貴州某廢棄煤礦酸性廢水處理系統中細菌群落結構及功能分析

王 能， 張瑞雪,2*， 吳 攀,2， 張世鴻， 張亞輝

1.貴州大學資源與環境工程學院， 貴州 貴陽 550025 2.喀斯特地質資源與環境教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550025

煤炭資源開采產生的大量煤矸石和圍巖等暴露在空氣和水中，經過復雜的化學與生物氧化過程，極易形成低pH、高硫酸鹽以及Fe、Mn等重金屬的酸性礦山廢水[1]. 酸性礦山廢水任意排放會對周圍環境和生態系統造成長期損害，其含有的有害金屬離子可在動植物體內富集，進而通過食物鏈威脅人體健康[2-3].

酸性礦山廢水是一個全球性環境污染問題[4]. 貴州煤炭資源豐富，且煤中含硫較高，酸性煤礦排水對區域水環境的污染問題日益突出[5-6]. 筆者所在課題組根據貴州廢棄煤礦分布特征和廢水排放特點，因地制宜地開發了系列以碳酸鹽巖為主要反應介質被動處理煤礦酸性廢水的技術方法，并在多地開展工程示范及應用，且處理效果顯著[7-8]. 碳酸鹽巖作為煤礦酸性廢水治理的反應介質，不僅對廢水中pH提升及Fe去除有很好效果[9]，同時反應體系中形成的鐵氧化物沉積物對廢水中其他金屬離子有很好的吸附共沉淀作用[10]. 當前對碳酸鹽巖作為反應介質處理酸性煤礦廢水主要關注于反應過程中的物理化學作用[8-12]，而在酸性礦山廢水環境(水、沉積物和生物膜等[13])中還存在豐富的嗜酸性鐵、硫氧化以及異養的細菌和古菌[14]，此類微生物存在會對沉積物-水界面的各種污染物去除和遷移轉化等發揮重要作用[15]. 如在酸性礦山廢水環境中生存的嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(A.ferrooxidans)能有效促進酸性硫酸鹽體系中Fe2+向Fe3+轉化，同時Fe3+水解生成施氏礦物、黃鐵礬等次生礦物，而此類礦物的生物相容性好，且能與金屬元素發生吸附或者共沉淀作用[16-17].

近年來，利用16S rRNA高通量測序和基因組學方法對酸性礦山廢水環境中微生物群落的不斷研究促進了人們對酸性環境中微生物多樣性、群落功能和進化的深入了解[18]. 該研究以貴州某廢棄煤礦酸性廢水處理系統(碳酸鹽巖為主要反應介質)為例，采用高通量測序MiSeq技術，分析反應系統中細菌群落結構的沿程變化特征，并根據細菌群落組成分析其主要功能作用，以期為酸性礦山廢水的生物強化處理技術與理念方法提供基礎理論支撐.

1 材料與方法

1.1 處理系統概況及樣品采集

貴州某廢棄煤礦酸性廢水處理系統于2017年8月建成運行，反應系統中填充的碳酸鹽巖為較純的方解石. 處理系統共設有6組平行，每組由多級復氧反應池和垂直流人工濕地構成，其中多級復氧反應池分5級，第1級為可滲透反應墻，其余4級分別由反應池和沉淀池組成；沉淀池中添加立體彈性填料，人工濕地中種植梭魚草、黃菖蒲和金絲草等植物，工藝流程見圖1. 該處理系統總占地面積 2 160 m2，設計處理能力500 m3/d(枯水期約300 m3/d，豐水期約500 m3/d)，進水水力負荷0.32～0.52 m3/(m2·d). 由于該處理系統進水自廢棄煤礦硐口地下涌水，其特征污染指標主要為pH以及Fe、Mn和其他重金屬，且運行前期對系統監測結果表明，進水COD (10 mg/L)、TN (0.2 mg/L)和TP (0.1 mg/L)等污染物濃度較低，故該研究并未對其去除效果及機理進行探討. 系統處理后出水中Fe、Mn濃度可達《生活飲用水水源水質標準》(CJ 3020—1993)的一級標準[8].

圖1 貴州某廢棄煤礦酸性廢水處理系統工藝流程Fig.1 Process flow of acid wastewater treatment system of an abandoned coal mine in Guizhou Province

樣品采集于2019年10月，共采集8個樣品測定細菌群落結構，即進水沉積物(JSc)、進水水(JSs)、反應池沉積物(Fc)、反應池懸浮物(Fx)、沉淀池1沉積物(C1c)和沉淀池4沉積物(C4c)、濕地沉積物(Sc)和濕地植物根際土壤(St). 反應池與沉淀池的沉積物采自彈性填料，濕地系統主要以碳酸鹽巖為反應介質，在碳酸鹽巖層上添加土壤種植植物，植物根際土壤中混有大量鐵絮體沉積物，采樣點布設見圖1.

