低劑量輻射對小鼠腸道損傷的影響

胡昌坤，張雪梅，馬增春，高 月

(1.安徽醫科大學，合肥 230032；2.軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所，北京 100850；3.廣東藥科大學，廣州 510006)

電離輻射在科技日益發展的今天應用于許多領域(科研、醫學、軍事、工業)，對于長期在輻射環境下的工作人員，低劑量電離輻射(low dose radiation, LDR)也是一個重要的影響健康的因素[1]，美國國家輻射防護和測量委員會(NCRP)在2020年發布的一份題為“整合輻射生物學和流行病學的信息以加強低劑量健康風險評估的方法”的報告，足以證明對低劑量引起健康風險的重視[2]。

近幾年來關于低劑量輻射致癌的報告[3]，以及LDR機制的研究普遍認為LDR誘導的反應與高劑量電離輻射(how dose radiation, HDR)誘導的反應不同，存在著獨特的生理機制[4]，除了癌癥，低劑量還會帶來組織反應和非癌癥健康影響(如白內障、中樞神經系統功能障礙和循環系統疾病)等一系列不確定性的健康風險，有證據表明，0.5 Gy以下的劑量也可能增加心血管疾病的長期風險[5-6]。所以對于輻射生物學領域來說最具爭議的就是關于低劑量輻射的生物效應的探討和研究。免疫系統對于機體是抵御外界侵入的重要防御系統之一[7]，腸道作為人體最大的免疫器官，是人體防御外界侵入的第一道防線[8]，放射性腸損傷一直以來以急性腸損傷研究較多[9]，但是目前鮮有對于LDR腸道損傷相關的研究[10]，因此建立低劑量輻射小鼠腸道損傷模型對于預防低劑量輻射藥物的研發與評價具有重要的研究意義。本文通過比較不同低劑量輻射下小鼠腸道相關損傷指標的變化，以此篩選出LDR腸道小鼠損傷最優照射劑量。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性Balb/c小鼠40只，6周齡，18～22 g(北京維通利華實驗動物技術有限公司提供)，隨機分為4組，分別為空白對照組(NC)、低劑量組(L組，0.04 Gy/d×5 d，累積0.2 Gy)、中劑量組(M組，0.12 Gy/d×5 d，累積0.6 Gy)、高劑量組(H組，0.2 Gy/d×5 d，累積1.0 Gy)，每組10只小鼠。

1.2 輻射源及主要儀器

60Co γ射線照射源為軍事醫學研究院輻射醫學研究所提供，單次照射劑量率為 3.01 cGy/min；PE VictorX 型酶標儀，美國Perkin Elmer公司；全自動血細胞分析儀(Sysmex2000i)。

1.3 實驗試劑

脂質氧化(MDA)檢測試劑盒(貨號S0131 M)、SOD活性檢測試劑盒(貨號S0101 M)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(貨號C1088)均購于碧云天生物技術有限公司，TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6 ELISA檢測試劑盒均購于酶免生物技術有限公司，γ-H2AX購于美國Cell Signaling Technology。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1照射方法

每天將小鼠置于離照射源最長距離(4 m)處，并用鉛磚全身屏蔽，以達到照射裝置最低劑量率，3種劑量分別連續照射5天。

1.4.2體重

照射前1天及每天照射后立即對小鼠稱重。

1.4.3臟器指數

照射后24小時取小鼠脾臟和胸腺稱重并計算臟器指數。

1.4.4外周血

照射結束后24小時鼠眼球取血，用全自動血細胞分析儀(Sysmex2000i)測定白細胞計數(WBC)、紅細胞計數(RBC)、血小板計數(PLT)、 血紅蛋白含量(HGB)、紅細胞比容(HCT)等指標。

1.4.5小腸組織MDA含量、SOD活性

照射結束后24小時取小鼠空腸組織勻漿，參照試劑盒說明書檢測MDA含量、SOD活性。

1.4.6小腸組織細胞因子含量

照射結束后24小時取小鼠空腸組織勻漿，參照試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6細胞因子含量。

