腐植酸對(duì)干旱脅迫下燕麥葉片碳同化酶活性及產(chǎn)量的影響

朱珊珊,米俊珍,趙寶平,孫夢(mèng)媛,李英浩,劉景輝

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

燕麥?zhǔn)俏覈?guó)特色糧飼兼用型作物，具有營(yíng)養(yǎng)成分高，抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)西北、華北、西南等干旱半干旱少雨地區(qū)種植面積較大，干旱是限制其生長(zhǎng)發(fā)育和高產(chǎn)的重要因素[1]。干旱脅迫會(huì)抑制作物旗葉光合作用的酶活性[2]，影響光合碳同化，導(dǎo)致作物減產(chǎn)[3]。嚴(yán)重干旱會(huì)導(dǎo)致植物葉片碳同化酶活力降低[4-5]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)可通過(guò)植物內(nèi)部釋放的二氧化碳和氮來(lái)提供碳骨架以進(jìn)行生物合成，緩解干旱脅迫[6-7]。光合產(chǎn)物的積累量和作物產(chǎn)量與其葉片中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPD)和乙醇酸氧化酶(GO)活性有關(guān)[4,8]。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)、GO、PEPC及GAPD是植物碳同化的關(guān)鍵酶，提高其效率和活力是促進(jìn)植物光合作用的重要途徑[4,8-10]。腐植酸是存在于土壤、河泥和煤炭之中的天然有機(jī)混合物[11]，有促進(jìn)作物生長(zhǎng)、節(jié)肥增效、增強(qiáng)作物抗逆性等功效，是一種多功能葉面肥[12]。張志芬[13]研究發(fā)現(xiàn)，噴施腐植酸可抑制燕麥葉片的氣孔開(kāi)度，增加氣孔阻力，降低蒸騰作用，緩解燕麥干旱脅迫。腐植酸能夠緩解干旱對(duì)麻黃葉片中葉綠體片層結(jié)構(gòu)的破壞，增加葉片的葉綠素含量和凈光合速率，顯著減輕由干旱脅迫造成的氧化損傷，提高麻黃的耐旱性，從而提高其產(chǎn)量[14]。梁太波[15]研究發(fā)現(xiàn)，腐植酸肥料可以提高旱作小麥旗葉實(shí)際光化學(xué)效率和光合電子傳遞速率，延緩衰老，提高水分利用效率。以上研究表明，干旱脅迫下，腐植酸類(lèi)物質(zhì)能通過(guò)改變作物葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合參數(shù)、降低電子傳輸通量、提高植物體內(nèi)氣體交換率，顯著提高作物光合作用、抗旱能力以及產(chǎn)量[16-18]。但有關(guān)干旱脅迫下腐植酸對(duì)燕麥葉片的碳同化酶活性及產(chǎn)量影響的研究鮮有報(bào)道。本研究以燕科2號(hào)為材料，分析不同程度干旱脅迫下噴施腐植酸對(duì)燕麥不同生育時(shí)期葉片碳同化酶活性和產(chǎn)量的影響，以期為燕麥抗旱、增產(chǎn)措施的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為燕科2號(hào)，由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提供。腐植酸水溶肥料采購(gòu)于內(nèi)蒙古永業(yè)農(nóng)豐生物技術(shù)有限責(zé)任公司，其水溶腐植酸含量≥50 g·L-1，N+P+K≥200 g·L-1，微量元素(錳、硼、鉬、鋅等)≥10 g·L-1。于2019年4月至8月在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)燕麥產(chǎn)業(yè)研究中心溫室進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)選用直徑為23 cm、高18 cm的塑料盆進(jìn)行，內(nèi)裝混合土5 kg(河沙∶泥炭土體積比1∶1)，泥炭土中N+P+K> 10 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)含量> 50 g·kg-1，pH值為5.5～8.5，土壤含水率為9%。播種前每盆施入2 g磷酸二銨(N 18%，P2O546%)做底肥。設(shè)置3個(gè)水分處理：正常供水(田間最大持水量的75%，M1)、中度干旱脅迫(田間最大持水量的45%，M2)和重度干旱脅迫(田間最大持水量的30%，M3)；2個(gè)噴施處理：噴施500倍稀釋的腐植酸水溶肥料(HA)和等量清水(CK)，共6個(gè)處理。采用隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)處理重復(fù)3次，每重復(fù)種植10盆，每盆播種30株，三葉期定苗為20株。2019年4月14日播種，8月21日收獲。從拔節(jié)期(5月18日)開(kāi)始控水至成熟期，控水方法采用稱(chēng)重差值法[19]。分別在拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期的上午 9：00-11:00進(jìn)行HA和CK處理，在植株葉片均勻噴施至葉面濕透無(wú)滴水，每盆噴施量約14 mL；噴施7 d后取燕麥中上部葉片，投入液氮速凍后，放入-80℃冰箱冷藏，用于碳同化酶活性的測(cè)定。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 碳同化酶測(cè)定

