東洞庭湖表層水體中抗生素及抗性基因的賦存特征與源分析

宋冉冉, 國曉春, 盧少勇*, 劉曉暉, 王曉慧

1.北京化工大學化學工程學院, 北京 100029 2.中國環境科學研究院， 湖泊水污染治理與生態修復技術國家工程實驗室, 環境基準與風險評估國家重點實驗室, 北京 100012

自20世紀30年代以來，抗生素被廣泛應用于人畜疾病治療及農業活動等方面，然而只有25%～75%的抗生素能被吸收，剩余抗生素會以原形或代謝物形式經由糞尿排出體外[1-4]. 未被吸收的抗生素進入環境中不僅會增加環境污染負荷，還會誘導產生一些耐藥菌群或抗生素抗性基因(ARGs)[5-7]. 環境中的ARGs可通過食物鏈進入人體，影響疾病治療效果及危害人體健康[8-9]. 世界衛生組織已將抗生素耐藥性作為重大的全球性公共健康問題之一[10]. 此外，ARGs可產生特殊的生態毒理效應，通過水平轉移在菌間傳遞，也可隨微生物繁殖傳給子代，對公共衛生、食品和飲用水安全構成嚴重威脅[11-12].

2006年，Pruden等[13]首次將ARGs視為新興污染物提出，由此ARGs開始受到世界范圍內越來越多研究者的關注，在美國[14]、中國[15]、瑞士[16]、日本[17]、意大利[10]和澳大利亞[18]等國家均檢測出了ARGs. 我國作為世界上較大的抗生素生產國和消費國，每年抗生素生產量和用量分別達24.8×104和16.2×104t，且超過5 t的抗生素排入水環境中[19-20]，導致ARGs在我國鄱陽湖[21]、洪澤湖[22]、博斯騰湖[4]、洪湖[23]、太湖[24]等水體中被廣泛檢出.

水環境是ARGs重要的聚集地，其可通過直接或間接途徑傳播給人類和動物，產生健康風險[25]. 除背景水平的ARGs(微生物的內在抗性)外，外源輸入是水環境中ARGs的重要來源，包括醫療廢水、畜禽養殖廢水、水產養殖廢水和污水處理廠出水等[26-27]. 目前，對湖泊內ARGs的研究主要集中在污染水平分析，對湖泊水環境與陸地污染源ARGs的響應關系研究還比較少，進行湖泊內陸地污染源中ARGs污染特征的研究及量化其對湖內ARGs污染的貢獻，是亟需解決的科學問題. 東洞庭湖作為洞庭湖流域東、西、南三湖中最大、最完整的集水盆地，是連接長江的紐帶，其水質的好壞直接影響生態環境安全及長江的水質. 東洞庭湖區水產養殖面積、畜禽養殖數量及人口密度均較大，向東洞庭湖輸送大量抗生素等污染物. 已有研究[19,28]表明，洞庭湖流域的抗生素排放量(3 440 t/a)居全國之首，且在洞庭湖流域東洞庭湖的污染水平最突出. 因此，研究ARGs在東洞庭湖流域中的賦存特征及遷移轉化至關重要. 已有的少數研究多關注東洞庭湖內抗生素隨季節的變化特征[28]以及沉積物中ARGs的含量[23]，但尚沒有關于表層水體中ARGs的污染特征以及陸地污染源對湖內ARGs貢獻的系統研究. 該研究通過調查東洞庭湖表層水體中ARGs和抗生素的污染情況，定量分析陸地污染源中的ARGs，并對抗生素等環境參數進行冗余分析，明確東洞庭湖表層水體中抗生素及ARGs的賦存特征，探討陸地污染源ARGs的分布及其入湖通量，以及ARGs豐度與抗生素及環境因素之間的相關關系，以期為東洞庭湖水體的污染防治提供可靠的數據支撐.

1 材料與方法

1.1 研究區域及樣品采集

東洞庭湖(28°59′N～29°38′N、112°43′E～113°15′E)位于湖南省東北部，總面積 1 328 km2，平均水深6.39 m. 常年湖容量1.78×1010m3，年均氣溫17 ℃，總降水量 1 200～1 330 mm，無霜期258～275 d. 1982年成立東洞庭湖自然保護區，1994年升格為國家級自然保護區，主要保護洞庭湖濕地生態和生物資源. 東洞庭湖作為長江中下游僅有的2個天然湖泊之一，在調節洪水徑流和保護物種基因或生物多樣性方面發揮著重要作用.

