全二維氣相色譜飛行時間質譜技術解析明綠液白酒揮發性組分特征

高夢昕,付啟海,李東風,鞏建,范新發,陳雙*,徐巖*

1(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122) 2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 3(安徽明光酒業有限公司,安徽 明光,239400)

中國白酒以高粱等谷物作為主要原料,以天然的多種微生物、開放式固態發酵等獨特的生產工藝釀造而成,形成了白酒復雜而獨特的風味特征[1]。影響白酒典型風格的因素有很多,如原料、曲種、發酵容器、生產工藝、儲存條件、勾調技術、自然環境等,適宜的自然環境加上可變的釀酒工藝使中國白酒的風格趨于多元化[2]。而這些不同風格的形成主要是由白酒中微量成分決定的,這些微量組分在各種白酒中的含量和比例不同,構成了各種白酒的不同風格[3]。利用現代檢測技術不斷研究白酒中揮發性組分的種類和含量,是我們明晰不同風格白酒、全面認識中國白酒風味組分特征的基礎。

中國白酒揮發性組分的研究始于1963年的茅臺試點,建立了紙上色譜法和薄層層析色譜法[4],發現濃香型大曲酒的主體香成分是己酸乙酯,有效的促進了濃香型白酒品質的提升[5]。隨后,氣相色譜分析技術在白酒企業得到了廣泛應用[6],其與質譜的聯用可以獲得確切的定性結果,是目前白酒揮發性組分研究中應用最廣泛的技術[7-8]。然而由于白酒揮發性組分十分復雜,一維氣相色譜質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分離度有限,通常需要與多種前處理方法聯用[9],全二維氣相色譜-飛行時間質譜(comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry,GC×GC-TOFMS)技術通過兩種極性不同的氣相色譜柱實行正交分離,其峰容量、靈敏度和分離度與一維色譜相比具有顯著優勢[10]。2007年季克良等[11]最早應用GC×GC-TOFMS技術鑒定醬香型、濃香型和清香型白酒中的揮發性組分；同年,ZHU等[12]優化了色譜柱組合,采用液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)結合GC×GC-TOFMS,在茅臺酒中發現了528種揮發性組分。隨后全二維被用于瀘州老窖、古井貢、青稞酒、芝麻香等白酒的揮發性組分研究中,成為分析白酒這類復雜樣品的有效手段[13-15]。但通過GC×GC-TOFMS分析白酒中揮發性組分時,一次樣品分析往往能夠獲得幾千個色譜峰,逐一解析確認需要耗費極大的時間和人力,給白酒中揮發性組分的鑒定工作帶來了巨大挑戰。本課題組前期通過多種前處理方式結合GC×GC-TOFMS,對十二大香型白酒的各種成品酒和原酒進行分析,構建了中國首個白酒揮發性風味數據庫[16],數據庫中收錄了在白酒中鑒定出的近3 000種化合物的質譜信息、理化信息和風味信息,并基于全二維分析和數據庫聯用建立了快速準確解析白酒中揮發性風味組分的新方法。

原料是白酒釀造的基礎,它不僅為微生物提供了能量和營養,而且自身含有大量的香氣前體物質,對釀造產品的風味產生重要影響,因此,釀造原料的多樣性對白酒風格的多樣性有很大貢獻[17-18]。明綠液酒是安徽明光酒業有限公司的特色產品,其生產在傳統濃香型白酒工藝技術上創新加入部分明光綠豆作原料,產品風味芳香濃郁、甘美醇厚、豆香清雅、風格獨特,受到消費者的青睞[19],但目前沒有對明綠液酒中揮發性組分研究的報道。同時,綠豆作為明綠液酒釀造的獨特原料,對明綠液酒風味品質具有決定性影響,而目前對綠豆蒸煮過程產生的風味物質沒有報道,其特有的香氣特征如何最終影響酒的風格缺乏深入研究。

本研究以明綠液酒及其釀造特色原料綠豆為對象,采用頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)結合GC×GC-TOFMS技術對明綠液酒和蒸煮綠豆的揮發性組分特征進行解析,以期剖析明綠液酒獨特風格形成的風味物質基礎及成因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品

