野生二粒小麥NBS-LRR類抗病基因家族的鑒定及其表達分析

李 爽，高 英，楊 光，聶小軍，宋衛寧

(西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100)

在漫長的進化過程中，植物形成了一系列復雜的防御機制來抵抗環境中的真菌、細菌、病毒等病原物[1]。抗病基因(R)可以直接或間接地通過基因和基因之間的相互作用特異性識別病原物，然后產生并傳遞脅迫信號，引起防御響應，并激活下游通路[2]。因此，R基因在植物免疫系統和防御機制中發揮著至關重要的作用。大部分植物的R蛋白都含有核苷酸結合位點(nucleotide binding site，NBS)和富含亮氨酸的重復序列(leucine rich repeat，LRR)，屬于NBS-LRR 基因家族。同時，一些R基因蛋白也包含Toll-白細胞介素-1受體結構域(TIR，與果蠅Toll蛋白和哺乳動物白細胞介素-1受體的細胞質結構域同源)、卷曲螺旋(coiled-coil，CC)或亮氨酸鏈式(leucine zipper，LZ)結構域、跨膜結構域(transmembrane domain，TM)、蛋白激酶結構域(protein kinase domain，PK)等[3]。根據所含結構域的不同，可以將R基因分為兩大類: NBS-LRR類和非NBS-LRR類[4]。 NBS-LRR類R基因在植物的R基因中占比最高，主要由高度保守的NBS和LRR兩部分組成，同時還含有P-loop、Kinase-2、Kinase-3、GLPL等4個保守結構域。根據N端結構的不同，NBS-LRR基因可以分為TIR類、CC(或LZ)類和non-motif類[5]。前人圍繞NBS-LRR類R基因已開展了大量研究，不僅在全基因組水平上對其組成和結構特征進行了分析，而且多個重要的NBS-LRR類R基因已經被成功克隆[6-7]。在小麥基因組中，共鑒定出400多個NBS-LRR類R基因[6]，其中，大部分與抗條銹病相關。截止目前，從普通小麥及其近緣種中已成功克隆出9個R基因，其中有6個R基因具有種屬特異性抗性[8]。同時，在全基因組水平鑒定和分析NBS-LRR類R基因家族已在多個植物中完成，包括擬南芥、烏拉爾圖小麥、向日葵等[9-13]。

野生二粒小麥是普通小麥A、B染色體組的供體，具有抗病、粒大、蛋白質含量高等重要特征，對改良小麥的抗病性具有重要價值。雖然R基因家族在多個植物(包括小麥)中已有大量研究，但是目前有關野生二粒小麥R基因的研究還比較少。野生二粒小麥全基因組的破譯為從全基因組水平上鑒定其NBS-LRR類R基因家族提供了可能[14]。因此，本研究擬利用最新發布的野生二粒小麥基因組信息，通過生物信息學分析方法，在全基因組水平上對其R基因進行鑒定，分析其成員間的系統進化關系，并利用RNA-seq數據對其表達特性進行分析，以期為研究野生二粒小麥R基因的系統進化關系及其生物學功能奠定基礎，也為利用野生二粒小麥R基因改良小麥抗病性提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用野生二粒小麥品系A9由本實驗室保存，白粉菌菌株E09由西北農林科技大學農學院韓德俊教授提供。

1.2 研究方法

1.2.1 野生二粒小麥NBS-LRR類R基因家族的鑒定

從Ensemble數據庫(http://plants.ensembl.org/index.html)下載野生二粒小麥的基因組信息及其蛋白序列，構建本地蛋白信息庫；然后，下載擬南芥、水稻和普通小麥中已知的R基因序列作為探查序列，使用本地BLASTP程序進行搜索(E值<1e-5，一致性>50%，覆蓋度>50%)；利用擬南芥和水稻中已鑒定的R基因序列構建HMM模型，使用hmmsearch工具搜索本地蛋白質數據庫；將HMMER和BLASTP的結果合并，手工去除冗余后，將得到的序列提交到NCBI Batch CD搜索數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和PFAM數據庫(http://pfam.xfam.org/)確認結構域的有無及其完整性，只保留具有完整NBS和LRR結構域的基因作為候選R基因；在此基礎上，利用NCBI收錄的野生二粒小麥EST序列，對候選R基因比對映射，最后保留具有EST序列支持的基因作為最終的野生二粒小麥R基因集，用于下游分析。使用在線數據庫ExPASy中的pI/Mw工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)計算預測的R蛋白的理論等電點(pI)和分子量(Mw)。