該研究在東洞庭湖流域設定了14個采樣點(X1～X14)，于2019年11月采集表層水樣品. 采用不銹鋼桶采集0～1 m的表層水，置于1 L棕色瓶中，不銹鋼桶和棕色瓶使用前均用甲醇和超純水清洗并用水樣潤洗過. 加入5 mL甲醇抑制微生物生長，運至實驗室于0～4 ℃冰箱保存. 同時，在東洞庭湖典型陸地污染源區(水產養殖區和污水處理廠)布設7個采樣點：錢糧湖鎮污水處理廠(W1采樣點)、水產養殖區(W2、W3、W4和W5采樣點)、岳陽市君山區第二污水廠(W6采樣點)和君山區城區污水凈化中心(W7采樣點)，利用不銹鋼桶采集水產養殖區廢水以及污水處理廠進、出水，置于1 L棕色瓶中. 采樣點布設如圖1所示.

圖1 東洞庭湖采樣點的布設Fig.1 Layout of sampling sites in East Dongting Lake

1.2 抗生素的檢測

1.2.1樣品預處理

用0.22 μm無菌濾膜過濾水樣(1 L)，加入0.5 g EDTA-2Na，用2 mol/L鹽酸調節pH至3.0. 樣品混勻后，以3 mL/min的流速通過Oasis HLB小柱進行富集. 富集完成后，用10 mL 5%甲醇水和10 mL純水洗壁，抽干2 h. 再用6 mL甲醇、6 mL甲醇(5%)氨溶液進行緩慢洗脫，收集洗脫液于15 mL氮吹管中，在40 ℃水浴條件下氮吹至近干. 最后用1 mL甲醇溶液進行復溶，過0.22 μm濾膜后裝入進樣小瓶中，于0～4 ℃冰箱保存待測.

1.2.2抗生素的測定

用超高效液相色譜串聯質譜儀(ACQUITY UPLC-XEVO-TQMSUSA, 美國Waters公司)測定水樣中的12種抗生素(均購自德國的Ehrenstorfer公司)，即羅紅霉素(Roxithromycin，ROM)、土霉素(Oxytetracycline，OTC)、紅霉素(Erythromycin，ERM)、四環素(Tetracycline，TC)、金霉素(Chlortetracycline，CTC)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SDZ)、磺胺二甲嘧啶(Sulfadimidine，SMZ)、磺胺甲惡唑(Sulfamethoxazole，SMX)、氧氟沙星(Ofloxacin，OFLO)、諾氟沙星(Norfloxacin，NOR)、環丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)和恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR). 所有化學試劑和溶劑均為色譜純，標準品(1 mg/L)溶于甲醇，在20 ℃下避光保存，直至分析.

色譜條件：色譜柱為UPLC BEH-C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫為40 ℃；流動相為溶劑A(0.01%甲酸水溶液)和溶劑B(100%乙腈). 梯度洗脫分離：0～1 min，15%～20%溶劑A，保持1 min；1～8 min，20%～30%溶劑A；8～17 min，30%～15%溶劑A，保持9 min.

質譜條件：離子源為電噴霧電離源(electrospray ionization，ESI)；干燥氣流速為10.0 L/min；霧化氣流速為3.0 L/min；加熱氣流速為10.0 L/min；加熱模塊溫度為400 ℃；掃描模式為多重反應監測(multiple-reaction monitoring，MRM).

1.3 抗性基因的檢測

1.3.1樣品預處理和DNA提取

用0.22 μm無菌濾膜過濾水樣(1 L)，利用基因組DNA提取試劑盒(美國OMEGA公司)提取DNA,并提取的DNA保存于-80 ℃冰箱備用.