1.2 樣品分析

利用便攜式水質參數儀現場測定溫度(T)、pH、DO濃度和ORP等，用于測定Fe2+的樣品現場用0.45 μm濾膜過濾，添加緩沖溶液和鄰菲啰啉顯色劑現場顯色. 用于其他理化指標測定的樣品均過濾到聚乙烯瓶中，測定金屬的樣品加適量硝酸酸化(pH<2). 用0.22 μm (Millipore, 美國)無菌微孔濾膜過濾進水水樣，用以收集水樣微生物，將濾膜置于無菌離心管于干冰盒中低溫(約-20 ℃)保存. 沉積物放入滅菌的自封袋中均勻混合后過濾掉水，取一定量的沉積物置于無菌離心管中置于冰盒中. 將樣品帶回實驗室儲存于-80 ℃冰箱，用于16S rRNA擴增測序分析. 取部分沉積物樣品帶回實驗室冷凍干燥后消解測定金屬含量. Fe和Mn含量用原子吸收測定(TAS-990, 北京普析通用儀器有限責任公司)，SO42-含量用離子色譜儀(ICS-1100, 美國Dionex公司)測定，Fe2+含量用鄰菲啰啉分光光度法測定，Cu、Pb、Zn、As和Cr含量用電感耦合等離子質譜儀測定(ICP-MS, 美國賽默飛公司).

1.3 DNA提取、PCR擴增及高通量測序

根據FastDNA? Spin Kit for Soil(MP Biomedicals, 美國)說明書進行總DNA抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，使用NanoDrop2000(Thermo Fisher,美國)測定DNA濃度和純度.

使用338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對16r RNA基因V3～V4可變區進行PCR擴增，擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，27個循環；然后72 ℃穩定延伸10 min；最后4 ℃ 進行保存. PCR(ABI GeneAmp? 9700型PCR儀，美國)反應體系：5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL；2.5 mmol/L dNTPs 2 μL；上游引物(5 μmol/L)0.8 μL；下游引物(5 μmol/L)0.8 μL；TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL；模板DNA 10 ng；補足至20 μL. 每個樣本3個重復. 將同一樣本的PCR產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, 美國)進行回收產物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTMFluorometer(Promega, 美國)對回收產物進行檢測定量. 使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司).

1.4 數據處理與分析

使用Trimmomatic軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH軟件進行拼接，過濾reads尾部質量值20以下的堿基. 設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的reads，去除含N堿基的reads. 使用UPARSE軟件(version 7.1)，根據97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體，利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋，比對SiIva132/sbacteria數據庫，設置比對閾值為70%. 所有的統計分析都使用R包進行統計分析及數據可視化，基于樣品最小序列數抽平后計算α-多樣性指數和距離矩陣. 用Canoco 5.0軟件對細菌群落物種信息進行冗余分析(RDA)，并結合Pearson相關系數評價細菌群落與環境因子之間的關系.

2 結果與分析

2.1 反應系統水質特征

反應系統中各樣品理化參數結果見表1，系統進水為弱酸性煤礦廢水(pH為5.85)，廢水中典型污染物Fe(51.36 mg/L)經系統處理后去除率接近100%，同時對低濃度Mn、As、Pb、Cu和Cr等金屬也有明顯的去除效果. 經多級復氧反應池和人工濕地系統處理后廢水的pH、DO濃度和Eh沿程升高，EC沿程降低. 系統中生成的大量鐵絮體沉積物能富集多種金屬元素，如Fe、Mn、As、Cd和Pb等，其中Fe含量最高，在反應池沉積物(Fc)中最高可達26.74%.

表1 反應系統中樣品理化參數

2.2 反應系統中細菌群落Alpha多樣性分析

通過Miseq PE300高通量測序平臺對8個樣品測序，優化序列信息后獲得有效序列數 472 422 條，有效堿基數目 195 031 650 bp，序列平均長度412.84 bp，共獲得 8 917 個OTUs. 對原始數據質控優化后，樣品平均序列數、OTU數、覆蓋度(Coverage)、細菌群落豐富度指數(Chao指數和ACE指數)和多樣性指數(Shannon-Wiener指數和Simpson指數)見表2. 樣品間OTU數存在差異，JSs樣品中OTU數最高(1 561 個)，Fx樣品中OTU數最低(384個). 8個樣品Coverage均在98%以上，表明該研究的測試深度足夠. 樣品間豐富度指數(Chao指數和ACE指數)和多樣性指數(Shannon-Wiener指數和Simpson指數)存在差異，JSs樣品中細菌群落豐富度指數和多樣性指數高于JSc樣品，Fc樣品中細菌群落豐富度指數和多樣性指數高于Fx樣品，沉積物樣品JSc、Fc多樣性指數低于C1c、C4c、Sc樣品，由此可見反應系統沉積物樣品中細菌群落多樣性隨系統處理進程增加.

