一種雜色曲霉素膠體金免疫快速檢測試紙條的研制

賈芳芳 張 闊 葛彩霞 魏力杰 索金玉 王兆芹

（1. 北京望爾生物技術(shù)有限公司， 北京 102206； 2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心， 北京102206； 3.北京市延慶區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心， 北京 102100； 4. 灤州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局， 河北灤州 063799）

雜色曲霉素 （sterigmatocystin） 是一種真菌毒素， 可由10 余種真菌代謝產(chǎn)生， 能夠誘發(fā)實驗動物產(chǎn)生多種癌瘤[1～2]。 研究表明， 雜色曲霉素與人的胃癌有關(guān)， 還可轉(zhuǎn)化成更強(qiáng)烈的致癌物黃曲霉毒素。 雜色曲霉素可污染小麥、 玉米等谷物[3～5]。

由于雜色曲霉素對人畜的危害大， 分布廣， 因此需要一種有效而快速的手段檢測谷物中雜色曲霉素。 目前有傳統(tǒng)的儀器檢測方法， 如液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[6]、 分散固相萃取－超高效液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜法[7～8]、 超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法[9]、 高效液相色譜法[10～13]， 上述儀器方法成本高，用時較長， 而免疫化學(xué)檢測法具有低成本、 用時較短、 特異性較強(qiáng)等優(yōu)點[14～15]。 本文研究制備一種雜色曲霉素單克隆抗體， 將其用于膠體金免疫層析試紙條研制， 以期使檢測時限及費(fèi)用滿足基層實驗室的檢測需求。

一、 材料與方法

（一） 材料與儀器雜色曲霉素等標(biāo)準(zhǔn)品 （純度≥95%） 購自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。 氯金酸（HAuCl4·3H2O）、 牛血清白蛋白 （BSA）、 卵清蛋白 （OVA） 均購自美國 Sigma 公司。 膠體金分析儀由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供。 渦旋儀購自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司[14～15]。

（二） 方法

1. 雜色曲霉素半抗原的制備。 取16 mg 雜色曲霉素， 加入甲醇20 mL 溶解， 加入3－馬來酰亞胺丙酸肼 18 mg， 充分?jǐn)嚢琛?加入醋酸鈉 1.7 g， 攪拌溶解， 加熱， 回流反應(yīng) 12 h， 停止反應(yīng)， 旋蒸，除去甲醇。 加水 50 mL、 氯仿 60 mL， 充分振蕩，靜置， 分去水相。 加水 70 mL， 振蕩， 靜置， 分去水相， 有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥蒸干， 加乙醚3 mL， 充分洗滌， 除去上清液， 固體沉淀， 真空干燥， 得到馬來酰亞胺丙酸化雜色曲霉素半抗原產(chǎn)物13 mg （見圖 1）， 回收率 53%。

圖1 雜色曲霉素半抗原合成

2. 免疫原的制備——雜色曲霉素半抗原與牛血清白蛋白 （BSA） 偶聯(lián)物合成。 取牛血清白蛋白（BSA） 25 mg， 加入 0.1 mol/L PB （pH 8.0） 溶解，加二硫蘇糖醇1.9 mg， 室溫下反應(yīng)12 h， 得到A液； 取馬來酰亞胺丙酸化雜色曲霉素半抗原9 mg，加 DMF 1 mL 溶解， 得到 B 液， 緩慢滴加到 A 液中， 室溫繼續(xù)反應(yīng) 9 h， 停止反應(yīng)。 以0.02 mol/L PBS 透析純化 3 d， 每天換液 3 次， 得到 BSA－雜色曲霉素偶聯(lián)物， 即為免疫原， 分裝， －20℃保存， 備用。

3.包被原的制備——雜色曲霉素半抗原與卵清蛋白（OVA） 偶聯(lián)物合成。 取卵清白蛋白 （OVA）20 mg， 加入 0.1 mol/L PB （pH 8.0） 溶解， 加二硫蘇糖醇 0.94 mg， 室溫反應(yīng) 12 h， 得到 A 液； 取馬來酰亞胺丙酸化雜色曲霉素半抗原4 mg， 加DMF 1 mL 溶解， 得到 B 液， 緩慢滴加到 A 液中， 室溫繼續(xù)反應(yīng) 9 h， 停止反應(yīng)。 以 0.02 mol/L PBS 透析純化3 d， 每天換液3 次， 得到OVA－雜色曲霉素偶聯(lián)物， 即為包被原， 分裝， －20℃保存， 備用。

4.將雜色曲霉素單克隆抗體－膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上。 將100 μL 雜色曲霉素單克隆抗體－膠體金標(biāo)記物加入微孔試劑微孔板中， 置于冷凍干燥機(jī)， 冷阱溫度為－50℃， 預(yù)凍 3 h， 再真空干燥15 h， 即得到雜色曲霉素單克隆抗體－膠體金標(biāo)記物凍干的微孔試劑[14～15]。