1.3.2抗性基因的測定

采用實時熒光定量PCR技術(LineGene9600plus型熒光定量PCR儀，杭州博日科技有限公司)進行抗性基因的檢測，共檢測8種抗性基因：sul1、sul2、tetA、tetM、tetW、ermA、ermB、qnrS.引物序列和PCR反應條件見表1. PCR條件：在95 ℃下初始變性3 min，隨后在95 ℃下保持30 s，在所需退火溫度(見表1)下退火30 s，最后在72 ℃下延伸40 s，所有步驟循環35次. ARGs的標準曲線呈現良好的線性關系(R2>0.99)，標準品擴增效率為88.93%～106.22%，滿足試驗要求.

表1 抗性基因的引物序列和PCR反應條件

1.4 水質參數測定

利用EXO2便攜式多參數水質檢測儀(美國YSI公司)檢測水樣的pH、氧化還原電位(ORP)、電導率(EC)、DO濃度和溫度(T). 利用DR5000紫外分光光度計(美國HACH公司)檢測水樣中TN、TP、NH4+-N、NO3--N和正磷酸鹽(M3PO4)的濃度.

1.5 陸地污染源入湖通量估算

污水處理廠按照點源排放考慮，根據式(1)[29]估算入湖通量：

(1)

式中：W為估算時間段內污染物的入湖通量，copies/a；n為估算時間段內的采樣次數，該研究取值為1；K為時段轉化系數，取值365；Qi為排放流量，m3/d；Ci為污染物濃度，copies/mL.

水產養殖區按照面源排放考慮，參考《第一次全國污染源普查 水產養殖業污染源產排污系數手冊》，并結合東洞庭湖周邊水產養殖業污染物排放情況來確定水產養殖業ARGs產排污系數，然后計算其入湖通量，即入湖通量=污染物排放量=排污系數×養殖增產量.

1.6 數據分析

利用Excel 2010軟件進行數據的輸入和處理；利用Canoco 5 軟件進行ARGs豐度與環境變量的冗余分析；使用Origin 9.0軟件繪制圖表；使用ArcGIS 10.0軟件繪制采樣點位圖.

2 結果與討論

2.1 東洞庭湖表層水體中抗生素的賦存水平

抗生素的濃度水平如表2所示. 由表2可見，除紅霉素外其余11種抗生素均有不同程度的檢出，羅紅霉素、磺胺嘧啶和氧氟沙星的檢出率均為100%，諾氟沙星和環丙沙星的檢出率最低，均為7%. 東洞庭湖表層水體中抗生素濃度范圍為ND(未檢出)～486.59 ng/L，氧氟沙星濃度最高，其次為土霉素、磺胺甲惡唑、金霉素、羅紅霉素、恩諾沙星、四環素，其他抗生素濃度處于較低水平. 結合檢出率與檢出濃度來看，氧氟沙星和羅紅霉素是東洞庭湖表層水體中的主要抗生素類型.

表2 東洞庭湖表層水體中不同種類抗生素的濃度

喹諾酮類抗生素濃度范圍為ND～486.59 ng/L，平均值為18.58 ng/L. 氧氟沙星濃度最高達486.59 ng/L，平均值為63.41 ng/L，檢出率為100%，居所有抗生素之首. 氧氟沙星主要用于人類疾病治療，醫療用量較大[30]，因此水體中氧氟沙星的來源可能為周圍醫療廢水直排. 恩諾沙星的濃度水平位居第二，平均值為8.09 ng/L，檢出率為50%，歸因于恩諾沙星在水產養殖和畜牧業中的高使用量[31]. 諾氟沙星和環丙沙星的檢出率和濃度均處于較低水平，這是由于諾氟沙星已被禁止在未成年人中使用，限制了其用量[32]. 東洞庭湖中喹諾酮類抗生素的平均濃度高于巢湖(15.39 ng/L)[33]和大通湖(8.55 ng/L)[34]，略低于艾比湖(19.54 ng/L)[35]. 氧氟沙星的濃度遠高于艾比湖(22.67 ng/L)[35]，與太湖貢湖灣(14～474 ng/L)[36]相當；諾氟沙星的濃度比太湖貢湖灣(14～474 ng/L)[36]低很多；恩諾沙星的濃度與大通湖(8.04 ng/L)[34]基本持平. 喹諾酮類藥物主要應用于規模化養殖及人類疾病控制，這些顯著的差異可能與研究區域內喹諾酮類抗生素使用量不均有關.

