紫云英苷對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化及AMPK/Nrf2通路的影響

邵會(huì)敏，曹新?tīng)I(yíng)，劉志亮，徐英利，魏國(guó)清

慢性心力衰竭是由結(jié)構(gòu)異常、功能障礙、代謝紊亂和/或藥物刺激引起的復(fù)雜疾病，是各種心血管疾病的最終臨床表現(xiàn)，心力衰竭發(fā)展的基本機(jī)制是心室重構(gòu)[1]。心室重構(gòu)是指由心肌損傷及壓力和容量超負(fù)荷變化引起的心室質(zhì)量、大小和形狀的變化。心室重構(gòu)主要包括心肌細(xì)胞和間質(zhì)的重建。心肌間質(zhì)重構(gòu)是指心肌細(xì)胞外基質(zhì)的變化，包括成纖維細(xì)胞增生和纖維化，血管結(jié)構(gòu)變化及細(xì)胞外基質(zhì)和膠原網(wǎng)絡(luò)的體積和組成變化[2-3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是一種動(dòng)態(tài)而穩(wěn)定的細(xì)胞器，參與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成及Ca2+濃度的調(diào)節(jié)。細(xì)胞暴露于缺氧或某些化學(xué)治療藥物會(huì)導(dǎo)致未折疊蛋白質(zhì)的積累和鈣穩(wěn)態(tài)的改變，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。ERS激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，這是一種代謝敏感的蛋白激酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和新陳代謝[4]。ERS還以依賴性方式誘導(dǎo)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)核易位，激活A(yù)MPK和Nrf2可以減少心肌纖維化損傷并改善心臟功能[5-6]。紫云英苷是一種黃酮類化合物，對(duì)多種人類疾病均顯示出治療功效[7]。研究證明，紫云英苷對(duì)脂多糖誘發(fā)的大鼠小腸上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)模型具有明顯抗炎作用[8]。此外，紫云英苷可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲[9]。但是，對(duì)于慢性心力衰竭、心肌纖維化，紫云英苷是否具有治療作用尚未有研究。本研究擬探討紫云英苷對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化的作用及AMPK/Nrf2通路的影響，為慢性心力衰竭的治療提供理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 (1)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄不限，8周齡，體質(zhì)量220～280 g，購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2019-0001，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2019-0012，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SD531107，大鼠置于(25±1)℃、60%濕度的受控環(huán)境中，12 h明/暗循環(huán)，可自由飲水。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：倫理LD2020-067)。(2)試藥試劑：紫云英苷(原料藥，純度≥98%，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司)；卡托普利片(中美上海施貴寶制藥有限公司)；馬森(Masson)染色試劑盒、蘇木素—伊紅(HE)染色試劑盒(上海科匯生物技術(shù)有限公司)；TRIzol試劑、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)、RIPA裂解緩沖液(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)EMD Millipore公司)；兔抗鼠AMPK抗體、兔抗鼠Nrf2抗體、兔抗鼠GAPDH抗體、兔抗鼠二抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(英國(guó)Amersham公司)；(3)儀器：彩色多普勒超聲診斷儀(深圳開(kāi)立生物醫(yī)療科技股份有限公司，型號(hào)M22)；顯微鏡(蘇州瑞文光電科技有限公司，型號(hào)RWOPTICS MX50M)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)Applied Biosystems公司，型號(hào)7900HT)；凝膠成像分析系統(tǒng)(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司，型號(hào)CDD1-BOT-860)。

1.2 造模方法與分組 2020年8—9月于華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，參照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行慢性心力衰竭造模：大鼠腹膜內(nèi)注射水合氯醛(10%)麻醉，仰臥固定于手術(shù)床，切開(kāi)心包暴露心臟，4-0縫線針穿過(guò)左心耳下方2～3 mm， 結(jié)扎時(shí)放置1.5 mm直徑乳膠管，擰緊結(jié)扎阻塞流向冠狀動(dòng)脈的血流，從而引起心肌缺血；0.5 h后釋放結(jié)扎線，進(jìn)行2 h血液灌流，形成慢性心力衰竭模型；另選取12只大鼠作為空白對(duì)照組(不進(jìn)行任何處理)。造模大鼠心功能指標(biāo)左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)水平較空白對(duì)照組明顯升高，左心室短軸縮短率(FS)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)水平較空白對(duì)照組明顯降低，說(shuō)明建模成功；將造模成功的48只大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、卡托普利組(10 mg/kg與生理鹽水制成濃度為1 mg/ml 溶液，灌胃體積10 ml/kg)[11]、紫云英苷低劑量組(25 mg/kg與生理鹽水制成濃度為2.5 mg/ml溶液，灌胃體積10 ml/kg)、紫云英苷高劑量組(50 mg/kg與生理鹽水制成濃度為5 mg/ml的溶液，灌胃體積10 ml/kg)[12]，每組12只； 空白對(duì)照組和模型組灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥4周。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 大鼠心功能指標(biāo)測(cè)定：連續(xù)給藥4周后，采用彩色多普勒超聲診斷儀檢查和計(jì)算大鼠LVEF、FS、LVESD和LVEDD水平。