本實驗采用的樣品由明光酒業有限公司提供,包括3個批次明綠液原酒、1款明綠液成品酒和生產用的磨碎后的綠豆。原酒的乙醇體積分數(酒精度)為59%,成品酒的酒精度為40.2%,在實驗期間低溫避光儲存；磨碎后的綠豆密封干燥,4 ℃保存。

1.1.2 主要試劑

實驗所用乙醇和正構烷烴(C5～C30)(色譜純),美國Sigma-Aldrich公司；NaCl(化學純),中國國藥上海化學試劑公司。

1.1.3 主要儀器

Pegasus?4D全二維氣相色譜-飛行時間質譜儀(GC×GC-TOFMS),美國LECO公司；7890B氣相色譜儀、一維色譜柱DB-FFAP(60 m×0.25 mm,0.25 μm),美國安捷倫公司；二維色譜柱Rxi-17 Sil MS(1.5 m×0.25 mm,0.25 μm),美國Restek公司；頂空固相微萃取多功能自動進樣系統MPS 2,德國Gerstel公司；三相萃取頭DVB/CAR/PDMS(2 cm,50/30 μm),美國Supelco公司；超純水儀Mili-Q,美國密理博公司；超聲波清洗儀SB-25-12 D,寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平,Mettler-Toledo公司；電熱鼓風干燥箱,上海恒科學儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋DK-S24型,上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HS-SPME前處理方法

酒樣：參照本實驗室前期優化建立的方法進行[20]。根據酒精含量,將明綠液酒樣品用超純水稀釋至2% (體積分數),取8 mL稀釋后的酒樣及3 g NaCl 20 mL頂空瓶中,用帶有PTEE藍色硅膠隔墊的空心磁性金屬蓋密封。然后由MPS 2進行HS-SPME操作：樣品在50 ℃下平衡5 min,萃取45 min,萃取結束后在GC進樣口解吸附5 min,隨后進行GC×GC-TOFMS分析,相同條件下進樣3次。

綠豆：參照本實驗室前期建立的高粱蒸煮揮發性香氣成分的提取方法進行[21]。模擬明綠液酒蒸糧工藝進行綠豆蒸煮,在1 L燒杯中加入綠豆30 g和蒸餾水40 mL,攪拌均勻后用保鮮膜封口,于75 ℃烘箱內過夜潤糧。稱取5 g潤糧結束的綠豆顆粒于20 mL頂空瓶內,加1 mL超純水,用帶有PTEE藍色硅膠隔墊的空心磁性金屬蓋密封。將頂空瓶置于水浴鍋內沸水浴1 h后直接由MPS 2進行頂空固相微萃取,樣品在70 ℃下平衡5 min,萃取60 min,萃取結束后在GC進樣口解吸附5 min,隨后進行GC×GC-TOFMS分析,相同條件下進樣3次。

1.2.2 GC×GC-TOFMS儀器條件設置

GC×GC條件：進樣口溫度250 ℃,進樣模式為1∶1分流進樣。樣品運行采用恒流模式,載氣為高純氦氣(純度>99.999 5%),流速為1 mL/min。一維柱溫箱升溫程序[22]：起始溫度45 ℃,保持3 min后,以4 ℃/min升溫至150 ℃保持2 min；以6 ℃/min升溫至200 ℃然后以10 ℃/min升溫至230 ℃并保持10 min。第二個烘箱全程保持比一維烘箱高5 ℃。調制補償溫度為20 ℃。調制周期為4 s(熱脈沖時間0.8 s)。

TOFMS條件：無溶劑延遲。采用EI電離源,離子源電壓為70 eV,溫度為230 ℃,傳輸線溫度為240 ℃。檢測器電壓為1 430 V。采集質量數范圍為35～400 amu,采集頻率為100 spectra/s。二維數據由LECO公司ChromaTOF?工作站采集。

