N6-甲基腺苷在肝細胞癌發生發展中的作用

馬 可， 趙禮金

遵義醫科大學附屬醫院 肝膽胰外科， 貴州 遵義 563000

肝癌是全球最常見的消化系統腫瘤之一,也是癌癥死亡的第四大原因,每年約有841 000例新發病例和782 000例死亡，肝癌的死亡人數占總病例數的8.2%，而肝細胞癌(HCC)在肝癌中所占比例高達75%～85%，中國更是HCC的高危地區，占全球新發病例的50%，且呈明顯的上升趨勢[1]。雖然多學科綜合治療及個性化的治療方案使HCC患者的5年生存率得以提高，但HCC的篩查、復發和轉移仍是今后進一步探索和亟待解決的難題。目前已經證明N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)修飾通過對信使RNA(mRNA)和非編碼RNA(ncRNA)的調節影響基因的表達，并與包括HCC在內的多種人類癌癥有關[2]。m6A水平以及m6A甲基化酶復合物的異常改變將會通過抑制或促進HCC相關基因的表達影響HCC的進展。因此，本文就m6A甲基化酶復合物在HCC的發生與發展的作用機制進行綜述，以期為HCC的預防和治療提供新的靶點。

1 m6A的結構與功能

m6A是指腺嘌呤的第6位氮原子(N)發生了甲基化修飾，分布于終止密碼子附近(與RNA翻譯相關)和較長的內部外顯子內(與RNA剪接相關)，這種結構模式體現了RNA甲基化高度保守的特征[3]。甲基轉移酶(編輯器)、去甲基酶(消碼器)和被稱為“讀碼器”的m6A結合蛋白組成的甲基化酶復合物決定著m6A的功能[4-5]。m6A修飾是一個甲基化與去甲基化的動態過程，METTL3、METTL14、METTL16、WTAP、RBM15、KIAA1429等組成的甲基轉移酶和去甲基酶(ALKBH5、FTO)維持著這個過程的平衡，當這種平衡被打破后將會對生物體造成不同程度的損傷。m6A結合蛋白(YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、HNRNPA2B1和HNRNPC)可以與RNA中的m6A修飾位點結合并發揮特定的作用[5-7]。

m6A甲基化在轉錄后水平上調控mRNA和ncRNA的剪接、運輸、穩定性和翻譯，但不會改變轉錄產物[8]。Alarcon等[9]研究發現METTL3可以甲基化初級微小RNA(pri-miRNA)，促進RNA結合蛋白DGCR8的識別和加工的功能，進而促進微小RNA(miRNA)的成熟。當METTL3缺失時，降低了DGCR8與pri-miRNA的結合，導致成熟miRNA的減少和未加工的pri-miRNA的積累。YTHDF1通過與翻譯起始因子相互作用，增加m6A修飾的mRNA分子的核糖體數量，提高目的mRNA的翻譯效率[10]。YTHDF2羧基末端可以選擇性地與含有m6A的mRNA結合，而氨基末端則負責定位細胞中YTHDF2-mRNA復合物的RNA衰變位點，從而降低了mRNA的穩定性，加速mRNA的降解[11]。YTHDC1通過與mRNA剪接因子相互作用來調節含有m6A的外顯子的剪接[12]。核不均一蛋白HNRNPA2B1參與調節pri-miRNA的轉錄，并引起與METTL3類似的選擇性剪接效應，促進pri-miRNA加工成前體微小RNA(pre-miRNA)，而HNRNPC可能影響mRNA和長鏈非編碼RNA(LncRNA)局部的二級結構[4,13]。