1.3.2 大鼠心肌纖維化程度測(cè)定： 頸椎脫臼處死大鼠，取大鼠左心室組織，4%多聚甲醛中固定48 h，乙醇脫水，石蠟包埋，切成5 μm薄片、Masson染色，置于顯微鏡下觀察，然后采用電腦圖像分析系統(tǒng)自動(dòng)測(cè)量心肌間質(zhì)膠原面積、視野心肌組織總面積、血管周圍膠原面積、血管管腔面積，計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)和血管周圍膠原面積與血管管腔面積比值(PVCA/LA)[13]，CVF=心肌間質(zhì)膠原面積/視野心肌組織總面積×100%，PVCA/LA=血管周圍膠原面積/血管管腔面積×100%，CVF、PVCA/LA水平越高，說(shuō)明組織纖維化程度越重。

1.3.3 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察： 取大鼠心肌組織，于4%多聚甲醛中固定48 h，將組織進(jìn)行乙醇脫水，石蠟包埋，然后切成薄片(5 μm)，HE染色以進(jìn)行組織學(xué)分析。

1.3.4 心肌組織AMPK、Nrf2 mRNA水平測(cè)定： 裂解心肌細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取心肌組織總RNA，使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA(1 μg)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)和SYBR Premix Ex Taq進(jìn)行PCR反應(yīng)。AMPK、Nrf2、GAPDH引物由美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司合成，序列如下：AMPK上游5’-TGACAATGCCGTCTGAACTG-3’，AMPK下游5’-CATCACCATCGCAAGGAACT-3’；Nrf2上游5’-GTGACTTGCCGTCTGGGTGAC-3’，Nrf2下游5’-TGTGTGACCATCGCAAGGGTG-3’；GAPDH上游5’-ATTCGCAGGTACTTGCCT-3’，GAPDH下游5’-CGGATGGCCTAACTCCTG-3’。 熱循環(huán)條件：在94℃初始變性2 min；隨后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)：95 ℃ 30 s，57.5 ℃ 30 s和72 ℃ 60 s；最后在72℃延伸10 min。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)mRNA表達(dá)水平。

1.3.5 心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平測(cè)定： 使用RIPA裂解緩沖液裂解處理過(guò)的心肌組織，使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度，電泳分離蛋白質(zhì)10 μg，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在37 ℃下用5%牛血清白蛋白封閉2 h后，將膜與一抗[兔抗鼠AMPK抗體(1∶500)、兔抗鼠Nrf2抗體(1∶1 000)、兔抗鼠GAPDH抗體(1∶1 000)]一起孵育過(guò)夜，加入二抗(1∶3 000)并孵育2 h，使用增強(qiáng)ECL溶液檢測(cè)抗原—抗體條帶，使用Bio-Rad軟件通過(guò)光密度分析進(jìn)行條帶的定量，GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠LVEDD、LVESD水平升高，F(xiàn)S、LVEF水平降低(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組及紫云英苷高、低劑量組大鼠LVEDD、LVESD水平降低，F(xiàn)S、LVEF水平升高(P<0.05)；紫云英苷高劑量組大鼠LVEDD、LVESD水平低于紫云英苷低劑量組，F(xiàn)S、LVEF水平高于紫云英苷低劑量組(P<0.05)；卡托普利組和紫云英苷高劑量組大鼠LVEDD、LVESD、FS、LVEF水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較

2.2 各組大鼠心肌纖維化程度比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠CVF、PVCA/LA水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組、紫云英苷各劑量組大鼠CVF、PVCA/LA水平降低(P<0.05)；紫云英苷高劑量組大鼠CVF、PVCA/LA水平低于紫云英苷低劑量組(P<0.05)；卡托普利組和紫云英苷高劑量組大鼠CVF、PVCA/LA水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌纖維化程度比較

2.3 各組大鼠心肌病理結(jié)構(gòu)比較 空白對(duì)照組心肌結(jié)構(gòu)正常；模型組心肌橫紋紊亂，心肌組織纖維化明顯，有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；卡托普利組及紫云英苷高、低劑量組心肌組織纖維化程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，心肌纖維排列整齊，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌病理結(jié)構(gòu)比較(HE染色，×200)