1.2.2 野生二粒小麥NBS-LRR類R基因的系統發育分析及序列特征分析

利用ClustalX工具對鑒定到的NBS-LRR類基因的蛋白序列進行多序列比對；利用MEGA 6.0軟件的NJ法(Neighbor-Joining method)構建系統進化樹，Bootstrap值設為1 000，其他參數為默認值。從Ensemble植物數據庫(http://plants.ensembl.org/index.html)中下載野生二粒小麥的基因組注釋信息gtf文件，使用perl腳本提取NBS-LRR類R基因的結構信息，然后提交到Gene Structure Display Server(GSDS)網站(http：/gsds.cbi.pku.edu.cn/)上，構建其內含子-外顯子結構示意圖；使用MEME軟件(http://meme-suite.org)預測這些基因的蛋白結構域和保守基序，預測基序數量設置為15個，其他參數設定為默認值。

1.2.3 野生二粒小麥NBS-LRR類R基因染色體定位及上游順式作用元件分析

利用Tbtools提取鑒定到的所有NBS-LRR類R基因CDS序列上游的2 000 bp序列，利用PlantCARE在線數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Plantcare/html/)預測其順式作用元件。

1.2.4 野生二粒小麥NBS-LRR類R基因的表達模式分析

為了初步明確這些NBS-LRR類R基因在不同組織和不同時期中的表達特性，從NCBI SRA數據庫下載野生二粒小麥的RNA-seq測序數據(SRA檢索序列號為：ERP022006)，包括穎片、外稃、根、花(105和112 d)、籽粒(123和134 d)、葉(54和77 d)；利用TopHat和Cufflinks軟件計算每個基因的FPKM值，然后使用R軟件中的heatmap包繪制熱圖。

1.2.5 野生二粒小麥NBS-LRR類R基因的qRT-PCR分析

隨機選擇4個野生二粒小麥NL類R基因(TRIDC1BG003060、TRIDC7BG071700、TRIDC- 5BG013030、TRIDC1BG002860)用于驗證其在白粉菌侵染下的表達特性，根據其cDNA序列設計引物。將野生二粒小麥品系A9種植于營養缽，并置于23±1 ℃的培養箱中培養，光周期為16 h光照/8 h黑暗；當植物長至兩葉一心期時，接種白粉菌菌株E09，以未經處理的幼苗作為對照。在處理后0、6、12、24、48和72 h收集處理及對照條件下的葉片，3次生物學重復，液氮冷凍后存于-80 ℃冰箱，備用；使用Plant RNA Kit試劑盒(Omega Bio-Tek，USA)提取樣品的總RNA，用 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性；利用TaKaRa的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time) 反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)熒光定量試劑盒做qRT-PCR分析，每個樣品設置3個生物學重復和3個技術重復，具體操作參考Lei等[15]的方法。

2 結果與分析

2.1 野生二粒小麥NBS-LRR類R基因家族的鑒定結果

利用BLASTP和HMMER工具搜索，并結合保守結構域以及EST序列驗證，在野生二粒小麥基因組中共鑒定到429個可信度較高的NBS-LRR類R基因，約占總基因數的0.69%。序列特征分析發現，野生二粒小麥NBS-LRR類R基因的蛋白序列長度為303～1 594 aa，蛋白分子量為33.38～177.68 kD，理論等電點為5.12～ 9.34，表明不同成員間具有較大的理化特性差異；進一步對這些基因所包含的保守結構域進行分析，發現66個蛋白只含有NBS結構域，屬于N亞家族；205個蛋白包含有CC-NBS-LRR結構域，屬于CNL亞家族；76個蛋白具有NBS-LRR結構域，屬于NL亞家族；79個蛋白具有CC-NBS結構域，屬于CN亞家族；3個蛋白具有RPW8-NBS結構域，屬于PN亞家族(表1)。