m6A對RNA的調控與干細胞分化、免疫調節和腫瘤的發生與發展等一系列生理和病理生物學行為有關。METTL3和METTL14在胚胎干細胞中催化的m6A修飾抑制了編碼發育調節因子的mRNA，從而促進了胚胎干細胞的自我更新[14]。在免疫反應中，m6A修飾抑制了Toll樣受體3(TLR3)和RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ)的激活，這導致了被病毒感染的宿主無法識別外源RNA的入侵，從而導致病毒RNA逃逸免疫監測[15-16]。Zhao等[17]研究發現去甲基酶FTO可以通過降低m6A水平抑制選擇性剪接因子SRSF2在RUNX相關轉錄因子1轉位1(RUNX1T1)mRNA上的結合，從而調控RUNX1T1亞型的表達，促進脂肪的形成。此外，已有大量證據[18-19]表明m6A水平及其調節因子的異常改變對腫瘤的增殖、侵襲和遷移等惡性生物學行為存在密切的關系。

2 m6A甲基化的異常調節促進HCC的進展

2.1 HCC中的m6A“編輯器”的異常表達 研究[20-21]顯示，甲基轉移酶樣因子3(methyltransferase like 3，METTL3)在HCC組織中的表達高于正常肝組織，與HCC患者預后不良相關。在METTL3基因敲除的Huh-7和HepG2細胞模型中，m6A mRNA水平顯著降低，并抑制了HCC細胞的增殖、遷移以及HCC的克隆形成能力。裸鼠的皮下移植瘤實驗和體內原位移植瘤實驗均顯示METTL3基因敲除后可以抑制HCC的形成和生長，并減弱了HCC的肺轉移。進一步研究[21]顯示，細胞因子信號轉導抑制因子2(suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2)是METTL3的下游靶基因。SOCS2是細胞因子信號轉導抑制因子家族中的一員，在HCC中具有抑制癌細胞增殖和遷移的作用。METTL3針對SOCS2進行的m6A修飾促進了SOCS2 mRNA降解從而抑制了SOCS2的表達。Xu等[22]研究發現，有絲分裂原可以通過上調泛素結合酶UBC9促進METTL3與泛素化修飾物SUMO1結合，促進METTL3泛素化的發生，抑制了METTL3作為甲基轉移酶的活性，這使得轉錄因子Snail在HCC細胞中聚集，從而促進HCC的進展。值得注意的是，METTL3的泛素化水平增加與HCC的高轉移潛能呈正相關。Zuo等[23]發現了一種新的與HCC中脂肪生成相關的LncRNA——LINC00958，METTL3介導的m6A修飾通過穩定LINC00958的RNA轉錄使其表達上調，隨后LINC00958通過抑制miR3619-5p上調了HCC衍生生長因子(HDGF)表達，進而促進HCC的發生與發展。METTL3與RNA結合蛋白DGCR8相互作用，以m6A依賴的方式通過上調miR-873-5p抑制SMG1的表達，從而在HCC中發揮致癌作用[24]。Lin等[25]通過轉錄本測序分析顯示，METTL3的表達降低與HCC索拉非尼耐藥顯著相關。既往研究[26]表明，自噬增加了腫瘤對抗癌藥物的耐藥性，FOXO3是調節自噬的相關基因。METTL3介導的m6A修飾以YTHDF1依賴的方式促進了FOXO3 mRNA的穩定性。在缺氧條件下誘導的METTL3下調則通過降低FOXO3的表達促進了自噬的發生，從而使HCC對索拉非尼的耐藥性顯著增強，而過表達FOXO3后可恢復HCC對索拉非尼的敏感性[25]。

與METTL3相似的是，甲基轉移酶WTAP和KIAA1429在HCC中顯著上調，可以促進HCC的發展并且與HCC的預后不良相關。原癌基因ETS1是HCC中的一種腫瘤抑制因子，WTAP介導的m6A修飾抑制了ETS1與RNA穩定劑HUR的結合，從而促進了ETS1的降解。此外，WTAP還可以通過ETS1-p21/p27信號通路促進G2/M期轉變，調節HCC細胞的細胞周期[27]。KIAA1429誘導轉錄因子GATA3 Pre-mRNA 3′端非編碼區(UTR)m6A甲基化，導致RNA結合蛋白HUR分離，GATA3 Pre-mRNA降解，進一步抑制GATA3的表達，最終促進HCC的增殖和轉移[28]。Cheng等[29]在體外研究中發現，KIAA1429通過上調ID2 mRNA的m6A修飾來抑制ID2的表達，從而促進HCC的遷移和侵襲。