表2 細菌群落Alpha多樣性分析結果

2.3 反應系統中細菌群落結構特征

8個樣品共注釋了24個門、234個屬，將門水平豐度小于0.01%的細菌群落合并為其他(others)(見圖2). 由圖2可見，反應系統中變形菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)為主要優勢菌門. 變形菌門在JSs、C1c、C4c、Sc和St樣品中的豐度最高，為37.64%～69.18%；在JSc、Fc和Fx樣品中的豐度次之，為6%～32.84%. 綠彎菌門在Fc樣品中的豐度最高，為47.07%；在C1c、C4c、Sc和St樣品中的豐度次之，為22.37%～33.87%；在JSc、JSs、Fx樣品中的豐度較低，分別為11.62%、2.12%、1.91%. 藍細菌門(Cyanobacteria)在Fx樣品中的豐度最高，為90.95%；在JSc和Fc樣品中的豐度次之，分別為53.00%和17.29%；在沉淀池和濕地樣品中的豐度較小，為0.27%～9.87%. 硝化螺旋菌門(Nitrospirae)在Sc和St樣品中的豐度較高，分別為12.98%和12.06%；在進水沉積物、反應池和沉淀池樣品中的豐度很低，小于0.41%. 在反應池、沉淀池和濕地樣品中還有豐度較低(<10%)的擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)等.

圖2 反應系統中細菌群落在門水平上的豐度Fig.2 The abundance of bacterial communities in the reaction system at the phylum level

屬水平上細菌群落的組成如圖3所示. 由圖3可見，屬水平上反應系統中細菌群落組成在系統前端(反應池和進水溝渠)與后端(沉淀池和濕地)有顯著差異，高豐度細菌類群主要歸于變形菌門. 披毛菌屬(Gallionella)、Sideroxydans和地桿菌屬(Geobacter)在Fx樣品中的豐度(0.20%～0.88%)較低，處理系統前端樣品(JSs、JSc、Fc)的豐度明顯高于后端樣品(C1c、C4c、Sc、St)，且在沉積物樣品(JSc、Fc、C1c、C4c、Sc)中豐度隨流程不斷降低. 其中披毛菌屬、Sideroxydans和地桿菌屬在反應系統前端分別為3.78%～46.24%、4.51%～13.14%和6%～9.81%，后端分別為0～0.53%、0～0.94%和0.23%～3.01%. 紅育菌屬(Rhodoferax)在多級復氧反應池樣品中的豐度(1.73%～24.91%)高于濕地系統(0～0.32%). 土微菌屬(Pedomicrobium)在沉淀池和濕地系統樣品中的豐度(2.23%～9.89%)明顯高于進水和反應池樣品(豐度接近0)，硝化螺旋菌屬(Nitrospira)在濕地系統樣品中的豐度(14.29%～15.20%)較高，在進水和多級復氧反應池樣品中的豐度(<0.5%)較低.

圖3 屬水平上反應系統中細菌群落相對豐度熱圖Fig.3 Heat map of the relative abundance of bacterial communities in the reaction system at the genus level

2.4 反應系統中細菌群落結構差異及其與金屬元素之間的關系

Beta多樣性分析主要通過計算各樣品中的OUT豐度信息，評估各樣品間細菌群落結構的差異. 基于Abund-Jaccard相似和Bray-Curtis相異距離矩陣的主成分分析(PcoA)結果表明，不考慮細菌群落組成豐度時〔見圖4(a)〕，樣本群落結構間存在差異；當考慮群落組成豐度時〔見圖4(b)〕，沉淀池和濕地的細菌群落結構差異明顯減小，說明沉淀池和濕地中的細菌群落結構差異受豐度的影響.