磺胺類抗生素濃度范圍為ND～220.95 ng/L，平均值為7.44 ng/L，低于珠江三角洲(<776 ng/L)[37]和大通湖(37.41 ng/L)[34]. 磺胺甲惡唑的平均濃度最高(20.73 ng/L)，歸因于其在水環境中的降解受光照及好氧等條件影響小，能在水體中長期存在[38]. 磺胺類抗生素由于具有廣譜性、療效強和價格低廉等特點被廣泛應用于水產養殖業中，以提高養殖魚類的健康和產量[39]. 因此，磺胺甲惡唑的高檢出濃度可能與研究區域內磺胺甲惡唑在水產養殖業的廣泛使用有關.

大環內酯類抗生素濃度范圍為ND～110.66 ng/L，羅紅霉素檢出率為100%，紅霉素均未檢出. 羅紅霉素最高濃度達110.66 ng/L，低于太湖(218.3 ng/L)[40]和白洋淀(155 ng/L)[41]，但高于南昌市城市湖泊(20.8 ng/L)[31]4倍以上. 羅紅霉素主要用于農業養殖及醫療，其在水體中的檢出率及檢出濃度相對較高，說明此類抗生素在東洞庭湖周圍居民中的使用量大，使用頻率高.

四環素類抗生素濃度范圍為ND～50.32 ng/L，平均值為14.08 ng/L. 東洞庭湖土霉素、四環素和金霉素的平均濃度均高于艾比湖(平均值分別為10.12 ng/L、2.49 ng/L、ND)[35]和大通湖(平均值分別為0.68、1.65、3.92 ng/L)[34]，呈現出較高水平，應引起足夠注意. 土霉素的平均濃度最高(22.12 ng/L)，與王倩倩等[35]的研究結果一致. 四環素類抗生素主要用于動物疾病的治療與預防，其在水環境的穩定性與光照、微生物和沉積物的吸附作用等多種因素有關，進而檢出不同的濃度水平[42-43].

2.2 東洞庭湖表層水體中抗生素的空間分布特征

抗生素的濃度水平及空間分布受消耗量、使用頻率和環境因子等多種因素的影響. 由圖2可見，抗生素的累積濃度為23.02～754.13 ng/L，具有一定的空間差異. X3采樣點抗生素的累積濃度最高，氧氟沙星和磺胺甲惡唑是主要貢獻因子，貢獻率在93%以上，其次為X7采樣點，其主要原因是：①X3采樣點水產養殖業發達，且靠近生態漁村，飼料中抗生素的添加導致這片區域抗生素濃度相對較高；②X7采樣點靠近岳陽市岳陽樓區，人類活動頻繁，在醫療中對抗生素的大量使用導致這片區域抗生素濃度較高. X13采樣點抗生素的累積濃度最低，可能與該采樣點遠離人口密集區和水產養殖區有關.

圖2 東洞庭湖各采樣點抗生素的累積濃度Fig.2 Accumulative concentration of antibiotics at each sampling site in the East Dongting Lake

2.3 東洞庭湖表層水體中抗生素抗性基因的賦存水平

所有抗性基因的檢出率均為100%，說明東洞庭湖水體受到磺胺類、四環素類、大環內酯類和喹諾酮類抗性基因的共同污染. ARGs的濃度情況如圖3所示. 由圖3可見，8種抗性基因的最高濃度均大于2.9×101copies/mL. 基因sul2、tetW、ermA的平均濃度最高，分別為1.3×103、5.4×102和2.0×102copies/mL，磺胺類和四環素類抗性基因的高濃度水平與房平等[44]的研究結果一致.

圖3 抗性基因絕對濃度(c)的箱式分布圖Fig.3 Box-plot of absolute concentration of ARGs

磺胺類抗性基因濃度范圍為3.7～3.16×103copies/mL，平均值為7.07×102copies/mL，高于其他三類ARGs. 基因sul2的平均濃度最高，為1.3×103copies/mL，是東洞庭湖流域表層水體中的優勢ARGs，這說明該區域磺胺類抗生素使用廣泛，存在潛在的環境風險. 截至目前，共發現4種磺胺類基因(sul1、sul2、sul3、sulA)，且基因sul1和sul2最常在水環境中檢出，這與該研究的結果一致. 與鄱陽湖流域ARGs濃度(基因sul2的平均濃度為1.9×101copies/mL)[45]相比，東洞庭湖表層水體中基因sul2的平均濃度(1.3×103copies/mL)相對較大，說明東洞庭湖流域磺胺類抗性基因污染情況嚴重，湖泊水環境已經成為ARGs的一個重要儲庫.

