核酸適配體技術在海洋生物毒素快速檢測中的應用

吳益春 王曉煜 蘇 滿 祝世軍 周 勇 羅海軍 郭海波

（1. 舟山市食品藥品檢驗檢測研究院， 浙江舟山 316012； 2. 浙江海洋大學， 浙江舟山 316022）

近年來， 我國沿海赤潮發生率顯著上升， 平均每一年爆發的次數和累計面積都有增加[1]。 海水富營養化、 近海的氮磷量增加， 促進了某些有害藻類的生長繁衍[2]， 這不僅對海洋生物造成了極大威脅， 也對人類的身體健康構成了較大的危害[3]。

一、 海洋生物毒素概況

海洋生物毒素為海洋生物體內存在的一類高活性特殊代謝成分， 大多數具有劇烈毒性， 是海洋生物活性物質研究中進展最迅速的[4]， 其主要由藻類或浮游植物產生。 海洋生物毒素能夠在濾食性軟體貝殼類動物組織內蓄積。 海洋污染造成的海水富營養化利于有毒藻類的大量繁殖， 從而引發赤潮[5]。貝類通過濾食有毒的藻類， 經過生物累積構成貝類毒素， 這些貝類毒素作用于人類消化系統、 神經系統或心血管系統， 引起中毒， 威脅人類健康。 貝類毒素根據其化學結構可大致分為3 大類： 聚醚類毒素、 生物堿類毒素和多肽類毒素[6]。 按照毒性作用機制又分為4 大類： 腹瀉性貝毒 （diarrhetic shellfish poisoning， DSP）、 麻痹性貝毒 （paralytic shellfish poisoning， PSP）、 神經性 貝毒 （neurotoxic shellfish poisoning， NSP）、 記憶缺損性貝毒 （amnesia shellfish poisoning， ASP）[7]。

（一） DSPDSP 的化學結構為聚醚或大環內酯化合物， 是一種脂溶性物質， 其廣泛存在于軟體貝類中。 DSP 被人體攝食后主要作用于酶系統， 主要癥狀為腹瀉、 惡心、 嘔吐等， 目前尚無有效的治療藥物。 在大多數貝類中， 大田軟海綿酸 （OA）是DSP 的主要成分， 現已經證明其具有致癌作用[8]。

（二） PSPPSP 被公認為是目前世界上分布最廣、 事故發生頻率最高的貝類毒素。 PSP 主要由單細胞甲藻產生， 大致可分為3 類： 石房蛤毒素（saxitoxin， STX）、 新石房蛤毒素（neosaxitoxin，neo－STX）、 膝溝藻毒素 （gonyautoxin， GTX）。PSP 的化學性質非常穩定， 加熱煮熟也很難分解毒素[9]。 PSP 是一種神經肌肉麻痹劑， 它對人體產生麻痹作用的機理是阻斷神經細胞的鈉離子通道， 造成細胞間物質傳輸障礙。 PSP 中毒會產生四肢肌肉麻痹、 頭痛、 惡心等不良反應， 嚴重的會導致呼吸停止， 且目前沒有對癥解毒劑。

（三） NSPNSP 主要是由于貝類濾食短裸甲藻后富集至體內而產生的， 被食用后會產生以神經麻痹為主的中毒。 NSP 可通過兩種方法對人體造成危害， 一種是由食用了被短裸甲藻赤潮污染的貝類引起的[10]， 主要癥狀為眩暈、 頭部神經機能失調、身體冷熱無常、 惡心、 嘔吐； 另一種是接觸了含有短裸甲藻細胞或其代謝物的海洋氣溶膠顆粒引起的呼吸道中毒， 癥狀為氣喘、 干咳等。

（四） ASPASP 是由多列擬菱形藻分泌產生的毒素， 其中引起中毒的成分是一種非蛋白氨基酸， 名為軟骨藻酸（domoic acid，DA）， 具有強烈的神經毒性， 同時也是紅藻氨酸受體的興奮劑[11]， 能夠牢固結合谷氨酸受體， 作用于興奮性的氨基酸受體和突觸傳遞素， 提高鈣離子的滲透性， 使細胞長時間處于去極化的興奮狀態而死亡， 導致記憶功能的長久損害。