1.2.3 GC×GC-TOFMS數據處理方法

實驗采集的TOFMS數據由LECO公司的ChromaTOF?工作站進行數據處理,最大一維保留時間偏差為12 s,二維保留時間偏差為0.2 s,自動識別信噪比大于100的色譜峰后進行自動積分解卷積和質譜庫比對[23],使用的譜庫為本實驗室自建的白酒揮發性風味數據庫(包含近3 000種白酒中揮發性組分)[16],比對結果自動生成“峰表”,去除重復信息獲得酒樣的定性結果。

對于沒有匹配到的峰,通過NIST 2014和Wiley 9等商業化數據庫比對,生成的“峰表”經過進一步的人工解譜,篩選質譜正反相似度大于700,可能性大于4 000的化合物；在相同GC×GC條件下分析一系列正構烷烴(C5～C30),在ChromaTOF軟件中建立保留指數計算方法,確定每個化合物的一維色譜柱保留指數,與文獻報道的保留指數進行比對,篩選兩者數值差異在50以內的化合物作為鑒定結果[24]；如果沒有查到文獻報道的保留指數,保留質譜正反相似度在800以上的化合物,去除重復信息獲得酒樣的補充定性結果。對于綠豆,采用峰面積歸一法,對每個香氣組分色譜峰進行積分,計算各種化合物的相對峰面積百分含量。

2 結果與討論

2.1 采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS鑒定明綠液酒揮發性風味組分

采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS技術對明綠液酒樣品中揮發性組分特征進行深入解析,選取其中一款原酒獲得圖1所示的全二維分析譜圖,共分離檢測到3 129個色譜峰,每1個黑點表示軟件自動識別的1個色譜峰,結果顯示明綠液酒中揮發性組分十分復雜。

從圖1可以看出,一維色譜圖中有大量化合物存在共流出現象,通過進一步的二維色譜分離,這些共流出化合物得到了較好的分離。在圖2中,分別節選了明綠液酒分析時4個保留時間下,化合物在一維柱上沒有分開的情況,圖2-a中,二甲基二硫和己醛共流出；圖2-b中,壬酸乙酯、苯甲醛和芳樟醇共流出；圖2-c中,己酸和土味素共流出；圖2-d中,4-甲基苯酚和柏木腦共流出。這其中的芳樟醇、土味素和柏木腦都屬于含量很低、不容易檢測到的物質,容易被高含量的組分所掩蓋,造成定性分析較困難。通過第二根色譜柱的使用,共流出組分之間的干擾顯著降低,可以檢測到更多的色譜峰,獲得更全面的定性結果。

a-1D總離子流色譜圖；b-2D總離子流色譜圖圖1 明綠液酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析1D總離子流 色譜圖與2D總離子流色譜圖Fig.1 Analytical total ion chromatogram contour 1D plot and 2D plot obtained from the HS-SPME-GC×GC-TOFMS analysis of Minglvye Baijiu

圖2 明綠液酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析節選相同出峰時間的化合物及其解卷積質譜Fig.2 HS-SPME-GC×GC-TOFMS analysis of Minglvye Baijiu selected compounds with the same peak time and their deconvoluted mass spectra

采用2.2.4所述的多級鑒定策略,為了更全面地獲得明綠液酒中的揮發性組分,對明綠液原酒和成品酒樣品分別分析,并對其中鑒定出的組分取并集。最終在明綠液酒中鑒定出810種揮發性化合物,其中直接通過自建的白酒揮發性風味數據庫鑒定出組分789種,通過商業化數據庫檢索到21種在明綠液酒中新發現的化合物,查找它們的理化信息,并通過文獻和Flavornet、Flavor DB等網站的查詢,收集這些化合物的香氣描述,補充到白酒揮發性風味數據庫中。在鑒定出的揮發性組分中有386種化合物檢索到了香氣描述,為明綠液酒中潛在的香氣活性組分,其中包括酯類113種,醛酮類58種,芳香族化合物51種,醇類49種,萜烯類32種,呋喃類25種,有機酸類20種,含硫香氣化合物12種,吡嗪類香氣化合物8種,酚類香氣化合物7種,內酯類香氣化合物4種和其他香氣化合物7種。其中直接通過自建的白酒揮發性風味數據庫檢索到香氣組分376種,補充的新的化合物10種,其理化信息和風味信息如表1所示。將具有相同或相似香氣特征的香氣活性成分歸類整理形成如圖3所示的明綠液酒香氣化合物分類圖,其中鑒定的香氣活性成分主要可以提供水果香、青香、酸、溶劑、奶油、木香、烘烤、煮蔬菜、煙熏等香氣,也說明明綠液酒整體香氣特征可能是由多種香氣活性成分共同作用形成的復合香氣。

