結核感染T細胞斑點試驗與抗結核抗體試驗對結核病的診斷價值

吳天恩，樂永宏，楊小燕

贛州市人民醫院檢驗科 (江西贛州 341000)

結核病屬于慢性傳染性疾病，主要病原菌是結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)。當MTB侵入機體后，會對肺及淋巴系統造成破壞，進一步累及循環、泌尿及骨骼等系統，嚴重危害患者的身體健康，因此，對結核病進行早期診斷、及時治療十分重要[1]。但是，由于結核病患者的臨床癥狀不明顯，易導致誤診。結核感染T細胞斑點試驗(tuberculosis infection of T cells spot test，T-SPOT.TB)是以細胞免疫應答為基礎的干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ)試驗，試驗中的抗原均來自MTB基因組與卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)缺失區域，即差異的區域(region of difference，RD)，有效避免了與BCG接種引起的交叉反應，降低了假陽性率。抗結核抗體試驗是以患者感染MTB后體液免疫應答為基礎，通過MTB抗原特異性的抗體來判定結核病[2-3]。上述兩種方式均為現階段臨床診斷結核病的有效方法。基于此，本研究比較T-SPOT.TB與抗結核抗體試驗對結核病的診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2014年6月至2020年12月我院收治的94例高度疑似結核病患者的臨床資料，其中男61例，女33例；年齡21～49歲，平均(34.97±4.65)歲。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。納入標準：存在咳血、盜汗、咳嗽、胸痛等結核病臨床特征；臨床資料完整。排除標準：在進行T-SPOT.TB與抗結核抗體試驗檢查前已經過痰培養確診為陽性；伴有免疫系統疾病；既往接受過抗結核病治療。

1.2 方法

1.2.1T-SPOT.TB試驗

(1)樣本采集：采集患者外周肘靜脈血4 ml于肝素鈉抗凝真空管中(于4 h內送檢)，然后將RPMI-1640培養液加入抗凝管中與所采集血液充分混合后，加入4 ml淋巴細胞分離液，以3 200 r/min離心20 min，離心后可見單個細胞存在于抗凝管中間的云霧狀層中；將分離出的單個細胞層置于15 ml的離心管中，用RPMI-1640培養液補齊至10 ml，以3 200 r/min離心7 min，棄去上清液，用RPMI-1640培養液補齊至10 ml，輕輕吹打沉淀后，以3 200 r/min再次離心7 min；棄去上清液，加入500 μl AIM-V無血清培養液；隨后加入40 μl 0.4%臺盼藍染液和10 μl細胞懸液，將混合細胞液進行活細胞計數處理；用無血清培養基配置濃度為2.5×106個/ml的細胞懸液至少400 μl。(2)培養板設置：將50 μl AIM-V無血清培養液、50 μl抗原A(B)加入培養板中，同時設立陽性對照50 μl，每孔加入濃度為2.5×106個/ml的細胞懸液100 μl，放于5% CO2培養箱孵育16～20 h，溫度保持在37 ℃左右。(3)斑點計數：在培養板孔內加入50 μl酶標抗體溶液孵育1 h，洗板5次，隨后加入50 μl底物溶液，在室溫下反應7 min，然后用蒸餾水洗滌行干燥處理，最后采用德國AID牌ELISPOT計數儀行斑點統計。(4)結果判定：陰性，抗原A(B)斑點數較陰性對照斑點數>6個，且陰性對照斑點數<5個，反之則為陽性。

1.2.2抗結核抗體試驗

檢測試劑盒由西安聯爾科技有限公司提供，采用蛋白芯片法檢測患者38 kD菌蛋白IgG，采集患者外周肘靜脈血3 ml于分離膠促凝管中，以3 200 r/min離心5 min，取血清待檢，取出芯片編碼后，在反應區加入試劑盒內A液200 μl，完全浸潤反應膜表面，待完全滲透后，于室溫下靜置1 min，加入100 μl待測血清，待血清完全滲透后，加入試劑盒內B液300 μl，完全滲透后，加入試劑盒內D液300 μl，完全滲透后，待反應膜表面干燥，在30 min內使用生物芯片識別儀進行判讀。臨界值=陰性對照OD均值+0.15；樣本OD值S/CO≥1為陽性，否則為陰性。

1.3 觀察指標

以痰培養結果為金標準，比較T-SPOT.TB與抗結核抗體試驗診斷結核病的效能。

1.4 統計學處理

采用SPSS 24.0統計軟件進行數據分析。計數資料以率表示，采用χ2檢驗；一致性評價采用Kappa檢驗，Kappa>0.74提示一致性好，0.40～0.74提示一致性一般，<0.40提示一致性差。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 痰培養結果

94例高度疑似結核病患者，經痰培養確診64例，其中肺結核22例，肺外結核42例。

2.2 T-SPOT.TB與抗結核抗體試驗診斷結核病的效能比較

經T-SPOT.TB檢出陽性62例，陰性32例，與金標準檢驗結果的一致性好(Kappa=0.759)，見表1；經抗結核抗體試驗檢出陽性55例，陰性39例，與金標準檢驗結果的一致性一般(Kappa=0.524)，見表2；T-SPOT.TB診斷結核病的靈敏度、準確度均高于抗結核抗體試驗，差異有統計學意義(P<0.05)；兩種診斷方法的特異度比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表1 T-SPOT.TB的診斷結果(例)

表2 抗結核抗體試驗的診斷結果(例)

表3 T-SPOT.TB與抗結核抗體試驗診斷結核病的效能比較(%)

3 討論

阻斷MTB的傳播是控制結核病的關鍵。痰培養是臨床診斷結核病的金標準，但耗時較長，易延誤診斷，導致MTB發生傳染、擴散[4-5]。有研究發現，免疫反應在結核病的發生、發展中起到重要的作用，而相應的診斷技術T-SPOT.TB與抗結核抗體試驗在結核病早期檢查中也逐漸得以開展[6]。機體在感染MTB后會刺激T細胞活化，T-SPOT.TB可在酶聯免疫法檢測的基礎上，對患者活化特異性T細胞進行檢測，進而減少卡介苗接種、其他分枝桿菌導致的假陽性，有助于對高度疑似結核病患者及潛伏性結核感染患者進行篩查。抗結核抗體試驗則以檢測38 kD菌蛋白IgG為原理，這是由于38 kD蛋白抗原屬于脂蛋白，可刺激B細胞產生抗體[7]。

本研究結果顯示，T-SPOT.TB與金標準檢驗結果的一致性好，抗結核抗體試驗與金標準檢驗結果的一致性一般；T-SPOT.TB診斷結核病的靈敏度、準確度均高于抗結核抗體試驗；表明T-SPOT.TB在結核病診斷中的應用價值較高，與以往研究結果相似[8]。經分析，其原因可能與T-SPOT.TB采用斑點計數有關，而斑點計數越多越有助于區分結核活動度，同時提示結核活動度越大。在結核病患者的不同階段，自身細胞及體液免疫會出現失衡，此時若考慮進行T-SPOT.TB與抗結核抗體試驗聯合檢測，則可從不同角度體現結核病的診斷效果，可能利于提高診斷準確度，但還需相關研究加以佐證。

綜上所述，T-SPOT.TB診斷結核病的靈敏度、準確度均高于抗結核抗體試驗，臨床應用價值較高。