基于網絡藥理學研究玄參治療糖尿病足的作用機制*

劉駿逸，程衛東，李朝暉，劉曉東，彭 鵬，申 晟

[1.河南省洛陽正骨醫院(河南省骨科醫院)，河南 鄭州 450000； 2.珠海市中西醫結合醫院，廣東 珠海 519000]

根據國際糖尿病協會統計，2015年的全球糖尿病患者總數已經達到4.15億，到2040年預期將達到6.42億人，其中接近3/4的糖尿病患者生活在低中收入水平國家[1]。糖尿病足(diabetic foot，DF)屬于糖尿病較為嚴重的并發癥之一，也是最常見的截肢原因[2]。據估計，每年有19%～34%的糖尿病患者發生糖尿病足；約40%的糖尿病足愈合患者在1年內潰瘍復發，60%的患者3年內復發，65%的患者5年內復發[3]。多種因素均可導致糖尿病足的復發，而糖尿病足的復發將對患者的心理及生理產生極大的不良影響，且會增加患者關于傷口處理所產生的經濟負擔[4]。最近一項Meta分析顯示：DF患者的性別、既往DF潰瘍時長、吸煙、跖側面潰瘍、糖尿病患病時長及周圍血管病變、神經病變均為DF發生的風險因素[5]。

DF的治療十分困難，且其預后受全身、局部、治療等多方面影響。在治療糖尿病足的過程中，中西醫結合療法具有明顯優勢。四妙勇安湯為治療糖尿病足的代表方劑之一[6-7]，由金銀花、玄參、當歸、甘草4味藥物組成，是治療脈管炎、脫疽熱毒熾盛證的經典名方。方中玄參清熱涼血，瀉火解毒。現代藥理學研究表明：玄參為玄參科植物玄參的根，具有舒張血管、降血糖、抗炎、抗菌、抗癌等作用，在治療DF中起到了至關重要的作用[8-9]。但是由于中草藥所含成分的多樣性，目前對于玄參治療糖尿病足的作用機制尚不完全清楚。筆者采用網絡藥理學技術，通過“疾病表型-基因-靶點-藥物”的模式，全方位、多角度深入研究玄參治療糖尿病足的作用機制，以期為深入研究玄參及含有玄參的中藥復方治療糖尿病足的臨床運用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 玄參的化學成分及作用靶點的預測

采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)[10]查詢。關鍵詞：玄參。限定條件：口服利用度(oral bioavailability，OB)>30%，類藥性(drug-likeness，DL)>0.18[11-12]。在數據庫中篩選出玄參的化學成分和對應靶點。通過蛋白質數據庫(UniProt)將靶點的名稱轉換為簡稱，將物種設置為人，對靶點基因和蛋白信息進行校正，獲得標準的Symbol名稱。

1.2 獲取糖尿病足-玄參靶點交集

通過人類基因綜合數據庫(GeneCards)和人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM)查詢疾病靶點，以“糖尿病足”“diabetic foot”為檢索詞搜索，將搜索結果合并、規范化、去重后，與1.1項下的結果取交集，獲得玄參-糖尿病足靶點交集。

1.3 構建玄參成分-靶點-糖尿病足網絡

通過Cytoscape 3.7軟件中的網絡分析功能，調節節點的顏色及度值(Degree)，獲得玄參的主要化學成分以及相互作用網絡圖。

1.4 構建藥物-疾病蛋白質-蛋白質相互作用網絡

在String 11.0數據庫中，限定物種為人，忽略孤立節點，選擇結合分數>0.4的連接關系，導入1.2項下玄參-糖尿病足結果；得到玄參-糖尿病足靶點蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)網絡，利用R語言軟件(版本4.0.2)，分析PPI網絡數據后做圖。

1.5 GO富集分析及KEGG通路富集分析

采用DAVID 6.8數據庫，導入玄參-糖尿病足交集基因，限定物種為人類，設定閾值P<0.05，進行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，再將結果導入基迪奧生物信息云平臺(OmicShare)繪制通路信息圖。

2 結 果

2.1 玄參化學成分及對應靶點的篩選結果

本研究以玄參為關鍵詞，TCMSP為數據庫，OB>30%、DL>0.18為搜索條件，共得到玄參化學成分9個；檢索玄參的作用靶點，根據選出的化學成分篩選出對應的靶點，共得到靶點36個。

2.2 糖尿病足相關靶點及玄參-糖尿病足交集靶點

使用關鍵詞“Diabetic foot”在GeneCards數據庫和OMIM數據庫中進行檢索，分別得到糖尿病足的相關靶點4 553個和192個，去除重復靶點，共得到不重復靶點4 726個，與2.1項下結果取交集，得到玄參-糖尿病足交集靶點28個。