表1 自建風味數據庫補充明綠液酒中獨特風味物質信息Table 1 Chinese Baijiu Flavor Library to supplement unique information of aroma compounds in Minglvye Baijiu

圖3 明綠液酒香氣化合物分類及部分化合物結構式Fig.3 Classification and structural formula of aroma compounds in Minglvye Baijiu

通過自建的白酒揮發性風味數據庫,可以更快地明確明綠液酒的香氣組分特征,并與其豆香清雅的感官獨特風格相關聯。明綠液酒中酯類香氣化合物的種類最多,主要呈現愉悅的青香、水果香的香氣特征,對形成明綠液酒復雜的香氣輪廓具有重要的貢獻,其中順-3-己烯基丁酯在其他白酒中沒有檢測到,主要呈現青香的風味；苯甲酸正戊酯和乙酸香葉酯在其他濃香型白酒中沒有檢測到,主要呈現果香、青香的風味,可能是明綠液酒中獨特的酯類化合物。芳香族化合物在明綠液酒中的種類也較多,主要提供花香、香料類的香氣,從而增加明綠液酒香氣的復雜性,如苯甲醇、苯乙醇為明綠液酒帶來青香和花香,而苯甲醛、苯乙醛貢獻了類似苦杏仁的香氣特征。醇類化合物也是風味物質中重要的一類,本研究共檢測到49種,含有17種不飽和脂肪醇,主要貢獻果香、青香的風味,其中(Z)-3-己烯醛在其他白酒中未見報道,貢獻了青草類的青香；反式、順式-2,6-壬二烯醇為明綠液酒帶來了類似黃瓜的香氣。吡嗪類香氣化合物中2-甲氧基-3-異丁基吡嗪和2-甲氧基-3-異丙基吡嗪,具有明顯的豆類青香,這類甲氧基吡嗪在其他白酒中未見報道[25],但在葡萄酒中的研究較多,主要呈現“土豆、豌豆、青椒”的香氣且香氣閾值很低[26],葡萄酒中的這類組分是由原料葡萄帶來,因此明綠液酒中的這類物質可能也是由于原料綠豆蒸煮產生。明綠液酒中的酚類香氣化合物主要有愈創木酚、4-甲基愈創木酚、4-乙基愈創木酚、苯酚、4-乙基苯酚、丁香酚和甲基丁香酚,其中4-甲基愈創木酚和4-乙基愈創木酚屬于烷基愈創木酚類,呈現出香瓜香、發酵大豆香、甜香的風味[27],且閾值較低；丁香酚和甲基丁香酚分別呈現甜香、肉桂的風味,在自建的白酒揮發性風味數據庫中沒有收集,可能是明綠液酒中獨特的風味組分。明綠液酒中的萜烯類化合物也同樣很重要,且種類比較豐富(32種),主要以單萜和倍半萜的形式存在于酒體中,通常具有愉悅的花香、木香、藥香且香氣閾值較低,對明綠液酒香氣特征的復雜性具有重大的貢獻,其中樟腦、4-萜烯醇、異佛爾酮、茴香腦、和α-姜黃烯等物質還具有一定的生理功能[28]。

