NLRP3炎性體在膽總管結扎誘導的肝纖維化大鼠模型中的表達特點

周蒙恩， 陳懿榕， 張 娜， 晏 旎， 闕任燁， 李 勇

上海中醫藥大學附屬市中醫醫院 脾胃病科， 上海 200071

肝纖維化是指細胞外基質過多沉積，破壞肝臟的生理結構，是各種慢性肝病(如慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等)的共同結果[1]。晚期肝纖維化可能進展為不可逆轉的肝硬化，肝硬化可引起腹水、脾腫大、側支循環形成、上消化道出血，甚至導致死亡[2]。NLRP3炎性體是機體固有免疫系統的重要組成部分，參與多種炎性疾病的發生發展。研究發現，在丙型肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝炎、肝纖維化、肝臟缺血/再灌注損傷等急慢性肝臟疾病發生發展過程中都存在著NLRP3炎性體的活化[3-7]，而在膽管結扎大鼠中尚未報道。本實驗通過膽總管結扎(bile duct ligation, BDL)造成大鼠膽汁淤積性肝纖維化模型，觀察肝纖維化過程中NLRP3炎性體的表達情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD成年大鼠，65只，體質量180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產許可證編號：SCXK(滬)2012-0002，實驗動物使用許可證編號：SYXK(滬)2020-0014，自由進食飲水，恒溫 (25±2)℃，恒濕，12 h/d，明暗交替。

1.2 試劑和儀器 NLRP3抗體(Cell Signaling Technology，美國)，ASC抗體、caspase1抗體(Novus Biologicals, 美國)，β-actin抗體(上海碧云天生物技術有限公司)，IL-1β ELISA 檢測試劑盒(Thermo Fisher Scientific， 美國)，TGFβ1、α平滑肌肌動蛋白(αSMA)免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司)，蘇木素-伊紅染色液(湖南艾佳生物科技股份有限公司)，Masson染色液(北京索萊寶科技有限公司)，天狼星紅染色液(北京雷根生物技術有限公司)，RT-PCR引物(上海生工生物工程有限公司)。天能EPS300電泳儀(上海天能科技有限公司)，RM2016切片機(萊卡公司)，多功能酶標儀(Thermo, 美國)，Nanodrop2000(Thermo, 美國)，S1000 PCR儀(BIO-RAD，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及模型建立 將65只SD大鼠隨機分為假手術組和模型組，假手術組15只，模型組50只，模型組行BDL，假手術組僅開腹并游離膽總管后關腹。造模方法參照文獻[8]進行，分別于第3、7、14、21、28天，處死10只模型組，同時處死3只假手術組。動物處死后取血清、肝組織標本備用。肝組織標本保存于-80 ℃中，部分標本用中性福爾馬林固定12 h后經石蠟包埋，3～5 μm厚連續切片備檢。

1.3.2 肝功能指標 用全自動生化分析儀檢測血清AST、ALT、ALP、DBil、TBA、TBil水平。

1.3.3 肝臟病理組織檢查 病理組織學采用HE染色、Masson染色、天狼星紅-苦味酸染色3種染色方法，取備檢石蠟切片經脫蠟、水化、染色、分化、透明、封片、鏡檢，分別觀察病變與纖維化程度。肝纖維化評分標準參照《肝纖維化診斷及治療共識(2019年)》[9]。

1.3.4 免疫組化檢測αSMA及TGFβ1表達 石蠟切片經脫蠟、水化，抗原修復冷卻后，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶的活性, 血清封閉，孵育一抗、孵育二抗，DAB顯色，蘇木素復染、脫水、透明后封片、鏡檢，用Image-Pro Plus 6.0 軟件對肝組織陽性表達面積進行半定量分析。

1.3.5 Western Blot檢測NLRP3炎性體表達

取大鼠肝臟組織裂解后，提蛋白，以SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，12%分離膠)進行電泳分離膠分離蛋白，并通過半干轉法轉移至PVDF膜，PVDF膜經5%的脫脂奶粉搖床上慢搖2 h封閉，分別與NLRP3抗體、ASC抗體、caspase1抗體4 ℃過夜，室溫孵育二抗2 h，ECL光化學顯色。最后應用Image J分析軟件對掃描條帶進行定量分析，計算各蛋白相對表達量。

1.3.6 RT-PCR檢測NLRP3、ASC、caspase1炎性體表達

取大鼠肝臟組織加入Trizol研磨離心取上清，提取總RNA，Nanodrop2000檢測RNA的純度和濃度，各組取2 μl總RNA，按20 μl總反應體積，反轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板分別進行PCR擴增。NLRP3上游引物 5′- GCTGCGATCAACAGGCGAGAC-3′，下游引物5′- AAGGCTGTCCTCCTGGCATACC-3′；ASC上游引物5′-ACAATGACTGTGCTTAGAGACA-3′，下游引物5′-CACAGCTCCAGACTCTTCTTTA-3′；caspase1上游引物5′-AGAGGATTTCTTAACGGATGCA-3′，下游引物5′-TCACAAGACCAGGCATATTCTT-3′；β-actin上游引物5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′，下游引物5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′。采用三步法進行PCR擴增，反應結束后，得到各樣本 CT值，然后利用2-△△Ct計算各組基因的相對表達量。

