紫草素抑制ERK1/2-NF-κB通路對大鼠心房顫動的改善作用

舒禮良，黃功成，郝爽，黃辰，朱效華，徐敬

鄭州大學第一附屬醫院心血管外科，鄭州 450052

心房顫動(簡稱房顫)是心臟疾病患者常見的一種臨床表現，目前其治療仍是世界難題[1-2]。心肌纖維化造成的心房重構是導致房顫的主要原因之一[3]，可能成為房顫干預的重要切入點。紫草素(shikonin)是從紫草科植物紫草中提取的一種萘醌類化合物，具有多種藥理學作用，如抑制腫瘤細胞增殖、遷移和浸潤，減輕四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化，以及博來霉素誘導的肺纖維化等[4-7]，但是否能改善大鼠房顫仍需進一步研究。本研究探討紫草素對大鼠心肌纖維化、房顫的影響，旨在為紫草素作為臨床治療房顫的藥物成分提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡健康清潔級雄性SD大鼠30只，體重180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2017-0011]。實驗過程符合國家和單位有關實驗動物管理和使用的規定。

1.2 試劑與儀器 紫草素(純度≥98%)、乙酰膽堿(ACh)、CaCl2購自美國Sigma-Aldrich公司；兔抗鼠膠原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ，Col Ⅰ)、細胞外信號調節蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)、p-ERK1/2、核轉錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB) p65、p-NF-κB p65、GAPDH一抗購自英國Abcam公司；HRP標記的山羊抗兔二抗購自美國Sigma公司；蘇木精-伊紅(HE)試劑盒、Masson染色試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；TGL-16M高速離心機購自湖南長沙湘儀儀器廠；EN61010-1水平電泳儀購自美國Bio-Rad公司；電子心電圖機購自成都泰盟科技有限公司。

1.3 分組與處理 30只大鼠適應性喂養2 d后，隨機分為正常對照組、模型組、紫草素組，每組10只。紫草素組大鼠按照紫草素4 mg/kg(溶于0.2%DMSO)的劑量灌胃給藥[8]，正常對照組、模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，1次/d，連續7 d；1周后，紫草素組和模型組大鼠按照1 ml/kg的劑量尾靜脈注射ACh-CaCl2混合液(66 μg ACh+10 mg/ml CaCl2溶于0.9%的NaCl)，1次/d，連續注射7 d，正常對照組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水，7 d后取材進行下一步實驗。

1.4 心電圖數據采集 末次尾靜脈注射ACh-CaCl2混合液的同時，以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，固定于鼠板上，電子心電圖機進行肢體導聯，記錄各組大鼠心電圖。模型組和紫草素組大鼠給藥后發生陣發性房顫，以出現f波及p波消失為發生房顫的標志，以f波消失及p波出現為房顫終止的標記[9]。記錄房顫的誘發時間和持續時間。

1.5 超聲心動圖檢測心功能 心電圖記錄完畢后，進行超聲心動圖檢測。大鼠胸部脫毛，采用彩色多普勒超聲診斷儀檢測各組大鼠左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室縮短分數(left ventricular fractional shortening，LVFS)、左心室收縮末期內徑(left ventricular endsystolic diameter，LVESD)、左心室傳張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)。

1.6 HE染色觀察心肌組織病理學變化 超聲心動圖檢測完成后，30只大鼠脫頸處死，剝離心臟，生理鹽水清洗后切取部分心房組織，保存于-196 ℃液氮中，用于蛋白提取。其余心房組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，脫水、包埋后做石蠟切片，每張切片的厚度為4 μm。嚴格按照試劑盒說明書進行HE染色，光學顯微鏡下觀察心肌組織形態。

1.7 Masson染色檢測心肌組織纖維化 石蠟切片經60 ℃烤片30 min后，常規脫蠟，蘇木精染色5 min，酸性乙醇分化，酸性品紅溶液染色3 min，磷鉬酸染色10 min，苯胺藍溶液染色10 min，酸性乙醇分化，常規脫水，透明，中性樹膠封片。待中性樹膠凝固后，光學顯微鏡下觀察大鼠心肌細胞間隙膠原沉積情況。每張切片隨機選取5個視野，采用Image J軟件測定每個視野藍染區域面積，計算膠原面積百分比。膠原面積百分比(%)=藍染區面積/整個視野面積×100%。