2.2 野生二粒小麥NBS-LRR類NL亞家族R基因的染色體定位及系統發育分析

鑒于NL亞家族R基因在植物抗病上的主要作用，主要以NL亞家族R基因為對象，進行進一步的分析。結果發現，野生二粒小麥的76個NL亞家族基因在所有染色體上都有分布，其中6B染色體上最多，達到22個，其次為1B、4A和6A染色體；同時，還發現NL亞家族基因在染色體上呈現出成簇存在的特性，推測這可能是由于發生了大量的基因復制造成的。在A和B兩個同源染色體組之間，NL基因的數量差異不大，分別有37和39個。

表1 野生二粒小麥以及其他部分植物NBS-LRR類R基因各亞家族成員的數量Table 1 Distribution of the subfamilies of NBS-LRR type R genes in wild emmer wheat and other plant species

為了初步明確野生二粒小麥NL亞家族成員間的系統進化關系，進一步將這76個基因的全長蛋白序列進行多序列比對，并構建系統發育樹(圖1)。根據系統進化關系，可將這76個NL亞家族基因劃分成6類，其中第Ⅰ類基因數目最多，有30個，III類次之，有20個，其余Ⅱ、IV、V和VI類分別有9、5、4和8個。

2.3 野生二粒小麥NL亞家族R基因的蛋白結構域與上游順式作用元件分析

進一步對這些NL蛋白上的蛋白結構域基序進行預測，結果共預測到20個保守的蛋白結構域(圖2)，其中基序2、13、15和18最為保守，位于基因的末端；所有的R基因均包含有基序2，基序4在R基因中一般連續重復出現。結合系統進化樹，發現在進化樹上聚為一類的基因通常也具有相同或相似的保守結構域，推測親緣關系較近的蛋白可能具有相似的生物學功能。基因結構分析發現，這些NL亞家族基因大部分都包含1～3個內含子，另外，包含的基序越多，它們的基因結構越復雜。

上游順式作用元件分析結果發現，這些NL亞家族基因啟動子序列主要包含響應植物激素、調節植物生長發育和響應生物和非生物脅迫相關的順式作用元件(圖3)。其中，響應植物激素的順式作用元件種類最多，有9類，包括TATC框(TATC-box)、茉莉酸甲酯響應元件(CGTCA-motif)、水楊酸響應元件(TCA-element)等，并且所有基因均含有響應植物激素的順式作用元件，除TRIDC3AG061190只包含TCA-element元件外，其余75個基因均含有2個以上的激素響應元件，而且58個NL基因還含有與MeJA合成相關的CGTCA-motif和 TGACG-motif元件；脅迫響應順式作用元件有5類，包括干旱誘導元件(MBS)、光響應元件(ARE)和逆境防御響應元件(TC-rich)等。說明NL亞家族基因在調節激素、環境脅迫響應和耐受性方面存在廣泛的潛在作用。

2.4 野生二粒小麥NL亞家族R基因的表達模式

基于RNA-seq數據對野生二粒小麥NL亞家族R基因的表達特性進行初步分析。結果(圖4)表明，部分基因表現出組織特異性，比如TRIDC1BG002710、TRIDC2AG002690、TRID-C2AG004570、TRIDC2 BG086110、TRIDC4AG070-760、TRIDC5BG 004360、TRIDC6BG001800、TRID-C6BG068140、TRIDC6BG073310、TRIDC7AG047320等10個基因都只在105 d的花瓣中表達，且表達量非常高，這說明這幾個基因對于花瓣的生長發育有重要作用。另外，在不同的組織中表達基因的數量均有差異，在穎片，外稃，根中分別有31、49和58個基因發生了表達。在花組織中，105 d有65個基因表達，而112 d則只有41個基因表達。在籽粒中，123 d和134 d分別有38和53個基因表達。在葉組織中，54 d和77 d分別有48和52個基因表達。這些結果均表明，NL亞家族R基因在野生二粒小麥中發生了時空表達差異。