5. 檢測方法。 向微孔中加入 100 μL 待檢樣本溶液， 混勻， 室溫下孵育 3 min， 吸取 70 μL 滴至試紙條上， 反應(yīng) 10 min， 根據(jù)示意圖 （見圖 2） 判定結(jié)果或通過膠體金分析儀讀取檢測結(jié)果。 其他時間判讀無效。 檢測時間共計15 min， 即為加樣混勻時間 （約 2 min）、 孵育時間 （3 min） 與反應(yīng)時間（10 min） 的總和。

圖2 雜色曲霉素膠體金試紙條結(jié)果判定示意圖

6. 樣品檢測限的確定。 在空白飼料樣品 （小麥、 玉米） 中分別添加雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為 0、 0.5、 1、 1.5、 2、 2.5 μg/L， 按照上文檢測方法用3 批試紙條進(jìn)行檢測， 每個濃度重復(fù)5 次，根據(jù)實驗結(jié)果確定樣本檢測限[14～15]。

7. 試紙條的特異性。 分別配制 500 μg/kg 的黃曲霉毒素B1、 黃曲霉毒素M1、 赭曲霉素等藥物，用試紙條重復(fù)檢測3 次， 判斷試紙條的特異性。

8. 檢測的準(zhǔn)確性。 按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部文件要求，以假陽性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準(zhǔn)確性。 取經(jīng)儀器確證的50 份陰性飼料樣品 （質(zhì)量濃度＜1 μg/kg）、 50 份陽性飼料樣品 （質(zhì)量濃度＞1 μg/kg）， 用該試紙條檢測雜色曲霉素藥物殘留， 計算假陽性率和假陰性率。《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》 規(guī)定， 試紙條假陽性率應(yīng)＜5%， 假陰性率應(yīng)為零[14～15]。

9. 試紙條的穩(wěn)定性。 將試紙條保存于2～8℃環(huán)境中， 每隔1 個月檢測試紙條的準(zhǔn)確性， 連續(xù)測定 15 個月[14～15]。 具體方法為： 分別檢測經(jīng)儀器確證的 20 份陰性飼料樣品 （質(zhì)量濃度＜1 μg/kg）、 20份陽性飼料樣品 （質(zhì)量濃度＞1 μg/kg）， 重復(fù)測定2次， 根據(jù)實驗結(jié)果判定試紙條的穩(wěn)定性[14～15]。

二、 結(jié)果與分析

（一） 樣品檢測限配制雜色曲霉素濃度分別為 0、 0.5、 1、 1.5、 2、 2.5 μg/L 的小麥和玉米飼料樣品， 按照上文 “檢測方法” 步驟進(jìn)行檢測， 確定檢測限[14～15]。 結(jié)果顯示， 該試紙條的檢測限為 1 μg/kg （見表 1）。

表1 雜色曲霉素快速檢測試紙條的檢測限

（二） 特異性以該試紙條檢測 500 μg/kg 的黃曲霉毒素B1、 黃曲霉毒素M1、 赭曲霉素等藥物，結(jié)果均呈陰性， 表明該試紙條特異性較好。

（三） 準(zhǔn)確性用該試紙條分別檢測50 份陰性小麥飼料樣品和50 份陰性玉米飼料樣品， 檢測結(jié)果如表 2 所示， 均為陰性， 說明假陽性率＜5%； 用該試紙條分別檢測50 份陽性小麥飼料樣品和50 份陽性玉米飼料樣品， 檢測結(jié)果如表2 所示， 均為陽性， 說明試紙條假陰性率為零， 符合 《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》 要求[14～15]。

表2 準(zhǔn)確性測定

（四） 穩(wěn)定性對試紙條進(jìn)行穩(wěn)定性測試， 測定結(jié)果見表 3， 可以看出， 在 12 個月內(nèi)， 試紙條的假陽性率和假陰性率均符合要求， 從第13 個月起， 試紙條會出現(xiàn)少量失效、 假陽性等現(xiàn)象[14～15]。

表3 穩(wěn)定性測定

三、 結(jié)論

本文制備出的雜色曲霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原， 最終制備出商品化的膠體金免疫層析試紙條。 按照 《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》 要求， 對試紙條進(jìn)行了特異性、 準(zhǔn)確性、 穩(wěn)定性等性能測試， 均符合要求。 試紙條的檢測時間僅為15 min， 比現(xiàn)有文獻(xiàn)中儀器方法用時更短， 操作更簡便。 試紙條檢測限為1 μg/kg， 靈敏度較高。