1.8 Western blotting檢測心肌組織中Col Ⅰ、p-ERK1/2、ERK1/2、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表達水平 取出液氮中的心房組織，勻漿后，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入溴酚藍后煮沸使蛋白穩定。每孔加入20 μl蛋白樣品，恒壓120 V電泳，待溴酚藍電泳至凝膠底部時，停止電泳。0.3 A恒流濕轉，2 h后結束(采用PVDF膜)。TBST洗膜5 min×3次，封閉1 h。加入Col Ⅰ、ERK1/2、NF-κB p65、p-ERK1/2、p-NF-κB p65和GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次后ECL顯色。ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.9 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 紫草素對房顫的影響 正常對照組大鼠心電圖可見明顯p波，模型組和紫草素組大鼠尾靜脈注射ACh-CaCl2混合液后則出現典型房顫改變：f波出現，p波消失(圖1)。模型組房顫誘發時間和持續時間分別為(4.53±0.41) s、(6.83±0.72) s，與模型組比較，紫草素組房顫誘發時間[(7.57±0.58) s]明顯延長，持續時間[(3.82±0.81) s]明顯縮短(P＜0.05)。

圖1 正常及房顫大鼠心電圖表現Fig.1 The ECG of normal rats and typical atrial fibrillation rats

2.2 紫草素對房顫大鼠心功能的影響 超聲心動圖檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型組及紫草素組LVEF、LVFS降低，LVESD、LVEDD增高(P＜0.05)；與模型組比較，紫草素組LVEF、LVFS升高，LVESD、LVEDD縮短(P＜0.05)，差異均有統計學意義(表1)。

表1 各組超聲心動圖參數比較(±s, n=10)Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters in each group of rats (±s, n=10)

表1 各組超聲心動圖參數比較(±s, n=10)Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters in each group of rats (±s, n=10)

LVEF. 左心室射血分數；LVFS. 左心室縮短分數；LVESD. 左心室收縮末期內經；LVEDD. 左心室舒張末期內經；與正常對照組比較，(1)P＜0.05；與模型組比較，(2)P＜0.05。

組別 LVEF (%) LVFS (%) LVESD (mm) LVEDD (mm)正常對照組 69.73±8.22 45.13±6.54 3.29±0.61 6.34±0.77模型組 50.79±6.41(1) 25.09±5.23(1) 7.01±0.77(1) 9.71±0.84(1)紫草素組 61.40±5.06(1)(2) 36.51±5.00(1)(2) 4.15±0.52(1)(2) 7.15±0.78(1)(2)F 20.136 31.870 92.106 48.683 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 紫草素對房顫大鼠心肌細胞形態和結構的影響 HE染色結果顯示，正常對照組大鼠心肌細胞排列致密、整齊；模型組大鼠心肌細胞出現排列紊亂、肥大、細胞間隙增寬；紫草素組大鼠心肌細胞形態和結構損傷程度較模型組有所改善(圖2)。

圖2 各組心肌細胞形態和結構的HE染色結果(×400)Fig.2 Myocardial cell morphology and structure of rats in each group (HE ×400)

2.4 紫草素對房顫大鼠心肌纖維化的影響 Masson染色結果顯示，與正常對照組(1.02%±0.11%)比較，模型組及紫草素組大鼠心肌組織膠原面積百分比(分別為3.57%±0.42%、2.33%±0.30%)均明顯增加(P＜0.05)；與模型組比較，紫草素組大鼠心肌組織膠原面積百分比減小(P＜0.05)(圖3)。

圖3 各組心肌組織Masson染色結果(×400)Fig.3 Myocardial tissue of rats in each group (Masson ×400)

2.5 紫草素對房顫大鼠心肌組織蛋白表達的影響

Western blotting檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型組及紫草素組Col Ⅰ、p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達明顯升高(P＜0.05)；與模型組比較，紫草素組Col Ⅰ、p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達明顯降低(P＜0.05)；各組間ERK1/2、NF-κB p65蛋白表達差異無統計學意義(P＞0.05)(圖4)。

圖4 各組心肌組織蛋白表達情況(n=10)Fig.4 Protein expressions of myocardial tissue of rats in each group (n=10)

3 討 論

房顫是導致患者卒中發生率及病死率明顯增高的原因之一[10]。目前認為，房顫主要是由心房結構重構、心房肌電重構以及自主神經失調引起，心房結構重構包括心房肌細胞凋亡、心臟成纖維細胞增殖或炎癥等異常生理過程造成的細胞外基質沉積導致的心房纖維化等改變。發生纖維化時，正常心肌細胞周圍包繞膠原纖維，心肌細胞間電傳導的連續性被破壞，導致心房相鄰肌束之間解偶聯，局部電傳導被阻滯，傳導異質性增強，且傳導速度減慢，電傳導在心房內形成折返環，從而引發房顫[11]。因此，心肌纖維化可能是房顫治療的一個潛在關鍵因素和生物標志物[12-13]。紫草素在抑制炎癥反應和纖維化中的作用已有報道，但紫草素能否減輕房顫模型大鼠心肌纖維化，改善心功能尚需進一步研究。因此，本研究探討了紫草素對ACh-CaCl2混合液引起的房顫大鼠的保護作用及其可能的機制。