四環素類抗性基因濃度范圍為2.69～2.43×103copies/mL，平均值為2.27×102copies/mL，僅次于磺胺類抗性基因，這表明東洞庭湖表層水受磺胺類和四環素類抗性基因污染嚴重. 一方面是由于ARGs的自我擴增和在環境中的穩定性造成的，ARGs可通過與轉座子、質粒等可移動元件結合，在不同細菌間轉移和傳播，而攜帶ARGs的菌株死亡后，其攜帶的ARGs可以在脫氧核糖核酸酶的保護下釋放到環境中并持久存在，并通過結合、轉導等方式進入到其他菌株內[20,46]；另一方面是由于磺胺類和四環素類抗生素在動物養殖業中的廣泛使用和濫用所產生的選擇性壓力造成的. 基因tetA、tetM、tetW的絕對濃度范圍分別為2.7～2.9×101、8.5×101～2.1×102、2.0×102～2.4×103copies/mL，平均值從大到小表現為基因tetW>基因tetM>基因tetA，這種濃度水平的差異可能與區域內四環素類抗生素的使用方式、相應抗性機制及不同種類的宿主細菌有關. 四環素類抗性基因在表層水體中廣泛存在，四環素類抗生素在表層水體中的檢出率和檢出濃度較低，這可能與ARGs的“持久性”或“可復制性”有關[47].

大環內酯類抗性基因ermB和喹諾酮類抗性基因qnrS的濃度范圍分別為1.1×101～1.2×102、2.2×101～1.1×102copies/mL，含量低于其他兩類ARGs，且遠低于長江下游湖泊中基因ermB和qnrS的濃度(分別為4.25×104～1.65×105、9.31×102～3.92×106copies/mL)[5]，表明這兩類抗性基因雖然普遍存在(檢出率均為100%)，但污染情況并不嚴重. 喹諾酮類抗生素的檢出率和檢出濃度都處于較高水平，而喹諾酮類抗性基因qnrS處于較低水平，說明ARGs的存在不完全取決于抗生素的污染程度，可能與該基因不如其他基因穩定有關[48].

2.4 東洞庭湖表層水體中抗生素抗性基因的空間分布特征

湖泊中ARGs污染水平主要受沿湖污染源輸入的影響，東洞庭湖ARGs的濃度水平如圖4所示. 由圖4可見，基因sul2在X5、X14和X12采樣點均呈現較高濃度水平，由于周邊水產養殖業相對發達，抗生素的使用量及使用頻率較高，通過雨水徑流或直接施用等途徑進入湖中，導致湖內區域磺胺類抗性基因濃度升高. 另外，X14采樣點靠近入江口，高濃度的ARGs會隨著湖水流至長江，對長江的水質造成影響. X11采樣點各抗性基因的檢出濃度基本都低于其他采樣點，可能是因為該采樣點遠離岸邊，距離外界輸入型污染源較遠，由于污染物的削減作用導致檢出濃度低[22].

圖4 東洞庭湖各采樣點抗性基因(ARGs)的濃度Fig.4 Concentration of ARGs at each sampling site in the East Dongting Lake