2.2 綠豆揮發性香氣物質與明綠液酒風味關聯分析

為了進一步明晰明綠液酒中獨特香氣成分的來源,采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS方法對蒸煮綠豆進行定性分析,共識別出1 815個色譜峰。依照多級鑒定策略,首次在蒸煮綠豆中鑒定出335種揮發性化合物,有262種化合物具有香氣貢獻,為綠豆中的潛在香氣活性組分,其中不同類別的化合物種類分布如圖4所示。醛酮類化合物是綠豆蒸煮香氣組分中種類最多(共檢測到65種)、含量最高(占香氣總含量的39.2%)的一類化合物,包括酮類化合物31種,醛類化合物34種。醛類化合物中的直鏈飽和脂肪醛類從乙醛到十二醛均有檢測出,其中大多呈現出類似青草、麥芽等香氣[29]；支鏈飽和脂肪醛類檢測出的有2-甲基丙醛和2-甲基丁醛,其中2-甲基丁醛的相對含量在所有檢出風味組分中最高,主要呈現豆類、堅果的香氣；檢測到的不飽和脂肪醛分別有2-丁烯醛、(E)-2-戊烯醛、2-己烯醛、(Z)-3-己烯醛、(E)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E)-2-壬烯醛,多呈青香、果香和甜香；多不飽和脂肪醛有2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛這3種,其中(E,E)-2,4-庚二烯醛的相對含量較高,呈現出脂肪的香氣。綠豆中富含脂肪,而蒸糧過程會加速脂肪的氧化[30],可能造成了脂肪醛物質的產生,明綠液酒中也含有很多在蒸煮綠豆中檢測到的脂肪醛,因此綠豆蒸煮過程促進產生的醛類物質被帶入到了酒中,豐富了明綠液酒的揮發性風味物質種類。

圖4 HS-SPME-GC×GC-TOFMS定性蒸煮綠豆揮發性組分Fig.4 Qualitative volatile compounds of cooked mung bean by HS-SPME-GC×GC-TOFMS

進一步將蒸煮綠豆中鑒定出的香氣組分和明綠液酒中的組分進行關聯分析,列出其中幾類比較特殊的共有香氣組分如表2所示,可以看出,明綠液酒的獨特風格與其原料密切相關。共同檢出的呋喃類化合物有9種,主要呈現焦糖、焙烤的香氣,2-乙基呋喃在蒸煮綠豆中的相對含量較高。

表2 明綠液酒和蒸煮綠豆中共有的幾類香氣化合物Table 2 Several common aroma compounds in Minglvye Baijiu and cooked mung bean

共同檢出的含氮化合物8種,包括5種吡嗪類化合物和3種吡啶類化合物,主要呈現堅果、可可的香氣,其中的2-甲氧基-3-異丁基吡嗪和2-甲氧基-3-異丙基吡嗪,呈現出豆類的青香,且這2種甲氧基吡嗪是明綠液酒中比較獨特的風味物質。共同檢出的含硫化合物9種,主要呈現烤肉、菜葉的香氣,明綠液酒中特殊的含氮、含硫化合物可能與其綠豆原料帶來的豐富蛋白質有關。在明綠液酒和蒸煮綠豆中檢測出來比較特殊的酚類香氣物質有丁香酚和甲基丁香酚,主要呈現出甜香、木頭的風味,在其他白酒中沒有報道。

3 結論

本文以綠豆釀造的明綠液酒為研究對象,采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS技術系統分析了其中揮發性組分特征,結合自建的白酒揮發性風味數據庫,快速準確地鑒定出來揮發性組分810種,潛在香氣活性組分386種,表明明綠液酒整體香氣是由多種香氣活性成分共同作用形成的。將鑒定結果與白酒揮發性風味數據庫相比較,為數據庫補充了21種揮發性組分,其中包括10種潛在的香氣組分。并快速獲得了明綠液酒中的獨特風味物質,包括此前在白酒中沒有報道過的,主要呈現青香特征的2-甲氧基-3-異丁基吡嗪和2-甲氧基-3-異丙基吡嗪,檢索這些組分的理化信息和風味信息補充到了白酒揮發性風味數據庫中。為進一步探究這些獨特香氣物質的來源,對明綠液酒的綠豆原料蒸煮后分析,通過HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析技術,在蒸煮綠豆中鑒定出揮發性組分335種,潛在香氣活性組分262種,其中呈青香、甜香的醛類化合物種類最多。在蒸煮綠豆中鑒定出許多明綠液酒中的獨特香氣組分,包括甲氧基吡嗪和丁香酚等物質,證明明綠液酒的獨特風格與其原料密切相關。