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和乙醇酸氧化酶(GO)活性均采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒測(cè)定，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPD)活性采用上海繼錦化學(xué)科技有限公司試劑盒測(cè)定。

1.2.2 地上部干物質(zhì)積累量和產(chǎn)量及其構(gòu)成因素測(cè)定

地上部干物質(zhì)積累量：分別于拔節(jié)、抽穗、灌漿期葉面噴施處理后7 d取樣，每個(gè)重復(fù)取10株，放入紙袋，烘箱105℃殺青30 min，80℃烘干到恒重。

產(chǎn)量及構(gòu)成因素：燕麥成熟時(shí)收獲、考種，每個(gè)處理取5株， 測(cè)定主穗長(zhǎng)、單株小穗數(shù)、穗粒數(shù)、穗粒重和千粒重，并測(cè)每盆的籽粒產(chǎn)量，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用SPSS 22.0進(jìn)行顯著性和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐植酸對(duì)不同水分處理燕麥葉片Rubisco活性的影響

由圖1可見(jiàn)，從拔節(jié)期到灌漿期，不同水分處理燕麥葉片的Rubisco活性均呈先升高后降低趨勢(shì)。干旱脅迫導(dǎo)致葉片Rubisco活性顯著降低。M1水分條件下，HA處理拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期燕麥葉片Rubisco活性較CK分別增加 5.62%、2.79%、6.88%，僅在灌漿期差異達(dá)到顯著水平。M2水分條件下，HA處理各時(shí)期葉片Rubisco活性較CK均顯著提高，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期分別增加了22.38%、25.83%、 19.17%。水分條件為M3下，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期HA較CK處理葉片Rubisco活性分別增加了28.45%、34.41%、32.22%，差異均達(dá)到顯著水平。以上結(jié)果說(shuō)明，干旱脅迫顯著降低了燕麥葉片Rubisco活性；噴施腐植酸可有效緩解干旱脅迫對(duì)燕麥葉片Rubisco活性的影響，尤其在M3水分條件下效果更佳。

2.2 腐植酸對(duì)不同水分處理下燕麥葉片GAPD活性的影響

隨著干旱程度的加深，各時(shí)期葉片中的GAPD活性均呈降低趨勢(shì)(圖2)。與CK相比，M1水分條件下噴施腐植酸可以提高GAPD活性，但只在抽穗期效果顯著；在M2和M3水分條件下，噴施腐植酸均能使各時(shí)期GAPD活性顯著增加，其中在M3水條件下增加的幅度最大，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期分別增加36.55%、31.80%、39.60%。這說(shuō)明噴施腐植酸可不同程度地減小干旱脅迫對(duì)燕麥葉片GAPD活性的影響，在M3處理下效果較好。

2.3 腐植酸對(duì)不同水分處理下燕麥葉片PEPC活性的影響

由圖3可知，燕麥葉片的PEPC活性在抽穗期達(dá)到最高。在M1水分條件下，噴施腐植酸后燕麥葉片PEPC活性與CK相比僅在拔節(jié)期差異顯著；當(dāng)水分條件為M2和M3時(shí)，噴施腐植酸后葉片中的PEPC活性較CK在各時(shí)期均顯著增加，其中在M2水分條件下，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期噴施腐植酸較CK分別增加了21.43%、 24.04%、25.42%，M3水分條件下，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期噴施腐植酸較CK分別增加了 38.24%、32.96%、33.81%。這說(shuō)明噴施腐植酸提高了干旱脅迫下燕麥葉片的PEPC活性，且M3水分條件下提升幅度最大。

2.4 腐植酸對(duì)不同水分處理下燕麥葉片GO活性的影響

從拔節(jié)期到灌漿期，燕麥葉片GO活性先降低后升高(圖4)。干旱脅迫導(dǎo)致燕麥葉片GO活性升高，且隨著干旱程度的加劇而增加。在M1水分條件下，噴施腐植酸后燕麥葉片GO活性與CK相比差異均未達(dá)到顯著水平；當(dāng)水分條件為M2和M3時(shí)，噴施腐植酸后葉片GO活性在各時(shí)期與CK相比均顯著降低，其中M2條件下，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期較CK分別降低16.18%、13.64%、14.65%，M3條件下，拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期分別降低16.85%、16.75%、18.39%。這表明干旱脅迫顯著提高了燕麥葉片 GO的活性，噴施腐植酸能有效緩解這種增長(zhǎng)趨勢(shì)。