2.4 各組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA水平降低(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組、紫云英苷各劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA水平升高(P<0.05)；紫云英苷高劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA水平高于紫云英苷低劑量組(P<0.05)；卡托普利組和紫云英苷高劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA水平比較

2.5 各組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組、紫云英苷各劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平升高(P<0.05)；紫云英苷高劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平高于紫云英苷低劑量組(P<0.05)；卡托普利組和紫云英苷高劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4、圖2。

表4 各組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2蛋白水平比較

注:A.空白對(duì)照組;B.模型組;C.卡托普利組;D.紫云英苷低劑量組;E.紫云英苷高劑量組

3 討 論

紫云英苷已被證明可通過(guò)改善內(nèi)皮功能，抑制炎性細(xì)胞因子，增強(qiáng)一氧化氮合成，恢復(fù)受損的自主神經(jīng)功能，逆轉(zhuǎn)慢性心力衰竭病理性心肌重構(gòu)，并抑制心肌細(xì)胞凋亡[14]。心肌纖維化是心臟代償失調(diào)和心力衰竭的主要原因[15]。有研究表明，紫云英苷能夠改善心力衰竭大鼠心功能和心臟膠原蛋白水平[16]。本結(jié)果顯示，模型組大鼠LVEDD、LVESD、CVF、PVCA/LA水平高于空白對(duì)照組，F(xiàn)S、LVEF水平低于空白對(duì)照組；紫云英苷低、高劑量組大鼠LVEDD、LVESD、CVF、PVCA/LA水平低于模型組，F(xiàn)S、LVEF水平高于模型組；且紫云英苷高劑量組大鼠上述指標(biāo)優(yōu)于紫云英苷低劑量組。表明紫云英苷對(duì)慢性心力衰竭大鼠心功能指標(biāo)和心肌纖維化程度均有明顯改善作用。本結(jié)果顯示，模型組心肌橫紋紊亂，心肌組織纖維化明顯，有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；卡托普利、紫云英苷干預(yù)后，心肌組織纖維化程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，心肌纖維排列整齊。表明紫云英苷對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化具有明顯抑制作用。

Nrf2在緩解各種由炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激引起的疾病(如慢性阻塞性肺疾病、哮喘)中起關(guān)鍵作用[17-18]。在正常生理?xiàng)l件下，Nrf2結(jié)合到細(xì)胞質(zhì)中Kelch樣環(huán)氧氯丙胺相關(guān)蛋白1(Keap1)上，并通過(guò)遍在蛋白—蛋白酶體途徑降解[19]。然而，暴露于應(yīng)激源和誘導(dǎo)劑后，Keap1中釋放的Nrf2易位到細(xì)胞核中，導(dǎo)致各種細(xì)胞的保護(hù)性基因表達(dá)，與保守的抗氧化劑反應(yīng)元件結(jié)合。在此過(guò)程中，AMPK介導(dǎo)了糖原合成酶激酶3β的失活，從而增加了Nrf2的細(xì)胞核積累[20]。AMPK是細(xì)胞代謝的關(guān)鍵能量傳感器，它參與代謝應(yīng)激，包括神經(jīng)變性、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激[21]。此外，研究表明[22]，AMPK作為炎性反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)劑，在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中起保護(hù)作用。近期研究表明，心肌纖維化可能通過(guò)誘導(dǎo)過(guò)多的心肌ERS引起心肌損害，檢測(cè)ER相關(guān)蛋白的表達(dá)水平可能反映心肌纖維化對(duì)心肌損害的程度[23]。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平低于空白對(duì)照組；紫云英苷低、高劑量組大鼠心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平高于模型組；且紫云英苷高劑量組高于紫云英苷低劑量組，表明紫云英苷可能通過(guò)促進(jìn)心肌組織中AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)激活A(yù)MPK/Nrf2通路進(jìn)而減輕心肌纖維化程度。有研究發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)MPK信號(hào)通路可顯著改善心臟功能，減少細(xì)胞凋亡，抑制ERS并減輕心肌缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌損害[24]。生長(zhǎng)激素釋放肽(ghrelin)是一種心臟保護(hù)肽，它通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路并抑制ERS誘導(dǎo)的損傷和凋亡來(lái)保護(hù)心臟免受缺血/再灌注損傷[25]；金絲桃苷通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路增加心肌三磷酸腺苷水平，減少心肌的氧化損傷及心肌細(xì)胞的凋亡[26]，與本結(jié)果一致。

綜上所述，紫云英苷可改善慢性心力衰竭大鼠心功能，減輕心肌纖維化程度，其機(jī)制可能與紫云英苷激活A(yù)MPK/Nrf2通路有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

邵會(huì)敏：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；曹新?tīng)I(yíng)：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；劉志亮：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；徐英利：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；魏國(guó)清：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫(xiě)