然而，另一個甲基轉移酶復合物的核心分子METTL14與METTL3在HCC的發生與發展中起到相反的調節作用。METTL14在HCC中是一種腫瘤抑制因子，在HCC樣本中的表達顯著低于正常肝組織[19]。先前的一項研究[30]發現，METTL14可以通過與RNA結合蛋白DGCR8的相互作用，以m6A依賴的方式促進pri-miRNA-126成熟，從而抑制HCC的轉移。Li等[31]通過對GEO等數據庫的分析發現了三種可被METTL14調控的下游基因，包括半胱氨酸亞磺酸脫羧酶(CSAD), 谷草轉氨酶2(GOT2)和SOCS2。CSAD在肝臟的癌前病變中處于高表達狀態，GOT2基因多態性與職業性肝損傷密切相關，特別是GOT2被發現與許多癌癥有關，如胰腺癌和結直腸癌等[32-35]。如前所述，SOCS2在HCC中是一種腫瘤抑制因子。總之，這三種受METTL14調控的基因與包括HCC在內的多種癌癥有著密切關系，但這三種基因的調控在HCC的發生與發展中的具體作用機制有待于進一步探究。最新研究[36]發現，METTL16在HCC中也呈現低表達狀態，METTL16基因缺失預示著存活率降低，并且是HCC患者無病生存率的獨立危險因素。該項研究同時提出了METTL16是評價HCC預后的一項生物標志物，也是治療HCC的潛在靶點。

2.2 HCC中的m6A“消碼器”的異常表達 ALKBH5和FTO是m6A甲基化修飾中的去甲基化酶。Chen等[37]發現ALKBH5在HCC中表達下降是患者預后不良的獨立危險因素。LY6/PLAUR結構域包含體1(LYPD1)在HCC的發生發展中具有促進作用，LYPD1的缺失可以抑制HCC細胞的增殖和侵襲能力，而LYPD1在癌組織中的表達增加預示著HCC的預后較差[37]。ALKBH5通過抑制IGF2BP1介導的LYPD1 mRNA的穩定性來抑制HCC細胞的增殖和侵襲。但是，ALKBH5/IGF2BP1挽救試驗的結果在兩個不同的HCC細胞系之間略有不同，這表明IGF2BP1可能不是ALKBH5下游唯一的m6A讀碼器[37]。FTO是最早發現的去甲基酶，其在HCC中的作用卻存在著爭議。先前有報道[35]表明，FTO的過度表達與HCC患者的預后不良相關。FTO介導的丙酮酸激酶(PKM2) mRNA去甲基化，加速其翻譯產物的生成，從而促進了HCC的進展。但是，最新的研究[38]顯示FTO抑制了DEN誘導的HCC發生。FTO不僅可以在HCC發展的初始階段抑制癌細胞的增殖，而且FTO以CUL4A mRNA為靶點，降低CUL4A蛋白水平，阻斷細胞周期進程和增殖，從而抑制HCC的進展。此外，Liu等[39]在研究中發現沉默信息調節因子1(SIRT1)可以通過激活泛素化修飾物E3連接酶(RANBP2)誘導FTO泛素化和降解，導致腫瘤抑制因子鳥嘌呤核苷酸結合蛋白G(O)亞基α(GNAO1)發生m6A修飾，抑制GNAO1 mRNA和蛋白的表達促進HCC的發展。這些研究結果揭示了FTO在HCC的發生發展中具有抑制作用。因此，關于FTO在HCC中的功能尚需要進一步闡明。

