生乳中嗜冷菌生長動力學模型的建立及應用研究

韓奕奕 楊曉君 馬穎清 張維誼 王 霞 豐東升

（上海市農產品質量安全中心， 農業農村部食品質量監督檢驗測試中心 （上海）， 上海 201708）

嗜冷菌 （psychrotrophic microorganisms） 廣泛存在于自然界中。 我國NY/T 1331—2007 《乳與乳制品中嗜冷菌、 需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數的測定》 中定義嗜冷菌為 “在6.5℃條件下， 需氧培養10 d， 在MPC 瓊脂平板上形成可計數菌落的細菌、酵母和霉菌”[1]。 國際乳品聯合會 （IDF） 將 7℃及以下依然能生長繁殖的微生物定義為低溫菌； 在20℃及以下能生長繁殖， 且10～15℃為最適生長溫度的微生物定義為嗜冷菌[2]。 生乳中嗜冷菌的來源較廣， 菌株類型較多， 其中以假單胞菌、 微球菌和產堿桿菌數量居多[3～4]。 假單胞菌屬主要存在于土壤、 淡水、 海水和許多植物體中； 微球菌分布較為廣泛， 以空氣、 水、 設備及動物體表居多； 產堿桿菌主要存在于水、 飼料及糞便中[5～6]。 在嗜冷菌的污染環節中， 接觸傳播是最主要的傳播途徑， 如擠奶工手的衛生、 藥浴杯污染、 水清洗乳頭污染、運輸及儲存設備的不清潔及消毒不嚴格等均容易造成嗜冷菌數量快速增長[7]。

生乳從收集到加工需要存放一段時間， 為了更好地控制微生物， 防止生鮮乳變質， 低溫成為了保存和運輸過程中必不可少的條件[8]。 低溫能夠抑制生乳中大部分微生物的活性， 但其中的嗜冷菌仍能在低溫環境中繁殖[9～10]。 嗜冷菌在生乳沒有及時冷卻、 冷卻溫度不達要求或儲存時間過長時， 就會大量繁殖， 并產生能分解脂肪、 蛋白質的耐熱脂肪酶、 蛋白酶， 可導致原料乳在熱滅菌后產生沉淀、凝膠， 變苦[10]， 使乳及乳制品風味、 品質降低， 保質期縮短， 造成產品品質缺陷[11～12]。 隨著冷藏設備的廣泛應用， 嗜冷菌逐漸成為影響乳制品保質期的主要因素[13]。 因此對生乳中嗜冷菌的控制目前越來越受到乳品生產企業的關注和重視。

目前， 我國還未對生乳中嗜冷菌設置限量要求。 GB 19301－2010 《食品安全國家標準 生乳》中僅對菌落總數作了明確規定 （2.0×106CFU/mL以下為合格乳）[14]。 國外對生乳中微生物指標要求更加嚴格， 歐美等國規定生鮮乳中微生物菌落數在1.0×105CFU／mL 以下， 同時嗜冷菌數控制在 1.0×103CFU/mL 以下為合格乳， 從而有效控制原料奶中某些嗜冷菌合成產物耐高溫酶的含量[15～16]。 在乳品企業實際生產中， 根據原料乳品質等級， 嗜冷菌限量值一般保持在 1.0×103CFU/mL 以下[17]。 從 2005年起， 上海地區已將嗜冷菌作為生乳質量安全監控的指標之一， 列入生乳按質論價計價體系中[18]， 并于2020 年作為生乳按質論價收購的檢測指標之一，其中規定嗜冷菌數≤103CFU/mL 時， 每千克奶價增加 0.03 元； ＞103且≤104CFU/mL 不獎不罰；＞104且≤105CFU/mL 則每千克扣 0.05 元； ＞105CFU/mL則每千克扣0.10 元。

預測微生物學是食品微生物學中的一個研究領域， 旨在提供數學模型來預測食品環境中的微生物行為[19～20]。 張宏偉等[21]對秋季低溫儲存原料乳進行預測微生物學研究， 使用Gompertz 模型建立4～14℃儲存的秋季原料乳中總菌落和嗜冷菌的生長動力模型。 本文以上海地區生乳為研究對象， 應用預測微生物學建立嗜冷菌在不同溫度下的生長動力學模型， 此模型能夠有效地預測出生乳在生產加工、儲藏和運輸過程中嗜冷菌的變化情況， 為生乳中嗜冷菌的風險評估以及乳品安全生產加工和流通過程提供研究基礎和理論依據， 為乳品生產企業建立微生物風險管理措施提供科學依據。