1.4.7小腸組織DNA損傷

照射結束后2小時取小鼠十二指腸固定并制作成石蠟切片，石蠟切片經脫蠟、抗原修復、封閉、標記、顯色、復染等處理，進行免疫熒光γ-H2AX抗體染色觀察小腸組織DNA損傷。

1.4.8TUNEL法檢測小腸組織細胞凋亡

采用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒，參照試劑盒說明書進行檢測。石蠟切片經脫蠟、抗原修復、封閉、標記、顯色、復染等處理，熒光染色觀察小腸組織細胞凋亡情況。

1.5 統計學分析

采用 SPSS 22.0軟件包進行統計學分析，計量資料以均值±單次測量標準差表示，NC組與 L、M、H組之間采用t檢驗，L、M、H 組之間比較采用單因素方差分析。以p<0.05為差異具有統計學意義。圖表使用Prism8.0制作。

2 實驗結果

2.1 低劑量輻射對小鼠外周血象的影響

對外周血象實驗數據進行分析，結果列于表1。由表1可見，與對照組(NC)相比，照射組白細胞計數(WBC)均有所降低，其中H組有顯著性差異(p<0.01)，照射組血小板計數(PLT)均有所降低，L、M組顯著降低(p<0.05)，RBC、HGB、HCT亦有不同程度升高，但無統計學差異。以上結果表明，3種劑量照射后24小時均對小鼠造血系統有不同程度損傷。

表1 各組小鼠照射后外周血象的變化Tab.1 Effects of low dose radiation on peripheral blood cells of mice

2.2 低劑量輻射對小鼠體重的影響

圖1為各組小鼠照射期間體重的變化。由圖1可見，小鼠照射期間體重變化與對照組相比，照射組體重有所降低，其中M組體重降低最多，但無統計學意義。

圖1 各組小鼠照射期間體重的變化Fig.1 Changes in body weight afterirradiation in each group

2.3 低劑量輻射對小鼠臟器指數的影響

圖2為照后24小時各組小鼠臟器指數的變化。由圖2可見，與對照組(NC)相比，照射組脾臟指數(SI)均顯著性降低(L組p<0.05，M、H組p<0.01)，胸腺指數(TI)均有所降低但沒有顯著性差異。

*與對照組(NC)相比p<0.05；**與對照組(NC)相比p<0.01；n=6。圖2 各組小鼠照射后臟器指數的變化Fig.2 Changes of viscera index afterirradiation in each group

2.4 低劑量輻射對小鼠小腸組織SOD活性、MDA含量的影響

照射結束后24小時測定空腸組織中MDA含量、SOD活性，結果列于表2。由表2可見，與對照組(NC)相比，照射組小腸組織MDA含量明顯上升(L組p<0.05，M、H組p<0.01)，SOD活性有不同程度降低，但無統計學意義。

2.5 低劑量輻射對小鼠小腸組織細胞因子的影響

照射結束后24小時測定小鼠空腸組織細胞因子，結果示于圖3。由圖3可見，與對照組相比，各照射組中TNF-α、IL-2、IL-1β和IL-6作為代表性的促炎因子與照射劑量呈劑量依賴性升高，其中M、H組中IL-1β、IL-6、TNF-α升高具有統計學意義(IL-1β：M、H組p<0.05，IL-2：M組p<0.05、H組p<0.01，TNF-α：M、H組p<0.05)。

表2 照射后各組小鼠小腸組織中MDA含量、SOD活性Tab.2 MDA content and SOD activity in smallintestine of irradiated mice

*與對照組(NC)相比p<0.05；**與對照組(NC)相比p<0.01；n=6。圖3 照射后各組小鼠小腸組織中細胞因子的變化Fig.3 The expression of Cytokines in intestinaltissues of mice in each group

2.6 低劑量輻射對小鼠小腸組織DNA損傷程度

在照射結束后2小時對小鼠十二指腸進行γ-H2AX熒光染色，觀察DNA損傷程度，結果示于圖4。由圖4可見，與對照組相比，照射組中小腸組織有明顯的DNA損傷，其中M和H組中損傷現象最為嚴重，主要集中于小腸隱窩部位，L組有相對較輕的損傷改變。