二、 核酸適配體

核酸適配體 （aptamer， 簡稱適配體）， 是指經過一種新的體外篩選技術——指數富集配體系統進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment， SELEX）， 在隨機單鏈寡聚核苷酸文庫中得到能特異結合蛋白或其他小分子物質的單鏈寡聚核苷酸， 可以是RNA 也可以是DNA， 長度一般為 10～80 個核苷酸[12～13]。 眾學者利用該技術從人工合成的隨機單鏈寡聚核苷酸序列文庫中反復篩選， 得到了很多以高特異性、 高親和力與各類靶標物質結合為特點的適配體， 如凝血酶適配體[14]、 血管內皮生長因子適配體[15]、 三磷酸腺苷適配體[16]、可卡因適配體[17]等。 適配體能通過芳香環、 π-π 堆積、 范德華力和帶電基團之間的靜電相互作用形成特殊的三維結構， 與靶分子特異性結合[18]。 適配體具有親和力高、 特異性強、 成本低、 性質穩定、 靶分子范圍廣、 易化學合成、 易改造、 易標記等優點， 目前研究中常被用作分子識別元件[19]。 由于適配體是一段單鏈寡聚核苷酸， 本身不具備識別能力， 在適配體與靶分子物質特異性結合過程中無法產生可檢測的物理化學信號， 因此， 對適配體進行篩選修飾或借助換能器， 將適配體的識別過程轉變為易于識別檢測、 可定量處理的信號[20]。

適配體作為一種新型的識別分子， 被譽為 “化學抗體”， 具有以下特點[21～22]：（1） 適配體與靶標結合的產物具有親和性和特異性， 與抗體相差較小，解離常數Kd可達 nmol/L 甚至 pmol/L 數量級， 例如茶堿RNA 適配體對茶堿的親和力比咖啡因強1萬倍， 雖然它們的分子僅相差1 個甲基， 但仍能夠表現出極佳的特異性[23]。 （2） SELEX 是一種體外篩選適配體的技術， 可以從隨機單鏈寡聚核苷酸序列文庫中篩選出特異性與靶向物質高度親和的適配體。 （3） 所選適配體序列易于大批量合成， 也可通過PCR 技術進行大批量復制， 無需動物或細胞實驗， 周期短， 成本低。 （4） 適配體的目標類型多，例如小分子的氨基酸、 核苷酸、 金屬離子、 毒素、有機染料、 抗生素、 輔助因子， 或者大分子的生物， 如酶、 生長因子、 抗體、 核酸和蛋白質， 甚至是完整的病毒。 （5） 適配體不易受到外界影響， 在室溫下可以長期貯存和運輸； 作為寡聚核苷酸的適配體分子即使變性之后， 也可以在合適的條件下發生復性。 因此， 以適配體作為識別分子的生物傳感器能夠反復利用[24]。 （6） 適配體有利于標記和化學修飾， 可隨時將官能團引入隨機單鏈寡聚核苷酸序列文庫， 也可在化學合成過程中進行官能團的標記， 方便其檢測應用。 （7） 適配體的相對分子質量較小， 不具有免疫原性， 而且組織穿透力強， 可以滲透入細胞， 獲得更多的表相， 可應用于藥物輸送、 分子成像和細胞內診斷等。 （8） 適配體的二級結構容易被預測， 使用核酸酶等工具酶對其進行裁剪、 切割、 改造， 提高其親和力和特異性， 有助于發展多元化的檢測方法。 細菌和細胞等也可作為適配體篩選的靶標。 抗體和適配體的比較見表1[25]。