2.5 東洞庭湖流域抗生素抗性基因的污染源分析

人類活動是影響ARGs分布的重要因素，包括畜禽養殖、水產養殖和污水處理廠等[49]. 陸地污染源ARGs的測定結果如圖5所示. 其中W1、W6和W7采樣點分別為錢糧湖鎮污水處理廠、岳陽市君山區第二污水廠和君山區城區污水凈化中心進水，W1-1、W6-1和W7-1采樣點分別為錢糧湖鎮污水處理廠、岳陽市君山區第二污水廠和君山區城區污水凈化中心出水. 由圖5可見，錢糧湖鎮污水處理廠和君山區城區污水凈化中心出水中每種抗性基因的濃度都低于進水，說明污水處理廠對ARGs具有一定的去除效果. 出水中仍含有一定濃度的ARGs，說明污水處理廠中的處理設施不能完全去除ARGs，處理后廢水的排放會增加其受納水體(河流和湖泊)中ARGs的濃度[50-51]. 岳陽市君山區第二污水廠中的基因qnrS經過污水廠處理后濃度甚至增加，污水廠中的生物處理單元常常有大量微生物參與，這增加了ARGs傳播的可能性. 以上結果說明污水處理廠在改善環境的同時，有可能會帶來二次污染，傳統的污水處理方法不能完全去除ARGs，甚至可能增加其豐度，污水處理廠已經成為ARGs向水環境中傳播的主要途徑[52]. 在水產養殖區廢水中，4類ARGs均有不同程度的檢出，這與其對應的抗生素在水產養殖業中廣泛使用有關. 基因sul2在4個水產養殖廢水中的濃度都居于首位，是主要污染物. 與表層水體中ARGs的檢測結果結合分析，錢糧湖鎮污水處理廠出水中基因qnrS絕對濃度最高(9.81×102copies/mL)，在距離該污水處理廠最近的湖內X2采樣點也檢測到了基因qnrS的最高濃度(1.12×102copies/mL). W5采樣點四環素類抗性基因的累積濃度最高(6.16×102copies/mL)，在距離該采樣點最近的湖內X11和X12采樣點，四環素類抗性基因累積濃度也處于較高水平，分別為2.53×103和9.65×102copies/mL. 該研究結果表明，陸地污染源中ARGs的濃度可能會影響湖內表層水體中ARGs的賦存.

圖5 陸地污染源中ARGs的濃度(c′)Fig.5 Concentration of ARGs of land pollution sources

選取的4個水產養殖區，養殖模式均為池塘養殖，主要養殖魚和蝦，通過查找《第一次全國污染源普查 水產養殖業污染源產排污系數手冊》，確定養殖魚和蝦的排污系數分別為 0.003 1 和 0.009 0. 錢糧湖鎮污水處理廠、岳陽市君山區第二污水廠、君山區城區污水凈化中心的排放流量分別為 5 000、50 000、25 000 m3/d，其入湖通量計算結果如圖6所示. 由圖6可見，污水處理廠出水的ARGs對湖內ARGs的貢獻遠高于水產養殖區，且所檢測的8種抗性基因都有不同程度的貢獻. 基因sul2在錢糧湖鎮污水處理廠、岳陽市君山區第二污水廠、君山區城區污水凈化中心的入湖通量都呈現最高水平(分別為4.46×1016、2.56×1017、3.33×1017copies/a)，其次是基因sul1(分別為2.38×1016、5.14×1016、1.90×1017copies/a)，成為污水處理廠向湖內輸入的主要ARGs. 但是水產養殖區ARGs的污染也不能忽視，對于東洞庭湖來說，湖區水產品占湖南省的1/2，具有水產養殖面積廣闊、養殖總量大等特征[53]. 后續研究應該對東洞庭湖所有水產養殖的企業及個體進行普遍調查，從而明確其對湖內污染物的總體貢獻，以期為東洞庭湖流域ARGs的污染防治提供決策支持.

圖6 陸地污染源中ARGs的入湖通量(W)Fig.6 ARGs fluxes flowing into lake of land pollution sources

2.6 東洞庭湖表層水體中ARGs、抗生素和環境參數之間的相互關系

已有研究[22]發現，ARGs的濃度水平不僅與環境中抗生素的暴露水平相關，還與有機質含量等環境因素相關. 環境中的外源抗生素及其代謝物可能通過基因突變或選擇壓力在低濃度下加速ARGs的進化，因此ARGs豐度通常與環境中抗生素的濃度呈正相關[54]. 選擇水質參數環境變量(如pH、ORP、EC、T以及TN、TP、NH3-N、NO3--N、M3PO4、DO濃度)和檢出的主要抗生素，與ARGs含量進行相關性分析，以探究東洞庭湖流域表層水體中環境變量與ARGs豐度之間的潛在關系.