ACh作用于心房肌膽堿能M型受體，激活ACh依賴性K+通道，K+外流增加，使心房肌細胞快速復極，動作電位時長和有效不應期縮短，致使房顫持續時間延長。心肌細胞外Ca2+濃度增加，使心肌細胞膜上鈣通道關閉，而L型鈣通道在動作電位平臺期可將Ca2+由膜外轉至膜內，一旦鈣通道關閉將導致Ca2+內流減少，心房肌細胞動作電位除極緩慢，則可促發房顫。因此，本研究采用ACh-CaCl2混合液尾靜脈注射建立房顫大鼠模型，然后通過灌胃給藥研究紫草素對房顫的影響。心電圖結果顯示，與模型組比較，紫草素治療后f波出現時間延長，持續時間縮短。超聲心動圖檢測結果顯示，與正常對照組比較，模型組LVEF、LVFS降低，LVESD、LVEDD增高，大鼠心功能嚴重損傷；與模型組比較，紫草素組LVEF、LVFS升高，LVESD、LVEDD降低，心功能改善，提示大鼠發生房顫時，心肌細胞損傷嚴重，心肌組織出現明顯纖維化，而紫草素治療后可明顯減輕心肌細胞損傷，并抑制心肌纖維化，與季佳文等[14]的研究結果一致。此外，還有研究發現，紫草素可抑制多種臟器如肝臟[15]、腎臟[16]等的纖維化。因此，紫草素可能通過抑制心肌纖維化而改善房顫大鼠的心電功能。

NF-κB是一種普遍存在的轉錄因子，參與了大鼠心肌細胞凋亡、脂多糖誘導的炎癥反應、腫瘤細胞增殖及遷移等多種下游基因的調控，與多種疾病的發展過程有關[17-19]。NF-κB家族由P50、P52、P65、c-Rel和ReIB 5個成員組成，其中P65是NF-κB家族中主要的轉錄因子，在腎臟、肝臟、肺臟等器官的纖維化中發揮調節作用[20-21]。ERK1/2-NF-κB信號通路在調節炎癥反應過程中具有重要作用，李霞等[22]發現，復方鉤藤降壓片可通過抑制NF-κB信號通路降低自發性高血壓大鼠的炎癥反應。姜京植等[23]發現，葫蘆素E可通過抑制ERK1/2-NF-κB信號通路發揮抑炎作用，從而減輕哮喘小鼠的氣道炎癥。在外界因素刺激下，ERK1/2被激活發生磷酸化，而磷酸化的ERK1/2作用于NF-κB，使NF-κB二聚體解體并發生磷酸化后從細胞質轉位入細胞核，進一步介導炎癥反應。李小兵等[24]發現，房顫大鼠心肌組織中ERK1/2-NF-κB信號通路被激活，炎性細胞浸潤，炎性因子升高，心肌細胞外膠原沉積。心肌細胞外大量膠原沉積造成心肌纖維化，而心肌纖維化可破壞心房組織的結構和功能，導致房顫的發生發展。適量的炎性因子可促進心肌成纖維細胞增殖并合成膠原，有利于壞死組織修復，但炎性因子的持續分泌則可開啟并放大炎癥反應級聯效應，合成大量膠原并沉積，最終導致心肌纖維化。Wang等[25]發現，紫草素抑制ERK/NF-κB信號通路可減輕過敏性氣道重塑。Yang等[26]發現，紫草素可通過抑制NF-κB信號通路在脂多糖誘導的乳腺炎中發揮抗炎作用。本研究通過紫草素灌胃治療房顫模型大鼠，并采用Western blotting檢測ERK1/2-NF-κB信號通路相關蛋白及纖維化標志性膠原蛋白Col Ⅰ的表達，結果顯示，房顫大鼠心房組織中Col Ⅰ、p-ERK1/2及p-NF-κB p65蛋白表達水平升高，而紫草素治療后，大鼠心房組織中Col Ⅰ、p-ERK1/2及p-NF-κB p65蛋白表達水平降低，提示紫草素可通過抑制ERK1/2-NF-κB p65信號通路減少細胞外膠原沉積，減輕心肌纖維化，改善房顫大鼠的心功能。

綜上所述，紫草素可通過抑制ERK1/2-NF-κB信號通路減輕心肌纖維化，抑制房顫的發生，并改善心功能。但本研究仍存在一些不足之處：纖維化是一個多因素網格化相互作用的過程，本研究僅探討了ERK1/2-NF-κB信號通路在此過程中的作用；此外本研究缺乏ERK1/2-NF-κB信號通路激活引起纖維化后加重房顫的直接證據。本研究為臨床治療房顫提供了新的思路和方向，但后續仍需進一步探討更具體、全面的作用機制。