表1 不同處理下燕麥地上部干物質(zhì)積累量的影響Table 1 Effect of different treatments on above-ground dry matter mass of oat g·10-1 plants

2.5 腐植酸對(duì)不同水分處理下燕麥地上部干物質(zhì)積累量的影響

由表1可知，隨著干旱程度的加深，燕麥地上部干物質(zhì)積累量顯著減少。與CK相比，在M1水分條件下，HA處理對(duì)燕麥各時(shí)期地上部干物質(zhì)積累量沒(méi)有顯著影響；在M2和M3水分條件下，拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期HA處理燕麥地上部干物質(zhì)積累量均較CK顯著增加，增幅分別為10.64%、 3.82%、2.09%和16.56%、4.20%、 2.43%。

2.6 腐植酸對(duì)不同水分處理下燕麥產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響

表2顯示，干旱脅迫導(dǎo)致燕麥產(chǎn)量及其構(gòu)成因素均顯著下降，且均表現(xiàn)為M1>M2>M3。與CK相比，噴施腐植酸能使燕麥產(chǎn)量增加，M1、M2、M3水分條件下分別增加2.63%、8.46%和10.26%，其中在M2和M3水分條件下差異達(dá)到顯著水平。從產(chǎn)量構(gòu)成因素來(lái)看，噴施腐植酸后，穗長(zhǎng)、穗粒重和千粒重較CK均增加，增加幅度均表現(xiàn)為M3>M2>M1，其中穗粒重和千粒重在M2和M3水分條件下增加顯著，分別增加 15.38%、16.07%和10.74%、15.67%；與CK相比，噴施腐植酸可以提高燕麥單株小穗數(shù)、穗粒數(shù)、穗數(shù)，但差異均不顯著。說(shuō)明噴施腐植酸主要通過(guò)降低干旱對(duì)千粒重的影響而增加產(chǎn)量。

2.7 碳同化酶活性與產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的相關(guān)性分析

Rubisco活性與穗粒重和產(chǎn)量的相關(guān)性均達(dá)到極顯著水平，與千粒重呈顯著正相關(guān)，與穗粒重的相關(guān)性最大。PEPC和GAPD活性與穗粒重、千粒重和產(chǎn)量均呈極顯著正相關(guān)，與穗粒重的相關(guān)性最大。GO活性與穗粒重、千粒重和產(chǎn)量均極顯著負(fù)相關(guān)，與產(chǎn)量的相關(guān)性最大。穗粒重與千粒重與產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)(表3)。

表2 不同處理對(duì)燕麥產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響Table 2 Effect of different treatments on oat yield and its components

表3 燕麥葉片碳同化酶活性與產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of carbon assimilating enzyme activity in oat leaves with yield and its components

3 討 論

植物的光合作用是干物質(zhì)積累和產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)，較高的光合碳同化能力是獲得高產(chǎn)的前提。卡爾文循環(huán)中，Rubisco 是影響光合碳同化的關(guān)鍵酶，能使逆境脅迫中的植物維持光合作用[20]。干旱脅迫會(huì)導(dǎo)致 Rubisco 活性降低，光合作用產(chǎn)生限制[16,21-22]，本研究結(jié)果與此相似，隨著干旱脅迫程度的增加，Rubisco活性逐漸下降，可能干旱脅迫使相應(yīng)酶量降低，進(jìn)而導(dǎo)致 Rubiso 活性下降，影響了光合碳同化[23]。在重度干旱脅迫中，作物葉片光合能力的降低主要受非氣孔因素限制，葉片光合放氧能力降低，光合磷酸化解偶聯(lián)，阻礙CO2擴(kuò)散，RuBP羧化酶活性下降，光合器官的生理功能遭到破壞，影響作物光合作用[24-25]，噴施腐植酸使植物在干旱脅迫下維持光合系統(tǒng)的穩(wěn)定和相對(duì)較高的光合作用，對(duì)非氣孔因素引起的光合限制具有緩解作用[26-27]。有研究表明，在氮脅迫下添加腐植酸比未添加處理RuBPCase活性顯著提高[28]。Jannin等[29]提出，腐殖質(zhì)處理后的植物Rubisco活性增加可能是由于細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量增加所致。本研究表明，重度干旱脅迫下，噴施腐植酸后燕麥葉片中Rubisco酶活性與CK相比提高幅度最大，中度脅迫條件下其活性雖有提高，但幅度較小。這可能是由于腐植酸在重度干旱脅迫下更能緩解干旱對(duì)葉綠體的傷害[13]，增加RuBP羧化酶固定CO2的量，進(jìn)而提高Rubisco的羧化效率，提高作物的光合能力。