2.3 玄參-活性成分-靶點-糖尿病足網絡及分析結果

將玄參的活性成分及交集靶點結果導入Cytoscape數據庫，得到玄參-活性成分-靶點-糖尿病足網絡，見圖1。網絡中，共有34個節點、69條邊，藍色圓形代表活性成分，綠色長方形代表靶點，邊表示活性成分與靶標之間相互聯系。活性成分中Degree值最高者為β-谷甾醇，接下來依次是柳杉酚、玄參苷，其他類型谷甾醇如γ-谷甾醇、α1-谷甾醇，其所對應的作用靶點分別為21，10，3，1個。由網絡可知，玄參治療糖尿病足是由多成分參與并作用于多個靶點的，非單一模式，其中β-谷甾醇可能是玄參治療糖尿病足的關鍵成分。

2.4 構建PPI網絡和篩選核心靶點

導入玄參-糖尿病足的交集靶點至STRING 11.0數據庫，構建PPI網絡，含有28個節點和84條邊，表示有28個相關蛋白參與，以及84個蛋白之間的相互作用關系。將PPI網絡數據導入Cytoscape數據庫，依據蛋白的Degree值調節節點大小，Degree值越大，節點越大。見圖2。由此可推測，玄參治療糖尿病足可能與半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3(Caspase 3,CASP3)、前列腺素內過氧化物合酶2(Prostagrandin-endoperoxid synthase 2,PTGS2)、乙酰膽堿酯酶(A cetylcholinesterase,AChE)、JUN原癌基因(Jun Proto-oncogene,JUN)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶9(Caspase 9,CASP9)這些節點有關。

圖2 玄參-糖尿病足交集靶蛋白PPI網絡圖

2.5 GO和KEGG富集分析

利用David 6.8在線數據庫對玄參治療糖尿病足的有效作用靶點進行GO功能富集分析。以P<0.05為閾值進行篩選，結果見圖3。GO富集分析包含3個部分：生物過程(Biological Process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)和細胞組分(Cellular component,CC)。確定了72項條目：其中BP部分45項，列出前20項；CC部分12項，列出前5項；MF部分15項，列出前5項。見表1。

圖3 玄參有效成分對應靶標的KEGG通路富集分析結果圖

表1 玄參-糖尿病足有效作用靶點GO富集分析結果

以P<0.05為閾值，共發現82條KEGG通路。根據P值由小到大的順序，取排名前20的通路，采用Omicshare網站作圖，進行可視化展示，見圖4。其中信號傳導、神經系統、內分泌系統、癌癥、感染5大類的信號通路包含的基因最多，分別包含17，14，13，12，10個基因。具體涉及通路包括神經活性配體-受體相互作用通路、乙型肝炎、麻疹、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、EB病毒感染、1型人體免疫缺陷病毒感染、人巨細胞病毒感染、大腸癌、細胞凋亡、心肌細胞的腎上腺素信號傳導、鈣離子信號通路、凋亡-多種、鉑耐藥、p53信號通路、小細胞肺癌、唾液分泌、白細胞介素(IL)-17信號通路、晚期糖基化終末產物(AGE)-AGE受體(RAGE)信號通路、膽堿能突觸、乳腺癌、雌激素信號通路、血清素能突觸等，主要包括神經活性配體-受體相互作用通路、AGE-RAGE信號通路、Ca2+信號通路、雌激素信號通路、IL-17信號通路、p53信號通路等6個通路，說明玄參可通過影響多個通路治療糖尿病足。