圖4 基于Abund-Jaccard相似和Bray-Curtis相異距離矩陣的主成分分析Fig.4 Principal component analysis based on Abund-Jaccard similarity and Bray-Curtis dissimilarity distance matrix

注：Proteobc表示Proteobacteria (變形菌門)；Actinobc表示Actinobacteria(放線菌門)；Acidobac表示Acidobacteria(酸桿菌門)；Bacteroi表示Bacteroidetes(擬桿菌門)；Cyanobac表示Cyanobacteria(藍細菌門)；Chorofl表示Chlorofexi(綠彎菌門)；Nitrospr表示Nitrospirae(硝化螺旋菌門)；Fe表示Fe含量；Cr表示Cr含量；Cu表示Cu含量；As表示As含量；Pb表示Pb含量；Ni表示Ni含量. 圖5 門水平細菌群落與金屬元素含量的RDA分析Fig.5 RDA analysis of bacterial communities and metal elements at phylum level

利用Canoco 5.0 軟件對門水平上反應系統中細菌群落豐度與金屬元素進行冗余分析(RDA)，結果如圖5所示. 箭頭長度表示理化參數對細菌群落結構影響強度，箭頭越長說明相關性越大，箭頭連線之間為銳角表示呈正相關，為鈍角表示呈負相關. 反應系統中細菌群落結構受金屬元素Fe、Ni、As和Pb的影響較大，變形菌門、綠彎菌門、放線菌門和酸桿菌門等與Fe和Ni含量均呈正相關，與As和Pb含量均呈負相關，其中與Fe含量呈顯著正相關(P<0.05)，與Pb含量呈顯著負相關(P<0.05)；藍細菌門與Fe和Ni含量均呈負相關，與As和Pb含量均呈正相關，其中與Fe含量呈顯著負相關(P<0.05)，與Pb含量呈顯著正相關(P<0.01)(見表3).

表3 細菌群落與金屬元素間Pearson相關系數

3 討論

3.1 煤礦廢水處理系統中細菌群落組成分析

處理系統對酸性煤礦廢水具有很好的處理效果，碳酸鹽巖能有效提高酸性煤礦廢水pH，而pH升高有利于Fe3+水解沉淀. 通過多級復氧使DO濃度從進水時的1.7 mg/L升至出水時的7.1 mg/L，DO濃度升高有利于Fe2+的氧化，因此該反應系統對Fe2+及TFe(總鐵)均有很好的去除效果. 反應系統中添加立體彈性填料能有效地將鐵絮體沉積物附著在其表面[8]. 隨著系統中酸性廢水pH和DO濃度的升高，以及金屬離子被去除、EC降低和Eh升高，沉積物(JSc、Fc、C1c、C4c、Sc)樣品中細菌α-多樣性指數增加，如Shannon-Wiener指數從2.82增至5.31. 因此，酸性煤礦廢水中細菌豐度和多樣性受pH、DO濃度和金屬元素含量等影響[3,19].

反應系統中變形菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、放線菌門、硝化螺旋菌門和藍細菌門等為優勢菌門，其中變形菌門和綠彎菌門為主要優勢菌門. 這些細菌群落在礦山水環境中多有報道[20-21]，其中變形菌門在酸性礦山廢水中為豐富物種[21-22]，且表現出很強的適應性，同時也是鐵硫循環細菌的主要細菌群落[23-24]. 綠彎菌門在沉積物和濕地土壤中的豐度較高，但在進水水樣和反應池懸浮物中的豐度較低，其在沉積物中很常見，參與沉積物碳循環[25]. 擬桿菌門、酸桿菌門、放線菌門和硝化螺旋菌門在處理系統后端的豐度高于前端，其中擬桿菌門在酸性礦山排水中不常見，在環境酸度低的情況下偶有報道[14]；酸桿菌門是一類化能異養嗜酸菌，在酸性生態系統中可降解植物殘體多聚物、參與鐵循環[20,26]. 藍細菌門在立體彈性填料和懸浮物樣品中為優勢菌門，其中在反應池懸浮物樣品中占90.95%. 藍細菌對金屬離子具有一定耐性，大多數藍細菌可以通過產生細胞外物質(如多糖)來吸附金屬離子[3]，同時藍細菌光合作用產生的氧氣可以增強酸性廢水環境中的氧化反應.

酸性礦山廢水環境中金屬離子對細菌群落結構有顯著影響，當金屬離子濃度超出細菌耐性值時，會導致細菌群落結構組成發生嚴重變化[20,22,27]，如在低濃度As脅迫下會刺激對As敏感的微生物生長繁殖，但高濃度As會對微生物有明顯的抑制作用，從而導致某些微生物死亡和多樣性降低[28]. 在該反應系統鐵絮體沉積物樣品(JSc、Fc、Fx、C1c、C4c、Sc)中門水平上細菌群落豐度主要受金屬元素Fe、As、Ni和Pb含量的影響較大.