ARGs豐度與抗生素的冗余分析如圖7所示. 圖7中，藍色箭頭代表ARGs，紅色箭頭代表抗生素等環境變量，紅色箭頭與藍色箭頭之間的夾角余弦值代表該環境變量與ARGs豐度的相關性大小[55]. 軸1和軸2的特征值分別為 0.597 3 和 0.168 4，ARGs豐度與抗生素濃度的關系在軸1和軸2的累計解釋量為76.56%. 四環素類抗性基因tetA、tetM豐度與四環素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)濃度均呈正相關，磺胺類抗性基因sul1、sul2豐度與磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺甲惡唑(SMX)濃度均呈正相關，大環內酯類抗性基因ermA豐度與羅紅霉素(RXM)濃度呈正相關，喹諾酮類抗性基因qnrS豐度與環丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)濃度均呈正相關，均符合ARGs在其對應抗生素選擇性壓力下的特征.

圖7 ARGs豐度與抗生素濃度的冗余分析Fig.7 Redundancy analysis between abundance of ARGs and concentration of antibiotics

ARGs豐度與水質參數的冗余分析如圖8所示. 由圖8 可見，軸1特征值為 0.714 8，軸2特征值為 0.166 2，ARGs與水質參數的關系在軸1和軸2的累計解釋量為88.10%. 該研究結果表明，對ARGs豐度影響最重要的4個水質參數分別為TP濃度(貢獻率為28.9%)、EC(貢獻率為15.4%)、NO3--N濃度(貢獻率為13.3%)和T(貢獻率為12.7%). 基因tetA、tetW與DO濃度、ORP、T、pH之間的夾角均為銳角，說明這4種水質參數與基因tetA、tetW均呈正相關. pH、T以及TN、NO3--N、M3PO4濃度與基因tetM和qnrS豐度均呈正相關，與基因sul1和sul2豐度均呈負相關. 基因ermA、ermB豐度與EC以及TN、NO3--N、M3PO4、NH3-N濃度均呈正相關. 這表明ARGs的豐度不僅與其對應抗生素的選擇性壓力有關，還與一些環境因素的壓力有關.

注： TN、NO3--N、M3PO4、NH3-N均表示其濃度. 圖8 ARGs豐度與水質參數濃度的冗余分析Fig.8 Redundancy analysis between abundance of ARGs and water quality parameters

3 結論

a) 東洞庭湖表層水體中抗生素濃度處于ND～486.59 ng/L水平，氧氟沙星濃度最高，其次依次為土霉素、磺胺甲惡唑、金霉素、羅紅霉素、恩諾沙星、四環素，其他抗生素濃度處于較低水平. 抗生素的累積濃度為23.02～754.13 ng/L，且具有一定的空間差異性，這與水產養殖業和人口密集程度相關.

b) ARGs在東洞庭湖表層水體中均被檢出，檢出率均為100%. 基因sul2、tetW、ermA的平均濃度最高，分別為1.3×103、5.4×102和2.0×102copies/mL. ARGs的濃度水平具有一定的空間差異性，與該地區水產養殖業中的用藥和外界輸入型污染源距離有關.

c) 污水處理廠對ARGs具有一定的去除效果，但不能完全去除ARGs，甚至會增加ARGs傳播的可能性. 磺胺類抗性基因sul2是水產養殖廢水中的主要污染物. 入湖通量計算結果顯示，污水處理廠出水ARGs對湖內ARGs的貢獻遠高于水產養殖區，磺胺類抗性基因sul11和sul2是污水廠向湖內輸入的主要ARGs.

d) 冗余分析表明，基因tetA、tetM豐度與四環素、土霉素、金霉素濃度均呈正相關，基因sul1、sul2豐度與磺胺二甲嘧啶、磺胺甲惡唑濃度均呈正相關，基因qnrS豐度與環丙沙星、恩諾沙星濃度均呈正相關，符合ARGs在其對應抗生素的選擇性壓力下的特征；TP濃度(貢獻率為28.9%)、EC(貢獻率為15.4%)、NO3--N濃度(貢獻率為13.3%)和T(貢獻率為12.7%)是影響ARGs豐度最重要的環境因子. 這表明ARGs的豐度不僅與其對應抗生素的選擇性壓力有關，還與一些環境因素的壓力有關.