山茱萸果核中白樺脂酸和熊果酸含量測定

李軍 姜華 張寧 王琦 陳雯雯 宋文博

【摘 要】 目的：測定山萸肉加工過程的下腳料-果核的果殼果仁中白樺脂酸和熊果酸的含量。方法：采用WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：甲醇-水-磷酸 （80∶20∶0.08）;流速：1.0 mL·min-1;檢測波長：210 nm;進樣量：10.0 μL。結果：山茱萸果殼中白樺脂酸的含量范圍為3.65～5.34 mg·g-1，熊果酸的含量范圍為0.87～1.72mg·g-1。山茱萸果仁中白樺脂酸的含量范圍為3.61～4.97 mg·g-1，熊果酸的含量范圍為4.88～7.46 mg·g-1。結論：實驗建立的山茱萸果核中果殼和果仁的白樺脂酸和熊果酸的含量測定方法穩定、可靠，可以用來科學評價山茱萸果核中白樺脂酸和熊果酸的含量，為山茱萸果核的開發利用奠定基礎。

【關鍵詞】 山茱萸;白樺脂酸;熊果酸;含量測定

【中圖分類號】R917?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2021）16-0045-04

Determination of Betulinic Acid and Ursolic Acid in the Nutlet of Cornus officinalis

LI Jun JIANG Hua* ZHANG Ning WANG Qi CHEN Wenwen SONG Wenbo

Chemical Engineering and Pharmaceutics College， Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003， China

Abstract：Objective To determine the content of betulinic acid and ursolic acid inthe shell and kernel of the nutlet of Cornus officinals Sieb.et Zucc..Methods A HPLC method was employed to determine the betulinic acid and ureolic acid contents， which was carried out on a WondaSil C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with the mobile phase of methanol-water-H3PO4（80∶20∶0.08） and the flow rate at 1.0 mL·min-1and the wavelengths of 210 nm.Results The content of betulinic acid in the shell and kernel ranged from 3.65～5.34 mg·g-1and 3.61～4.97 mg·g-1.And the content of ursolic acid in the shell and kernel ranged from 0.87～1.72 mg·g-1and 4.88～7.46 mg·g-1.In general， the content of betulinic acid is higher than that of ursolic acid because the weight of the shell in the nutlet? is heavier than that of the kernel.Conclusion This method is simple and reliable， which can be used for the determination of betulinic acid and ureolic acid in the nutlet of Cornus officinals Sieb.et Zucc.

Keywords：Cornus officinals Sieb.et Zucc.; Betulinic Acid; Ursolic Acid; Content Determination

山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）為山茱萸科山茱萸屬植物，為落葉喬木或灌木，集中分布于我國豫、陜、鄂、浙等省。生于海拔400～1500 m，的林緣或森林中。

山茱萸果實的果肉是一味常用中藥材，稱之為山萸肉、棗皮等，中醫臨床用于眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽痿遺精、遺尿尿頻、崩漏帶下、大汗虛脫等癥[1]。現代藥理學[2-5]證實山茱萸中的成分具有神經保護、心肌保護、抗腫瘤、抗氧化等作用。山萸肉臨床用量較大，然而在加工過程中，剩余的果核基本是遺棄處理。這種做法不僅不利于環保，同時也造成很大的浪費。因此，對山茱萸果核的再利用，就顯得尤為重要。文獻檢索顯示，山茱萸果核已經被用來制備活性炭[6]、提取栲膠[7]等，然而這些方法對山茱萸果核的利用程度較低。

為了進一步挖掘山茱萸果核的利用價值，前期對山茱萸果核中化學成分進行了研究，發現其中含有較多的白樺脂酸和熊果酸。白樺脂酸具有鎮咳祛痰、清熱利濕、消腫解毒、提高機體免疫力、調血脂、抗腫瘤等作用[8]，熊果酸則具有殺蟲、消炎、防流感、抗糖尿病等功能[9]。然而，目前未見有對于山茱萸果核中果殼和果仁的白樺脂酸和熊果酸含量測定的報道，這極大限制了山茱萸果核中該類成分的利用。基于此，本實驗建立同時測定山茱萸果核中果殼和果仁的白樺脂酸和熊果酸的方法，并采用該方法測定多個產地山茱萸果核的果殼果仁中白樺脂酸和熊果酸的含量。

1 材料

1.1 材料與試劑 白樺脂酸和熊果酸（購自上海源葉生物科技公司）;山茱萸果核（南陽西峽，洛陽嵩縣的車村、舊縣、紙坊，洛陽欒川的三川、冷水、叫河），經河南科技大學醫學院路西明教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）成熟果實的果核;甲醇（DIKMA公司，色譜純），重蒸水自制，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備 Shimazu LC-15C高效液相色譜儀;旋轉蒸發儀（RE-52AA，鄭州長城科工貿有限公司）;數控超聲波清洗器（KQ500DE型，昆山市超聲儀器有限公司）;電子分析天平（FA2004B型，上海佑科儀器儀表有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG101-3A型，鞏義予華儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 WondaSil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：甲醇-水-磷酸 （80∶20∶0.08）;流速：1.0 mL·min-1;檢測波長：210 nm;進樣量：10.0 μL。在此色譜條件下，白樺脂酸和熊果酸分離度良好。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的白樺脂酸和熊果酸對照品適量，置于同一10 mL 容量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得白樺脂酸濃度為 0.21 g·L-1和熊果酸濃度為0.20 g·L-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取大小均勻的山茱萸果核適量，分離出果殼和果仁，粉碎，分別精密稱取0.5 g，置于不同的容量瓶中，加甲醇10 mL，精密稱重，然后超聲提取0.5 h，用甲醇補足至原重，混合均勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取取濾液，即得。