表1 抗體和適配體的比較

三、 核酸適配體技術在海洋生物毒素檢測中的應用

海洋生物毒素檢測方法主要包括： 小鼠生物檢測法、 免疫分析法、 大型儀器檢測法和毛細管電泳法。 小鼠生物檢測法是依據小鼠被注射毒素后的存活時間和癥狀來評估毒性[26]。 該方法簡單易行， 適用范圍大， 但只能測定毒素的毒性， 無法確定含量， 可重復性差， 難以大規模推廣。 免疫分析法是通過毒素抗原和抗體結合形成免疫復合物的性狀和活性特點對樣品中的毒素進行定性、 定位和定量檢測， 檢測靈敏度高， 檢測迅速， 但抗體制備困難，不宜長期貯存。 大型儀器檢測法包括高效液相色譜法 （HPLC）、 液相色譜－串聯質譜法 （LCMS/MS） 等。 HPLC 是基于樣品提取物的純凈度，運用高效液相色譜儀分離樣品， 再通過紫外吸收檢測、 電化學檢測和熒光檢測等方法進行分離， 能夠準確定量檢測毒素， 靈敏度高， 具有較高的可靠性， 但操作復雜， 所需設備較多， 無法進行實時檢測[27]。 LC－MS/MS 可以高靈敏度識別毒素， 目前已廣泛用于海洋生物毒素分析， 但它需要復雜的儀器和具有很強的操作能力的專業人員。 毛細管電泳法[28]是以彈性石英毛細管為分離通道， 以高壓直流電場為驅動力， 根據樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現分離的電泳分離分析方法， 該方法檢測速度快、 高效， 但干擾因素多， 僅能用于毒素的實驗室定量檢測。 綜上所述， 現有的海洋生物毒素檢測方法都具有一定局限性， 尋找一種簡單方便、 靈敏度高的快速檢測方法成為當務之急。 以下是目前已經報道的海洋生物毒素適配體序列、 親和力等信息及其篩選方法 （見表2）。

表2 目前已經報道的海洋生物毒素適配體序列、 親和力等信息及其篩選方法

石房蛤毒素 （STX） 是水產品質量和安全檢測中最重要項目之一[29]。 就現階段來看， 該毒素主要采用小鼠生物檢測法和免疫分析法[30]。 在2012 年，HANDY 等[31]首次報道了篩選STX 特異性適配體的研究， 第一次將核酸適配體技術應用于海洋生物毒素檢測研究。 由于STX 相對分子質量小， 與核酸分子結合較難， 因此在該研究中引入了一個載體——KLH， 形成了 STX－Jeffam－ine－KLH 復合物， 進而通過SELEX 技術對適配體序列進行篩選， 經過10個循環的篩選， 最終得到了單一的高特異性的核酸序列——適配體APTSTX1。 進一步研究發現， 該適配體能穩定、 高特異性地結合STX。 2013 年，HU 等[32]又通過 SELEX 技術篩選出了STX 抗體分子的高特異性適配體F3， 它不會和其他毒素結合，可成為STX 的替代品， 解決了STX 分離純化難的問題， 滿足了逐漸發展的STX 檢測技術對大量標準毒素的需求。 近年來隨著對STX 適配體的研究越來越深入， 逐漸地從序列的獲取轉變為對序列的進一步修飾， 進而改變其二級結構， 這一技術能夠極大地提高結合力和特異性。 2015 年， ZHENG等[33]在HANDY 等的基礎上對原有的適配體進行了基因定點誘變和敲除等改造， 得到了一個新的適配體， 這個新的適配體對STX 的親和力更高， 比原來的適配體APTSTX1 親和力高出30 倍。