2.3 HCC中的m6A“讀碼器”的異常表達 目前發現的m6A結合蛋白包括YTH結構域蛋白(YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2)和核不均一蛋白HNRNP(HNRNPA2B1、HNRNPC)。YTHDF1和YTHDF2在HCC中表達顯著增高，在HCC細胞的增殖、侵襲和遷移中起重要作用，是影響HCC患者預后的危險因素[18,24,40]。在HCC中，受c-MYC和USF1的調節導致YTHDF1的高表達，隨后YTHDF1以m6A依賴的方式促進FZD5 mRNA的翻譯[19]。FZD5則通過WNT/β-catenin信號通路促進HCC細胞的增殖、侵襲和遷移[19]。除此之外，YTHDF1在METTL3的調控下可以與轉錄因子snail的mRNA的CDS區結合，促進snail蛋白的表達，從而對HCC細胞的上皮-間充質轉化產生影響[41]。YTHDF2在HCC中的表達則存在爭議。一方面，Zhang等[42]通過TGCA數據分析和對100例HCC組織進行的免疫組化染色顯示YTHDF2在HCC中呈高表達狀態，并通過進一步研究表明YTHDF2的過表達使OCT4 mRNA 5′UTR m6A水平升高，促進了OCT4的表達，使得HCC細胞的腫瘤干細胞表型增加并促進了HCC的肺轉移。Yang等[43]研究也表示YTHDF2與HCC的惡性水平呈正相關，這種相關性可能與HCC中miRNA-145的缺失有關。此外，micRNA-145可通過靶向YTHDF2的mRNA 3′-UTR使得YTHDF2的表達下降，增加HCC中m6A mRNA的水平從而抑制HCC的發展。然而另一方面，有報道[44-45]稱HCC的缺氧特異性使YTHDF2表達下降。YTHDF2可以與表皮生長因子受體(EGFR) 3′-UTR的m6A修飾位點結合，促進EGFR的mRNA降解，抑制EGFR的表達。當YTHDF2過表達時可以抑制HCC細胞的增殖、腫瘤生長以及絲裂原活化蛋白激酶和細胞外調節蛋白激酶的激活[45]。Hou等[44]研究發現，當YTHDF2的表達下降時，HCC組織中m6A的水平明顯高于癌旁組織，而這種高表達與HCC患者的預后呈負相關。此外，YTHDF2在人HCC細胞中沉默或在小鼠肝細胞中消融可引起炎癥、血管重建和腫瘤轉移。因此，YTHDF2在HCC中的表達升高或者下降存在相互矛盾的情況，造成這一情況的原因可能與不同地區臨床樣本的差異有關。

綜上所述，m6A調節因子的異常表達會影響m6A的水平，在調控HCC的發生與發展中涉及到了對mRNA和ncRNA穩定性的調節，表現出復雜性和多樣性的特點(表1)。

表1 m6A調節因子在HCC中的作用及機制

3 總結與展望

近年來，隨著高通量測序技術的發展，m6A甲基化酶復合物的異常表達對腫瘤的調控作用逐漸被揭曉，它們通過調節靶基因mRNA的穩定性和翻譯來影響腫瘤的進展。目前，已有大量文獻支持m6A調節因子是HCC的生物標志物，其表達水平的異常是影響HCC發生與發展的危險因素。但是，m6A在HCC中的異常改變尚存在爭議，有報道稱HCC中m6A水平增加與預后不良有關，而另有研究顯示HCC組織以及轉移性腫瘤的整體m6A水平降低。另外，在不同的條件下，METTL3、FTO和YTHDF2等m6A調節因子在HCC中表現出了抑癌和致癌的矛盾作用，這可能也是m6A總體水平在HCC中不確定性的原因所在。因此，需要進一步的研究來闡明m6A修飾和m6A甲基化酶復合物在HCC發生發展中的特異性和復雜性，以期使靶向調控失調的m6A調節因子成為治療HCC的一種新的選擇。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：馬可負責課題設計，資料分析，撰寫論文；趙禮金負責擬定寫作思路，指導文章的撰寫并最后定稿。