GAPD是糖異生和糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，催化3-磷酸甘油酸(3-PGA)還原成3-磷酸甘油醛，影響光合環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)效率及光合產(chǎn)物的積累[30]。Ziaf等[31]發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下GAPD基因的表達(dá)減輕了植物膜脂過(guò)氧化的程度。有研究表明，隨著水分脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和脅迫強(qiáng)度的加劇，小麥旗葉的GAPD活性逐漸降低[23]，與本研究結(jié)果一致。在逆境條件下，生物體中GAPD基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平不穩(wěn)定，大多數(shù)生物體都增加表達(dá)GAPD[32]。郭子平[33]研究表明，干旱脅迫下，小麥葉片總GAPD活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在本研究中，隨著干旱脅迫程度的加劇，葉片中的GAPD活性逐漸降低，與上述研究結(jié)果不同，可能是因?yàn)椴煌购殿?lèi)型作物受到干旱脅迫時(shí)GAPD基因的表達(dá)調(diào)控因子和信號(hào)傳遞途徑存在差異，也可能是不同作物、不同品種的GAPD蛋白在植物細(xì)胞的失水耐受過(guò)程中作用不同[34]。有研究表明，腐植酸可以誘發(fā)含有NADP依賴(lài)性甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPN)蛋白產(chǎn)生[35]。在本研究中，兩種干旱脅迫條件下噴施腐植酸，燕麥葉片的GAPD活性均能提高，但在重度脅迫下變化幅度較大。可能是因?yàn)楦菜嵩谥参锛?xì)胞過(guò)度失水時(shí)誘導(dǎo)了GAPDH蛋白的大量表達(dá)，導(dǎo)致酶活性提高，促進(jìn)光合產(chǎn)物的積累，最終增加燕麥的穗粒重，使產(chǎn)量增加。

PEPC在CAM和C4植物中的主要生理作用是初級(jí)CO2的固定還原[36]。有研究表明，C3植物中也存在PEPC[37]，在大部分C3植物體內(nèi)中，PEPC具有回補(bǔ)作用，補(bǔ)充三羧酸循環(huán)，其中間產(chǎn)物能被用于多種生物合成及氮同化消耗[36]。關(guān)于干旱脅迫對(duì)PEPC活性的影響，各試驗(yàn)結(jié)果有所不同。有研究表明，在水分虧缺下，小麥PEPC活性明顯增強(qiáng)[18]；而張 旭等[38]認(rèn)為，干旱導(dǎo)致小麥旗葉PEPC活性下降。玉米葉片中PEPC活性在水分脅迫下先升后降[39]。在本研究中，隨著干旱脅迫程度的加劇，PEPC活性均逐漸降低，有可能是不同種類(lèi)的植物應(yīng)答干旱的生態(tài)適應(yīng)性機(jī)制不同[40]。噴施腐植酸后，PEPC活性均有所提高，且土壤水分含量低時(shí)提升效果更佳，可能是在過(guò)度失水下，腐植酸在一定程度上更能誘導(dǎo)PEPC酶蛋白的表達(dá)，具體原因還需進(jìn)一步探討。

GO在植物光呼吸代謝中具有關(guān)鍵作用，能提高植物光合效率[41]。隨著干旱脅迫的加劇，檸條中GO活性逐漸增強(qiáng)[42]，與本研究研究結(jié)果相似。這說(shuō)明隨著干旱程度加劇，乙醇酸氧化酶活性也隨之升高。乙醇酸氧化酶催化乙醇酸的氧化過(guò)程中伴隨著 H2O2的生成，是H2O2總數(shù)的70%[43]。水分脅迫能夠增加GO活性，誘導(dǎo)大量H2O2的累積[44]。Garcar等[45]研究發(fā)現(xiàn)，腐植酸可通過(guò)降低水稻H2O2的含量，提高膜的通透性，對(duì)干旱引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)起到保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，腐植酸能使干旱條件下燕麥葉片GO活性降低，其中在重度干旱脅迫時(shí)，噴施腐植酸較CK處理相比降低幅度更大。這說(shuō)明腐植酸可能是通過(guò)減少過(guò)氧化氫的生成來(lái)抑制乙醇酸氧化酶的活性，降低燕麥的光呼吸，增加作物的光合作用。

綜上，干旱脅迫通過(guò)改變碳同化酶活性，降低光合碳同化能力，從而影響燕麥的干物質(zhì)積累和產(chǎn)量形成，噴施腐植酸能顯著提高燕麥葉片Rubisco、GAPD和PEPC活性，提高碳的同化能力，降低GO活性，促進(jìn)光合作用，增加產(chǎn)量，當(dāng)田間最大持水量為30%提升幅度更大。