膝溝藻毒素 1/4 （GTX1/4） 是麻痹性貝類毒素， 含量較低， 但毒性劇烈， 無法利用常規手段檢測[34]。 由于存在結構相似但功能不同的同類物 （如GTX2/3、 STX、 neo－STX 等）， 傳統的小鼠生物檢測法特異性差， 假陽率高， 無法快速高效地檢測[35]。2016 年， 焦炳華和王梁華教授課題組[36～37]改進了傳統的 MB－SELEX 技術， 采用了新型 GO－SELEX 技術來篩選獲得GTX1/4 適配體。 經檢測證明， GO－SELEX 技術與 MB－SELEX 技術相比，能獲得更多克隆的適配體序列， 所獲得的產物對于GTX1/4 有更好的特異性， 利用該技術篩選出GTX1/4 的新型適配體 GO18－Td[37]。 通過生物素－鏈霉素耦合的方法， 加工成BLI 適配體傳感器， 并與生物膜干涉技術聯用， 用于GTX1/4 的實際檢測。 該傳感器能夠穩定檢測的濃度范圍是0.2～200.0 ng/mL， 檢測的最低值達 50 pg/mL， 且不和其他類海洋生物毒素樣品發生交叉反應， 特異性極高。

大田軟海綿酸 （OA） 是腹瀉性貝類毒素中的主要成分。 目前主要采用小鼠生物檢測法作為OA的標準檢驗方法[38]， 但局限性強。 EISSA 等[39]利用SELEX 技術篩選出OA 的第一個特異性適配體。他們將OA 與磁珠進行孵育， 再以磁珠為介質與預先建立的隨機核酸分子庫結合， 4 個循環后， 采用反向篩選的方式將其中未和磁珠結合的非特異性核酸片段排除， 最終成功篩選出OA 的高特異、 高親和核酸適配體OA34。 利用OA34 構建基于EIS 檢測的無標記適配體傳感器， 該傳感器能檢測的范圍為 0.1～60.0 ng/mL， 最低檢測限為 70 pg/mL[40]。

短裸甲藻毒素 （BTX） 是一種經典的神經性貝類毒素， 致死性極強， 小鼠腹腔注射LD50為200 mg/kg[41]。 為提高對該毒素的檢測水平， 2014 年EISSA 等[42]通過SELEX 技術篩選出了具有高親和性的適配體BT10， 經過一系列實驗， 最終確定了適配體與BTX 的最佳孵育條件， 即30 min、 pH7.5、C（Mg2+）＝10 mmol/L。 在此條件下篩選得到的適配體有更高的親和性和靈敏度， 最終可以加工成無標記的適配體傳感器， 該傳感器的檢測最低濃度為106 pg/mL。 而且， BT10 也具有較高的特異性， 與BTX 的 2 個同類物 BTX－2、 BTX－3 有很高的親和力， 而與所檢測的其他海洋生物毒素無交叉反應。 2016 年， TIAN 等[43]通過 12 輪篩選獲得適配體 Bap5， 與適配體 BT10 相比， Bap5 對 BTX－2具有更高的親和性， 不和其他類海洋生物毒素樣品發生交叉反應， 適合開發為BTX－2 檢測試劑盒。

核酸適配體技術在檢測海洋生物毒素方面具有操作簡單、 靈敏度高、 選擇性好、 檢測成本低的優點， 基于其高靈敏度和穩定性， 可以開發出多種檢測試劑盒和試紙。 近年來， 有眾多學者選擇研究海洋生物毒素的特異性適配體， 使得核酸適配體技術在海洋生物毒素檢測領域獲得長足的發展（見表3）。

表3 基于核酸適配體檢測海洋生物毒素

四、 結語

海洋生物毒素是一種具有劇烈毒性的物質， 對人體健康造成嚴重危險。 因此， 開發一種能夠快速檢測海洋生物毒素的方法變得十分迫切。 核酸適配體技術作為一種新型的海洋生物毒素檢測方法， 雖然在靈敏度方面不如大型儀器檢測法， 但相比其他檢測技術， 具有操作簡單、 快速、 成本低， 不需要對被測樣品進行復雜的預處理， 更不需要昂貴的儀器和專業的操作， 其靈敏度完全能滿足日常檢測的需要， 是一種非常有前景的檢測技術。

就現在而言， 基于核酸適配體技術的檢測基本還是以定性為主， 研發出穩定、 高靈敏度、 高通量、 可現場定量的檢測技術就顯得極為重要， 是未來的發展方向。