圖4 照射后各組小腸組織DNA損傷變化(DAPI：細胞染色，Merge：雙色整合)Fig.4 Changes of DNA damage in small intestine of mice after irradiation

圖5 照射后各組小鼠小腸組織細胞凋亡程度(DAPI：細胞染色，Merge：雙色整合)Fig.5 The degree of cell apoptosis in small intestine tissue of mice after irradiation

2.7 低劑量輻射對小鼠小腸組織細胞凋亡的影響

在照射結束后24小時對小鼠十二指腸進行TUNEL熒光染色，觀察細胞凋亡程度，結果示于圖5。由圖5可見，與對照組(NC)相比，照射組中小腸組織有明顯細胞凋亡，其中M組和H組最為嚴重。

3 討論

目前所認知的HDR損傷具有全身效應，對于機體全身各個器官都有不同損傷。然而LDR相對于HDR有自己獨特的作用機制[11]，近年來低劑量輻射誘導的生物效應(細胞間介質、炎癥和免疫反應、癌癥和非癌癥誘導)都與免疫系統密切相關[12-14]。Flockerzi等人[15]對具有不同修復能力的小鼠品系的研究表明，分次低劑量輻射(每天100 mGy)會增加DNA損傷，累積劑量會影響肺實質中的復制和凋亡，從而影響肺功能。Cheda等人[16-18]已經證明LDR可以通過改變免疫細胞群和細胞因子釋放以及增強先天性和適應性免疫細胞的相互作用來增強免疫反應。Tada[19]也提出長期LDR可對中樞神經系統的整體、組織、細胞及基因水平產生影響，導致多種神經性疾病的發生。腸道作為人體最大的免疫器官，放射性腸損傷作為經典放射性損傷特征之一是輻射損傷熱點研究領域[20]。然而對于LDR腸道損傷國內外研究較少，所以我們此次研究LDR對于小鼠腸道損傷的影響對LDR腸道損傷相關研究提供了科學依據。

本文主要從腸道輻射免疫損傷調控機理中三個方面：DNA損傷、細胞凋亡、細胞因子以及其他一些經典指標(臟器指數，外周血象等)探討低劑量輻射對小鼠腸道損傷的影響，前期大量的研究已經證明輻射會導致DNA損傷，可以通過生物學指標改變的方法來測定[21]。γ-H2AX作為DNA損傷指標測定的金標準[22]，我們用γ-H2AX免疫熒光來評價不同劑量下腸道早期DNA損傷程度的變化。結果發現相對于對照組(NC)，M、H組小腸組織DNA損傷最為明顯。細胞凋亡是機體免疫損傷的標志之一，關于凋亡的機理已有諸多研究[23-24]，通過測定小腸組織細胞凋亡程度來反映腸道免疫系統損傷，結果發現相對于對照組(NC)，M、H組小腸組織細胞凋亡最為明顯。細胞因子(cytokine)是由免疫細胞及相關細胞產生的一類調節細胞功能的高活性、多功能的多肽分子[25-26]，在機體免疫應答、炎癥反應等起著重要作用，越來越多的實驗研究表明，低劑量全身外照射可以誘導細胞因子的產生，影響機體免疫功能[27]，通過測定小腸組織中炎癥細胞因子的變化來觀察腸道損傷程度。結果表明，相比于對照組(NC)，M、H組細胞因子有明顯上升趨勢并有相應統計學意義。

綜上所述，本文通過比較小鼠照射前后體重、臟器指數、MDA含量、SOD活性、DNA損傷、細胞因子、細胞凋亡等指標的變化，最終確定低劑量輻射小鼠腸道損傷模型的最佳照射方案為每天照射0.12 Gy連續照射5天累積0.6 Gy。本實驗為低劑量輻射腸道損傷評價提供了新的科學依據與方法，后續研究用此照射劑量和方法進一步進行低劑量輻射藥物干預實驗。