2.5 部分NL類R基因表達特性的驗證

隨機選取4個NL類R基因(TRIDC1BG-003060、TRIDC7BG071700、TRIDC5BG013030和TRIDC1BG002860)，對其在白粉菌侵染條件下的表達模式進行驗證。結果如表2所示，這4個基因整體上均呈現先下降后上升的表達模式，在接種24 h內它們的表達量都有下降，在接種48 h后其表達量明顯上升，其中TRIDC1BG002860在48和72 h時，其表達量分別是對照的4.5和5.8倍。推測其原因可能是這些R基因參與了野生二粒小麥的抗病響應過程。

表2 4個NL亞家族R基因在白粉病侵染不同時間的表達量Table 2 Relative expression level of the four R genes belonging to NL subfamily under Bgt infection at different time

3 討 論

小麥是我國乃至全世界最重要的糧食作物之一，小麥的持續增產和穩產對保障世界糧食安全具有重要意義[16]。當前，隨著全球氣候變化，小麥生長過程中面臨著諸多挑戰(生物脅迫如病蟲害，非生物脅迫如干旱脅迫、鹽脅迫等)。但由于植物馴化和人工選擇的影響，大大限制了現代農作物的遺傳多樣性，使得栽培小麥對脅迫更加脆弱和敏感。野生二粒小麥是普通栽培小麥的野生近緣祖先種，具有粒大、蛋白含量高、抗病性強、耐逆性好等優異性狀，并且野生二粒小麥具有豐富的遺傳多樣性。加強野生二粒小麥優異性狀基因的挖掘與利用對提高小麥抗逆性以應對各類脅迫和逆境具有重要意義，從而保障小麥生產水平和糧食安全[17]。

NBS-LRR類R基因是植物抗病機制中具有關鍵作用的重要基因，且大量的研究表明，其參與了小麥對多種病原菌的抗性反應[1,18-19]。本研究基于野生二粒小麥的基因組數據，利用生物信息學手段，對野生二粒小麥的NBS-LRR類R基因進行了系統的研究。通過對野生二粒小麥基因組的篩選和驗證，剔除NB-ARC結構不完整的基因，共鑒定到了429個野生二粒小麥NBS-LRR基因，豐富了麥類作物R基因資源。擬南芥基因組中有170個NBS-LRR類基因，其中TNL亞家族基因的數量為79個，遠多于CNL等其他亞家族基因[11]，而在小麥[6,20]、水稻[21]、玉米[12]、狗尾草(Setariaitalica)[22]以及野生二粒小麥等單子葉植物中，CNL亞家族成員基因的數量最多，未鑒定到TNL亞家族基因，推測R基因在單子葉和雙子葉植物進化過程中發生了明顯的分化。

基因的結構往往決定基因的功能。本研究發現，野生二粒小麥NBS-LRR類基因結構較為簡單，外顯子為1～4個，內含子為1～3個，這與栽培六倍體小麥[23]和烏拉爾圖小麥[11]中R基因的結構特征類似。蛋白結構分析發現，親緣關系越近的R基因具有更相似的保守結構域組成，推測它們具有相似的功能，這與報道的其他物種中R基因的家族特征一致[11-12]。

研究發現，R基因可與多個抗病相關的基因互作，共同構建植物抗逆機制網絡[24]。除此之外，R基因還廣泛參與了植物體內諸多其他生物學過程，在生長發育、環境適應、逆境響應等過程中發揮了一定作用[1,25]。在本研究中，基于RNA-seq的表達模式分析發現，在野生二粒小麥的不同組織和生長時期參與的R基因數量不同。進一步深入研究這些特異表達的R基因的生物學功能，將為闡明R基因的更多調控功能及其作用機制提供重要信息。最后，本研究采用qRT-PCR的方法，對侵染白粉病的野生二粒小麥葉片中4個R基因的表達模式進行了試驗驗證，結果發現，這4個R基因在白粉病的抗性響應過程中表達量發生了變化，說明它們可能參與了野生二粒小麥對白粉菌的抗病應答過程，但其具體生物學功能還有待進一步研究。