一、 材料與方法

（一） 樣品的采集生乳取自上海地區規模化奶牛養殖場。 所有采樣容器均為無菌容器， 樣品采集后0～4℃冷藏保存后送實驗室檢測。

（二） 材料與儀器嗜冷菌菌種： 由日常生乳樣品中分離培養獲得； 乳平板計數瓊脂 （MPC 瓊脂， 北京陸橋技術股份有限公司）； 2， 3， 5－三苯基氯化四氮唑 （TTC， 國藥集團化學試劑有限公司）； 滅菌處理生乳： 經過65℃下30 min 滅菌處理的生乳； 其他試劑均為分析純。

AIRTECH超凈工作臺 （蘇州安泰空氣技術有限公司）； 低溫培養箱 IPP400 （德國 Memmert 公司），6.5℃； LPVortexMixer 漩渦混合器 （美國 Thermo 公司）； HV－110高壓滅菌鍋 （日本HIRAYAMA 公司）。

（三） 實驗方法

1. 樣品處理。 從事先準備好的生乳嗜冷菌分離培養平板上挑取適量嗜冷菌， 通過對比麥氏比濁管濁度， 制備濃度約為0.5 麥氏濃度 （相當于1.5×108CFU/mL） 的嗜冷菌菌液， 通過無菌水逐級稀釋， 隨后將不同濃度的嗜冷菌菌液移取到滅菌生乳中， 使其終濃度分別為 10～102、 102～103、 103～104、 104～105CFU/mL， 并用平板計數法測定其嗜冷菌數 （即為初始濃度）， 以模擬不同嗜冷菌初始濃度的生乳試樣。

2. 測定方法。 遵照 NY/T 1331－2007 《乳與乳制品中嗜冷菌、 需氧芽孢及嗜熱需氧芽孢數的測定》， 對不同初始嗜冷菌濃度的生乳樣品在不同儲存溫度和時間下的嗜冷菌數量進行測定。

3. 不同溫度下生長曲線的測定。 將不同初始嗜冷菌濃度的生乳樣品分別放置于4、 6.5、 10、14、 18℃下培養， 每 3 h 取樣測試。 各溫度、 濃度梯度的生乳樣品， 根據其嗜冷菌污染情況， 選擇3個適宜的稀釋度， 每個稀釋度移取1 mL 樣液至無菌培養皿， 在6.5℃下培養10 d， 每個稀釋度做2個平行， 本次嗜冷菌生長曲線實驗共測試54 h。

4. 模型的建立。 預測微生物學是運用微生物學和統計學進行數學建模， 評估食品的安全性［22～26］。微生物生長動力學模型以數學公式的形式描繪了微生物的生長曲線， 很好地表達了微生物從生長到衰亡的過程中微生物數目 （細菌總數或當前存活細菌總數） 與生長時間的動態變化關系。 現有的微生物生長模型有 Logistic 模型、 Gompertz 模型、Baranyi 模型、 Huang 模型[27]等， 各模型是通過不同的分析方式對微生物生長初始經歷遲緩期、 對數生長期， 直至穩定期的生長過程進行歸納總結后建立的。 Logistic 模型基本表達式見公式 （1）：

式（1）中，t為時間（h），Nmax為微生物最大生長量（CFU/mL），μmax為微生物最大生長速率 （h－1），λ為遲滯期時長 （h）， exp 為高等數學里以自然對數e 為底的指數函數。 應用Origin 軟件繪圖， 使用Logistic 函數模型建立牛乳中嗜冷菌的初級生長動力學模型。

二、 結果與分析

（一） 嗜冷菌生長動力學模型的建立圖1～圖4 分別為不同初始嗜冷菌濃度的生乳在不同儲存溫度條件下的生長模型， 結果顯示， 不同初始嗜冷菌濃度的生長規律相同， 均是10℃的生長速率最高， 14℃和18℃的生長速率相近， 遲緩期到對數生長初期18℃的生長速率略高于14℃， 但對數生長中后期到穩定期變為14℃的生長速率略高于18℃， 4℃的生長速率最低， 這說明溫度控制在4℃能較好地抑制嗜冷菌的生長。 圖5～圖9 為不同溫度下， 不同初始嗜冷菌濃度的生乳中嗜冷菌的生長曲線， 結果表明， 初始嗜冷菌濃度越低， 達到穩定期后的嗜冷菌總數也越低。