圖4 玄參-糖尿病足KEGG富集前20條信號通路圖

3 討 論

玄參性微寒，味苦、甘、咸，歸肺、胃、腎經，具有抗炎、抗菌、降血糖、抗腫瘤、解熱鎮痛等作用。《本草正義》曰：“玄參，稟至陰之性，專主熱病，味苦則泄降下行，故能治臟腑熱結等證。味又辛而微咸，故直走血分而通血瘀。亦能外行于經隧，而消散熱結之癰腫。寒而不峻，潤而不膩，性情與知、柏、生地近似，而較為和緩，流弊差輕。玄參賦稟陰寒，能退邪熱，而究非滋益之品。”四妙勇安湯為治療糖尿病足的代表方劑，其中玄參為該方的主要用藥。雖然越來越多的研究證實了玄參對糖尿病足治療的有效性[13]，但其治療機制尚未明確。本研究基于網絡藥理學對玄參治療糖尿病足的機制進行數據挖掘，研究結果發現：玄參治療糖尿病足的主要化學成分為β-谷甾醇，接下來依次是柳杉酚、玄參苷、谷甾醇等。既往研究表明：β-谷甾醇屬于植物甾醇，結構與膽固醇類似；在高脂飲食和蔗糖誘導的2型糖尿病大鼠中，β-谷甾醇可通過調節IRS-1/Akt信號通路，減弱脂肪組織中的胰島素抵抗[14]。玄參苷具有在人體外周血單核細胞中誘導調節性T細胞的能力。研究表明:玄參苷可增加靜息電位人體外周血單核細胞中Foxp3、轉化生長因子-β和IL-10 mRNA的表達，有作為消炎藥的巨大潛力[15]。目前，尚缺乏關于柳杉酚治療糖尿病足的相關研究，這為今后的實驗研究提供了新的方向。

玄參-糖尿病足PPI網絡包括28個相關蛋白和84個蛋白之間的相互作用關系，其中主要靶點包括CASP3、DTGS2、AChE、JUN、CASP9等，這說明玄參治療糖尿病足的機制是多成分、多靶點的。

玄參-糖尿病足KEGG通路富集分析結果發現了82條顯著相關的通路。在所篩選出的通路中，信號傳導、神經系統、內分泌系統、癌癥、感染5大類的信號通路包含的基因最多，主要涉及神經活性配體-受體相互作用通路、鈣離子信號通路、p53信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、雌激素信號通路。KHANAL P等[16]研究發現,神經活性配體-受體相互作用通路可作為調節糖尿病蛋白的主要通路，能夠調節絕大部分降糖的蛋白。內皮細胞的胰島素抵抗是造成胰島素抵抗及2型糖尿病患者發生動脈粥樣硬化和心血管疾病的主要原因，而下肢動脈粥樣硬化造成肢體遠端缺血、壞死、感染是糖尿病足的直接原因。研究表明：多種基因增強內皮細胞中的胰島素敏感性都是依賴鈣離子信號通路的，如細胞膜鈣轉運三磷酸腺苷酶1。p53是一種大小為53kD的蛋白質，首先在腫瘤的病毒研究中被發現，是目前發現的與人類腫瘤相關性最高的基因。TP53也是人類癌癥中最常見的突變基因[17]。p53蛋白不但可以限制腫瘤發展，響應DNA損傷、缺氧、癌基因表達、營養剝奪及核糖體功能障礙等多種信號，而且可以控制多種生物反應過程，如組織重塑、自噬、ROS控制，以及代謝過程等[18-20]。IL-17是一種促炎性細胞因子，與多種自身免疫性疾病有關。對自身免疫性糖尿病動物模型和1型糖尿病患者的相關研究均提示，IL-17參與糖尿病的發病機制。IL-17可以增加炎癥反應，加速氧化應激和細胞凋亡。減少IL-17，可以降低血糖，提高血清胰島素。IL-17聯合鏈脲霉素會增加對胰島MIN6細胞的破壞[21]。研究[22]表明，阻斷IL-17可以減輕糖尿病視網膜病變。糖尿病足是糖尿病的嚴重并發癥之一，主要表現為足部的潰瘍及創面難以愈合。AGE-RAGE信號通路是糖尿病足發生的一個重要環節。AGE是多種不同中間產物，是縮合、重排、裂解、氧化修飾等非酶促糖基化反應產物。正常人體內的AGE含量較低，但糖尿病患者體內AGE的生成會明顯加速。AGE的蓄積是導致神經、血管等組織器官損傷的重要病理基礎[23-24]。已有研究表明，雌激素受體存在β細胞中，雌激素可以影響胰島β細胞中胰島素的合成與分泌，同時影響β細胞的存活和胰島素基因的表達。雌激素干預可以降低糖尿病小鼠的血糖水平，增加胰島素分泌，增強胰島素基因的表達[25]。

綜上所述，玄參治療糖尿病足的機制具有多成分、多靶點、多通路等特征，相較于西藥單一作用機制更具有優勢。玄參的主要治療成分為β-谷甾醇，作用靶點包括CASP3、PTGS2、AChE、JUN、CASP9，核心通路涉及神經活性配體-受體相互作用通路、鈣離子信號通路、p53信號通路、IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、雌激素信號通路6個通路。采用網絡藥理學研究玄參治療糖尿病足的機制僅是分子機制的預測，為進一步深入探討其作用機制指明了方向，后期將在此研究基礎上開展動物實驗和臨床研究來驗證其作用機制。