B1521T＞C基因突變在美國、中東及歐洲人群中發(fā)生頻率較高，分別為24%、20%和18%，但在撒哈拉以南非洲的突變頻率（1.9%）較低［22］。

既往研究表明，SLCO1B1521T＞C可增加他汀類藥物（如辛伐他汀、普伐他汀、西立伐他汀、洛伐他汀）治療人群發(fā)生相關肌病的風險［23］。這是由于SLCO1B1521T＞C基因突變使OATP1B1的轉運活性降低，導致許多他汀類藥物尤其是活性辛伐他汀酸的血藥濃度顯著升高，使辛伐他汀誘發(fā)肌肉病的風險隨之增加，從而降低辛伐他汀的治療效果［24］。他汀類藥物引起的不良反可能與SLCO1B1基因多態(tài)性及他汀藥物種類有關，但也有部分學者認為SLCO1B1521T＞C基因突變不會增加肌病的發(fā)生風險［25-26］。在本研究中，SLCO1B1521 TC（雜合突變）和CC（純合突變）型所占比例分別為20.75%（870/4193）、1.43%（60/4193），521T＞C基因突變頻率為11.81%（990/8386），提示河北地區(qū)漢族心腦血管病患者中有近20%的人存在罹患他汀藥類物相關性肌肉病風險，對于此類用藥患者應盡量監(jiān)測并避免其發(fā)生相關不良反應。對湖北省漢川市漢族人群SLCO1B1基因多態(tài)性與缺血性卒中相關性的研究提示，SLCO1B1基因rs4149056位點多態(tài)性可能與缺血性卒中有關，TC和CC基因型人群可能更容易罹患缺血性卒中，等位基因C可能是腦卒中的易感基因［27］。

綜上所述，河北地區(qū)漢族心腦血管病患者中可能有近20%的人存在發(fā)生缺血性卒中和他汀類藥物相關性肌肉病的風險，攜帶SLCO1B1*5或*15等位基因的患者應避免服用高劑量他汀類藥物。對不同地區(qū)的人群進行ApoE和SLCO1B1基因多態(tài)性檢測可從分子水平揭示其與疾病易感性的關系，為不同地區(qū)預防缺血性卒中及實現(xiàn)他汀類藥物精準治療提供理論依據(jù)。

利益沖突無