圖1 初始濃度為10～102CFU/mL 的生乳在不同儲存溫度條件下嗜冷菌生長情況

圖2 初始濃度為102～103CFU/mL 的生乳在不同儲存溫度條件下嗜冷菌生長情況

圖3 初始濃度為103～104CFU/mL 的生乳在不同儲存溫度條件下嗜冷菌生長情況

圖4 初始濃度為104～105CFU/mL 的生乳在不同儲存溫度條件下嗜冷菌生長情況

圖5 4℃下不同初始嗜冷菌濃度的生乳中嗜冷菌的生長情況

圖6 6.5℃下不同初始嗜冷菌濃度的生乳中嗜冷菌的生長情況

圖7 10℃下不同初始嗜冷菌濃度的生乳中嗜冷菌的生長情況

圖8 14℃下不同初始嗜冷菌濃度的生乳中嗜冷菌的生長情況

圖9 18℃下不同初始嗜冷菌濃度的生乳中嗜冷菌的生長情況

（二） 曲線的擬合表1 為嗜冷菌生長動力學模型方程及擬合度， 使用Logistic 模型建立的上海地區生乳中嗜冷菌生長動力學模型的R2＞0.99， 表明建立的4～18℃儲存的生乳中嗜冷菌的生長動力學模型是合適的， 該模型可有效模擬上海地區生乳中嗜冷菌的生長情況。

表1 嗜冷菌生長動力學模型方程及擬合度

三、 嗜冷菌生長動力學模型的應用

（一） 上海地區生乳中嗜冷菌實測情況2019－2020 年度每旬對上海及周邊地區奶牛養殖場運送至乳品加工企業的生乳中嗜冷菌進行監測， 共計檢測樣品3 413 批次， 測得生乳中嗜冷菌濃度范圍在320～1.5×106CFU/mL， 均值為 1.25×104CFU/mL，中位數為880 CFU/mL。

（二） 模型的應用生乳儲存開始時細菌的濃度對其繁殖速度有重要影響， 在較低儲存溫度下生乳中嗜冷菌是主要增長的微生物[28]， 雖然嗜溫微生物生長緩慢， 但是嗜冷菌仍然相對較快地生長[29]。低溫對嗜冷菌的抑制效果取決于生乳最初被污染的程度， 生乳儲存溫度對產品的質量有重要影響[30]。

運用前文建立的模型， 結合嗜冷菌中脂肪和蛋白分解酶的研究， 可對生鮮乳中嗜冷菌的限量標準進行研究。 另外也可以利用模型計算生乳的安全運輸時間， 或者是為保證收奶時達到相應的限量要求， 可推算牧場需控制生乳中嗜冷菌的數量范圍。以生乳中嗜冷菌檢出的中位值880 CFU/mL 為例，全程4℃儲存條件下運輸樣品， 假設從奶牛養殖場送至生產加工點平均花費時間約為20 h， 通過代入4℃嗜冷菌生長動力學模型中計算得出， 奶牛養殖場的生乳中嗜冷菌的初始濃度應控制在100 CFU/mL 以內； 反之按乳品加工企業內控指標嗜冷菌數＜104CFU/mL 的要求， 假設奶牛養殖場生乳中嗜冷菌初始濃度為103CFU/mL， 生鮮乳儲運溫度控制在 0～7℃內， 則應用初始濃度為 103～104CFU/mL 的模型方程計算， 需保證19 h 內到達乳品加工廠開展生產加工才能符合內控要求。

四、 結論

本文研究了溫度對生乳中嗜冷菌生長動力學的影響， 模擬在不同儲存溫度下的嗜冷菌生長情況，使用Logistic 模型建立4～18℃儲存的生乳中嗜冷菌的生長動力學模型， 模型相關系數均＞0.99， 可以用來預測微生物生長情況。 以上海及周邊地區的奶牛養殖場的生乳為實例， 在實際生產中可以通過嗜冷菌的初始濃度推算出嗜冷菌的數量及運輸距離和時間。 研究所建立的模型可為奶牛養殖場、 乳品生產加工企業及相關監管部門開展生乳中嗜冷菌監管及限量安全風險評估提供科學基礎。