1.3.7 ELISA檢測IL-1β水平 取肝組織，置于含RIPA裂解液的離心管中裂解蛋白，4 ℃條件下離心，取上清液。按 ELISA 試劑盒說明書操作步驟檢測各組肝組織IL-1β水平。

1.4 倫理學審查 本研究方案經由上海市中醫醫院醫學倫理委員會審批，批號： SZY2017018，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 BDL大鼠血清肝功能檢測 BDL模型組大鼠自BDL術后血清肝功能各檢測指標顯著提高，并于第3天達最大值(P值均<0.05)；第7～28天各指標較3天組下降，但與假手術組相比仍有升高(P值均<0.05)(表1)。

2.2 大鼠肝臟組織HE染色 假手術組無炎癥細胞浸潤，肝細胞多，肝小葉結構完整；第3天和第7天BDL組可見匯管區少量炎細胞浸潤，肝小葉間膽管增生，中央靜脈與肝血竇輕度擴張淤血；第14天起可見匯管區纖維組織增生，肝小葉間膽管明顯增生，部分分割包繞肝小葉使其結構紊亂，第28天肝小葉結構嚴重破壞，被沉積的膠原分割成大量假小葉(圖1)。

注：a，假手術組；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

2.3 大鼠肝臟組織Masson染色 假手術組肝組織、肝小葉結構清晰，肝細胞索呈放射狀排列；膽總管結扎3 d后可見少量膠原纖維在匯管區和中央靜脈分布；第7天匯管區、肝竇擴大，纖維組織增生，沿匯管區、中央靜脈向外延伸；第14天匯管區、肝竇區、中央靜脈纖維組織增生，面積較前擴大；第21天大鼠肝組織膠原纖維帶明顯；第28天可見肝細胞脂肪樣變，小葉結構紊亂，纖維條索更加粗大明顯，部分互相連接(圖2)。

注：a，假手術組；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

2.4 大鼠肝臟組織苦味酸-天狼星染色 假手術組在中央靜脈壁和匯管區間見極少量膠原纖維，膽總管結扎3d后匯管區可見膠原纖維增生沉積較假手術組增多，隨著膽管結扎時間逐漸延長，肝纖維化程度持續增加，肝內膠原沉積在增生的膽管上皮細胞周圍，以匯管區為中心向肝實質延伸，增生的小膽管及其周圍的膠原纖維形成間隔，部分與臨近的增生間隔相互連接、包繞、分割，形成假小葉(圖3)。

注：a，假手術組；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

2.5 免疫組化檢測αSMA及TGFβ1在大鼠肝組織中的表達 結果顯示，假手術組僅在血管壁平滑肌見少量αSMA表達；BDL第3天，αSMA在血管壁表達明顯；第7天匯管區的膽管壁亦見αSMA表達、棕黃色顏色加深；第14天αSMA表達較前明顯增多，呈長橢圓形；第21、28天在匯管區、纖維間隔區αSMA蛋白沉積明顯、αSMA陽性表達的面積增大，染色明顯加深(圖4)。假手術組大鼠肝組織中可見少量TGFβ1表達，主要在肝組織的間質細胞；BDL第3、7天，大鼠肝組織中匯管區TGFβ1表達，呈棕黃色胞漿型分布；第14天，TGFβ1表達明顯增強，數目增多，匯管區和纖維隔中染色明顯加深，呈斑片狀彌漫性分部(圖5)。

注：a，假手術組；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

注：a，假手術組；b，BDL 3 d；c，BDL 7 d；d，BDL 14 d；e，BDL 21 d；f，BDL 28 d。

2.6 免疫組化半定量及肝纖維化程度評分 結果提示，免疫組化半定量中，除BDL第3天外，各組與假手術組相比，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，且隨時間延長αSMA、TGFβ1表達強度增加；肝纖維化評分比較，各組與假手術組相比，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，且隨時間延長肝纖維化程度增加(表2)。

表2 免疫組化半定量及肝纖維化評分

2.7 NLRP3炎性體蛋白表達 與假手術組比較，除BDL3 d組NLRP3外，余組NLRP3炎性體(NLRP3、ASC、caspase1)蛋白表達均增加(P值均<0.05)，隨時間延長，BDL14 d前組間比較，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，第14天后增高趨于平穩(圖6，表3)。

表3 NLRP3炎性體蛋白表達

圖6 大鼠肝組織NLRP3炎性體蛋白表達情況

2.8 NLRP3炎性體mRNA表達 與假手術組比較，各組NLRP3炎性體(NLRP3、ASC、caspase1)mRNA表達均增加(P值均<0.05)，隨時間延長，BDL14 d前組間比較，差異均有統計學意義(P值均<0.05)，14天后增高趨于平穩(表4)。