2.4 線性關系考察 精密吸取白樺脂酸和熊果酸的對照品溶液2.0、5.0、10.0、 15.0、20.0 μL注入液相色譜儀，依“2.1”項下色譜條件記錄峰面積。以峰面積（Y×10-5）為縱坐標，進樣量（X）為橫坐標進行線性回歸，得白樺脂酸和熊果酸的回歸方程分別為：Y=3.6246X-0.009（r=0.999 8）;Y=6.0447X-0.0723（r=0.999 8）。白樺脂酸和熊果酸的線性范圍分別為：0.42～4.2 μg，0.4～4.0 μg。

2.5 精密度考察 取南陽西峽產山茱萸果核的果殼和果核粉末0.5 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，連續進樣5 次，每次10.0 μL，測定峰面積。結果果殼和果核中白樺脂酸和熊果酸峰面積的RSD 值分別為1.1%、0.7%和1.8%、2.1%，表明精密度良好。

2.6 穩定性考察 取南陽西峽產山茱萸果核的果殼和果核粉末0.5 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、10、12 h 進樣，每次10.0 μL，測定峰面積。結果果殼和果核中白樺脂酸和熊果酸峰面積的RSD 值分別為1.5%、1.0%和0.8%、1.3%，表明供試品溶液在12 h 內基本穩定。

2.7 重現性考察 取南陽西峽產山茱萸果核的果殼和果核粉末5 份，每份0.5 g，精密稱定，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10.0 μL 進樣，測定峰面積并計算含量。結果果殼中白樺脂酸和熊果酸含量的含量分別為4.29 mg·g-1、1.14 mg·g-1，RSD 值分別為0.7%、2.2%;果仁中白樺脂酸和熊果酸含量分別為3.80 mg·g-1、5.61 mg·g-1，RSD 值分別為2.0%，1.4%。表明該方法重復性良好。

2.8 回收率考察 精密稱取已知含量的南陽西峽產山茱萸果核的果殼和果核粉末各9 份，每份0.25 g，各分成3 組，每組3 份，以白樺脂酸和熊果酸含量的80%、100%、120%為梯度，分別精密加入各對照品溶液適量，按供試品溶液制備方法操作，并進樣。計算平均加樣回收率，結果見表1。

2.9 樣品測定 取不同產地的山茱萸果核，按照2.2.3項下的方法制備供試品溶液，并依法測定，計算樣品中白樺酯酸和熊果酸的含量，結果見表2。可見，山茱萸果殼中白樺脂酸的含量范圍為3.65～5.34 mg·g-1，熊果酸的含量范圍為0.87～1.72 mg·g-1。山茱萸果仁中白樺脂酸的含量范圍為3.61～4.97 mg·g-1，熊果酸的含量范圍為4.88～7.46 mg·g-1。

3 討論

白樺脂酸和熊果酸的結構中均含有一個羧基，呈弱酸性，在中性的流動相中可發生電離，在色譜柱分離過程中形成拖尾峰，影響分離效果，而在流動相中加酸是抑制酸性成分電離的有效方法[10]。本實驗中分別嘗試了磷酸和冰醋酸來調整流動相的酸性，結果表明磷酸的效果較好，而冰醋酸的效果較差。至于磷酸的加入量，從0.01%開始逐漸增加，發現隨著流動相中磷酸含量的逐漸增加，白樺脂酸和熊果酸的峰形逐漸改善，其中白樺脂酸的效果尤為明顯。當磷酸的含量增加到0.08%的比例時，白樺脂酸和熊果酸基本呈正態峰，且分離度良好，因此確定流動相中磷酸的加入量為0.08%。

將白樺脂酸和熊果酸在200～400 nm范圍內進行波長掃描，結果顯示，該二成分均沒有最大吸收峰，在200～220 nm之間存在末端吸收。因此，將檢測波長確定在210 nm。

表2中測定的結果顯示，山茱萸果殼中白樺脂酸的含量偏高，而在果仁中熊果酸的含量偏高。果殼樣品中白樺脂酸含量最高的是欒川叫河樣品，最低的為欒川三川的樣品。在山茱萸的果仁中，熊果酸的含量最高的是欒川三川和嵩縣車村樣品，最低的是嵩縣舊縣的樣品。

本實驗建立的山茱萸果核中果殼和果仁的白樺脂酸和熊果酸含量測定方法穩定、可靠，為山茱萸果核中白樺脂酸和熊果酸的利用奠定基礎。

參考文獻

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（收稿日期：2021-01-15 編輯：劉 斌）

基金項目：河南省科技攻關項目（No.182102311125）;河南科技大學博士科研啟動基金項目（13480058）河南科技大學大學生訓練計劃（2020139，2020143）。

作者簡介：李軍（1978-），男，漢族，博士，副教授、碩士生導師，研究方向為中藥活性成分（組）研究。E-mail：huomanlee@126.com

通信作者：姜華（1981-）， 女，漢族，博士，副教授，研究方向為中藥活性成分（組）研究。E-mail： hltl2003@126.com