3.2 煤礦廢水處理系統中細菌群落功能分析

由于該處理系統的進水呈弱酸性，Fe2+濃度相對較低(42.85 mg/L)，不適宜典型嗜酸性鐵氧細菌(Acidithiobacillus)生存[25]，但是在系統中發現了適宜于低酸度環境的鐵氧化細菌披毛菌屬[29]和Sideroxydans[25]等，兩種細菌的豐度在處理系統前端和后端存在顯著差異，且隨著處理進程在沉積物中逐漸降低. 披毛菌屬[24,30]和Sideroxydans在微氧條件下具備氧化Fe2+的能力，其中Sideroxydans可以在DO摩爾濃度小于50 μmol/L情況下，將Fe2+有效氧化成Fe3+[31]. 由于在多級復氧反應池中87.7%的Fe2+被氧化，導致進入濕地系統中Fe2+濃度極低，因此在濕地系統中低濃度Fe不足以維持化能自養細菌的大量生長.

地桿菌屬和紅育菌屬主要存在于多級復氧反應池樣品中，而濕地樣品中的豐度較低(<0.47%). 地桿菌屬[32]和紅育菌屬[22]在酸性礦山廢水環境中能將Fe3+還原成Fe2+，其中地桿菌屬在Fe3+豐富且可供細菌利用時成為Fe3+還原的主力軍[33]，在酸性礦山環境中低濃度DO和高濃度Fe3+有利于鐵還原細菌對Fe3+的還原[34-35]. 隨著反應系統DO濃度不斷提升，且進入濕地系統中Fe濃度較低，故鐵還原細菌在濕地中不宜生存，但在反應系統中存在較低豐度(<1%)的鐵氧化細菌Rhodobacter、Sediminibacterium與鐵還原細菌Anaeromyxobacter、Desulfuromonas等[24]. 其中Desulfuromonas是典型的SRB(sulfate-reducing bacteria)菌，不僅可以還原硫酸鹽，還可以利用Fe3+和Mn4+作為電子受體，使其還原為Fe2+和Mn2+[36].

煤礦廢水經多級復氧反應池處理后進入垂直流人工濕地，人工濕地中植物可通過吸收和吸附等作用去除廢水中的金屬離子，如菖蒲對廢水中Mn具有很好的生物富集能力[37]. 濕地沉積物和植物根際土壤中Mn的含量(2.9%±0.16%)明顯高于多級復氧反應池沉積物樣品中Mn的含量(0.08%～0.83%)，說明在濕地系統中更有利于錳氧化物生成. 濕地系統沉積物和植物根際土壤中鐵和錳氧化物累積微生物土微菌屬和硝化螺旋菌屬，其豐度明顯高于多級復氧反應池樣品. 土微菌屬可黏附在濕地系統中植物或者池壁等的表面，形成生物膜吸附鐵錳氧化物[38]. 硝化螺旋菌屬在濕地系統中不僅具有硝化功能，同時還能產生硫化物醌還原酶，將硫化物氧化為單質硫[39]. 此外，從圖3中還可看出，反應系統中有很多未歸類和未培養的細菌群落豐度在沉淀池和濕地中高于進水和反應池，這些細菌的生理代謝和環境功能仍需依賴菌株分離培養來進一步驗證[14].

4 結論

a) 該煤礦酸性廢水中Fe主要在多級復氧反應池中去除，Mn主要在濕地系統中去除. 沉積物中富集了大量Fe、Mn、Ni、As和Pb等金屬，其中Fe含量高達26.74%，在濕地系統沉積物和植物根際土壤中Mn的含量(2.9%±0.16%)明顯高于多級復氧反應池沉積物中Mn的含量(0.08%～0.83%).

b) 反應系統中的主要優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)，藍細菌門(Cyanobacteria)為反應池懸浮物中的主要優勢菌門，豐度為90.95%. 沉積物中的細菌群落結構受金屬元素Fe、Ni、As和Pb含量影響較大，隨反應系統的處理程度，沉積物中細菌α-多樣性指數增加.

c) Beta分析表明，細菌群落豐度在系統前端(進水溝渠和反應池)和后端(沉淀池和濕地)存在差異. 系統沉積物中鐵氧化細菌〔披毛菌屬(Gallionella)和Sideroxydans等〕和鐵還原細菌〔地桿菌屬(Geobacter)等〕豐度隨處理進程均降低，但在濕地系統沉積物和植物根際土壤中土微菌屬(Pedomicrobium)(8.38%±1.51%)和硝化螺旋菌屬(Nitrospira)(14.75%±0.46%)豐度明顯高于多級復氧反應池.