表4 NLRP3炎性體mRNA表達

2.9 肝組織IL-1β水平 IL-1β在造模后第3天明顯增高，并達到最高值，第7～28天各指標較第3天下降，但與假手術組相比仍有升高(P值均<0.05)(表5)。

表5 各組肝組織IL-1β水平

3 討論

BDL是制作肝纖維化動物模型的經典方法，可導致肝細胞變性、壞死及肝纖維化，最終導致肝硬化[1,9]。膽總管結扎急性期為3 d，慢性期超過10 d，急性期主要是炎癥開始及免疫細胞浸潤，慢性期主要是免疫細胞浸潤、炎癥和晚期纖維化的變化導致疾病進展[10]。肝臟受傷后，肝星狀細胞被激活分化為產生膠原的肌成纖維細胞，從而導致細胞外基質的過度產生，是肝纖維化發生發展的重要環節[11-12]。而αSMA的表達是肝星狀細胞活化的重要標志[13-14]，TGFβ1是參與肝纖維化過程中影響肝星狀細胞活化的最有效介質[15]，它通過刺激細胞外基質的合成和抑制細胞外基質的降解，在將靜止的肝星狀細胞轉化為纖維化的肌成纖維細胞過程中起著至關重要的作用[16]。NLRP3炎性體主要是由NLRP3、ASC、caspase1三者相互作用，形成的一個同心的組織，其中ASC層包圍著NLRP3蛋白，而caspase1則附著在外面的ASC層上[17]。NLRP3炎性體是機體固有免疫系統的重要組成部分，能夠識別各種應激、外源微生物和內源性危險信號，被多種刺激激活[18-19]。NLRP3炎性體被激活后，產生有活性的caspase1，導致IL-1β和IL-18的釋放，介導炎癥反應發生[20]。近來有研究[21]表明，NLRP3炎癥體在肝星狀細胞激活中的作用直接引發了肝纖維化。

有研究[22-25]顯示，NLRP3炎性體參與慢性阻塞性肺疾病、糖尿病腎病、心血管疾病、炎性腸病以及自身免疫疾病等的發生發展。同時在各種急慢性肝病及肝纖維化中也存在NLRP3的表達[26]，這將有望成為臨床上治療疾病的新靶點。據報道NLRP3抑制劑MCC-950可以減輕小鼠實驗性非酒精性脂肪性肝炎中的肝臟炎癥和纖維化[27]，caspase1抑制劑在體內抑制NLRP3炎癥小體可顯著降低膽管結扎小鼠肝組織成熟IL-1β水平，減輕肝纖維化程度[28]。但并沒有實驗說明NLRP3炎性體與肝纖維化的相關性，以及在肝纖維化形成過程中NLRP3炎性體是否持續活化。

本研究結果顯示，BDL大鼠模型第3天處于急性期，血清AST、ALT、ALP、DBil、TBA、TBil、肝組織IL-1β水平明顯升高，其后有所下降，考慮后期由急性期轉入慢性，在肝臟的自我修復功能作用下，肝功能指標及IL-1β有所恢復，但仍不能恢復到正常水平，隨著時間延長炎癥損傷持續存在。HE染色、Masson染色、苦味酸-天狼星染色，顯示BDL大鼠模型組隨時間延長，可見炎癥細胞浸潤，肝小葉間膽管增生，匯管區纖維組織增生，后期大量假小葉形成，以及膠原纖維沉積持續增加，肝纖維化程度評分逐漸增加，提示BDL大鼠模型中存在著肝炎-肝纖維化-肝硬化的動態演變；免疫組化結果顯示αSMA、TGFβ1 蛋白隨時間延長表達強度逐漸增加，提示肝纖維化過程持續加重；BDL大鼠模型組肝組織中NLRP3炎性體蛋白及mRNA表達漸次增高，14 d后趨于平穩，提示在肝纖維化過程中NLRP3炎性體活化持續存在，考慮到14 d后肝纖維化向肝硬化方向轉變，但NLRP3炎性體仍處于高表達狀態，說明在肝纖維化-肝硬化過程中NLRP3炎性體亦參與其中，但其作用機制仍需進一步探究。

以上結果顯示 BDL大鼠造模后肝臟損傷，病理學膠原纖維明顯沉積，肝纖維化標志物明顯表達，證實了BDL大鼠模型中存在肝炎-肝纖維化-肝硬化的動態演變；伴隨著肝纖維化的發生發展，NLRP3炎性體蛋白及基因表達明顯上調，并于BDL14 d后處于穩定高表達狀態，提示在肝炎-肝纖維化-肝硬化演變過程中存在著NLRP3炎性體的持續活化，可能與其發揮促進纖維化的作用有關。因此從NLRP3炎性體進行研究，探索肝纖維化的機理，有助于阻斷肝纖維化的產生，阻止病情進一步惡化，對臨床肝纖維化的治療及新藥的開發提供了一定依據。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：周蒙恩、陳懿榕等負責課題設計，資料分析，撰寫論文；張娜、晏旎、闕任燁等參與收集數據，修改論文；李勇等負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。