宰前倒掛應激對鴨血凝膠特性的影響

董小麗，肖孟超，楊 靜,2，黃繼超*，黃蘇紅，黃 明,*

（1.南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095；2.國家禽肉加工技術研發專業中心，南京黃教授食品科技有限公司，江蘇 南京 211226；3.南京農業大學工學院，江蘇 南京 210031）

血液作為肉類行業產生的副產品，除少部分加工成飼料外，大部分被丟棄。這樣不僅浪費資源，也污染環境[1]。研究表明，血液制品所富含的賴氨酸可與以谷物為基礎的飲食互補，更有益于人體健康[2]。且與畜血相比，禽血中的蛋白質含有更多的賴氨酸[3]。鴨血作為優質的蛋白來源，不僅有補血、清熱解毒的作用，還富含多種人體必需的微量元素（鐵、鈣、鋅、錳等）[4]，特別是血紅素鐵能夠直接被人體腸黏膜吸收，生物利用率高，不刺激消化道，無副作用[5]。除此之外，鴨血中還含有多種對人體有益的生物活性物質，如抗氧化肽[6]、超氧化物歧化酶[7]等。聯合國糧食及農業組織的統計數據顯示：我國2018年肉鴨出欄量約35億 只，是世界第一的養鴨大國，肉鴨屠宰量增加的同時也使其副產物鴨血的產量增加。鴨血凝交制品（鴨血豆腐、鴨血腸等）因其口感嫩滑且營養豐富的特性成為鴨血重要的應用途徑之一，且深受我國消費者的喜愛，被譽為“液體肉”[8]。因此，合理利用鴨血，提高鴨血的利用率，提升鴨血凝交品質顯得尤為重要。

隨著肉鴨需求量的不斷增加，傳統的小規模養殖和作坊式活鴨現宰現賣被現代化大規模養殖、集中化屠宰所取代，為進一步提高效率，倒掛成為禽類宰殺前必經的一個工藝過程[9]，但有研究表明倒掛后，肉的品質會降低，如持水力變差、蛋白變性等[10-12]，可能是倒掛后肉鴨的應激程度加劇，出現撲翅、鳴叫等一系列掙扎行為所導致[13]。同時，也有研究表明，應激會對血液學指標和凝血系統產生影響，如Austin等[14]的研究表明應激會導致血液凝固速率加快，血小板活性增強，纖維蛋白溶解進程受到抑制；Park等[15]的研究發現櫻桃谷鴨在高溫和用甜菜堿飲食代替正常飲食雙重應激下，其紅細胞（red blood count，RBC）計數、血小板（platelet，PLT）計數、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）質量濃度、紅細胞比容（hematocrit，HCT）均高于對照組；Aengwanich[16]研究發現高溫環境會影響泰國土雞、肉雞和雜交雞的HCT；陳菲等[17]研究發現經超聲波破壁后，鴨血豆腐血細胞完全被破壞，鴨血豆腐的結構交聯更加致密，孔徑更小，保水性更好。由此可看出血細胞的完整性對鴨血凝交的影響顯著，但血細胞數量變化等對鴨血凝交的影響還有待探究。綜上可知，高溫、改變飲食等應激均會影響血液的品質，而宰前倒掛應激，作為禽類宰殺時不可避免的應激，是否會像其他應激一樣對血液學指標和凝血系統造成影響，從而影響鴨血的凝交特性還需進一步探討。因此，本研究以櫻桃谷鴨血液為研究對象，從其成分及凝血系統的角度探究宰前倒掛應激對鴨血凝交特性的影響，進一步探討宰前倒掛應激影響血液凝交品質的機理，以期為工廠改善鴨血凝交品質提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗鴨血為新鮮鴨血，40 只雄性櫻桃谷鴨（40 日齡、3.5 kg）由山東嘉祥新希望六和食品有限公司提供。

乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）真空采血管 南京梅林學海生物科技有限公司；促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、皮質酮激素（corticosterone，CORT）、組織因子（tissue factor，TF）、凝血酶原（prothrombin，PT）、組織因子途徑抑制劑（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）試劑盒 南京建成生物工程有限公司；檸檬酸鈉與CaCl2（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BC-2800Vet獸用全自動血液細胞分析儀 深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；Avanti J-E落地式高效冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；M2e多功能酶標儀德國IKA公司；Innova系列超低溫立式冰箱 英國New Brunswick公司；HH-42水浴鍋 常州國華電器有限公司；TA.XT2i質構儀 英國Stable Micro Systems公司；低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）儀 上海紐邁電子科技有限公司；MCR301旋轉流變儀 奧地利安東帕公司；205便攜式pH計德國Testo公司；Chroma Meter CR-400便攜式色差儀日本Konica Minolta公司。

1.3 方法

1.3.1 血樣采集及前處理

本實驗中櫻桃谷鴨在運輸前12 h開始禁食禁水，從養殖場運輸至屠宰場耗時0.5 h，然后將肉鴨安置在安靜、自然通風的場所靜養1 h。隨后，肉鴨被隨機分為對照組、宰前倒掛組，每組各20 只，按標準屠宰線流程采取三管齊斷的方式進行宰殺，宰前倒掛組宰前倒掛2.5 min[10]，對照組不進行倒掛。血樣采集參考Sorapukdee等[18]的方法，取5 mL血樣立即放入EDTA收集管進行血液學評價；取約100 mL血樣與質量分數10%檸檬酸鈉按9∶1（V/V）的比例混合，對血樣進行抗凝。將收集的血液保存在盛有冰的泡沫箱中。EDTA收集管的血樣立即送往南京農業大學動物醫院采用BC-2800Vet獸用全自動血液細胞分析儀[15]進行分析，且在24 h內完成血液學指標的檢測。添加檸檬酸鈉抗凝的血樣立即取10 mL進行離心（4 ℃、1 200×g、20 min），并取上清液（即血漿）分裝在2 mL凍存管中，液氮速凍后保存于-80 ℃條件下，用于后續CORT、ACTH、TF、PT、TFPI水平的測定；剩下的約90 mL血樣在0～4 ℃下保存，并在24 h內運回實驗室制成血凝塊。

1.3.2 血凝塊的制備

鴨血凝塊制備過程參考王鵬[19]的方法，并稍作修改：將約90 mL鴨血倒入食品級塑料盒中，向其中加入10 mL質量分數1% CaCl2對鴨血進行激活[20]，將盛有鴨血的塑料盒置于37 ℃中加熱20 min至鴨血凝固，隨后轉移至75 ℃下加熱20 min至形成血凝塊，在4 ℃下冷卻12 h，然后進行凝交特性（pH值、色澤、質構、加壓損失、及水分分布）的測定。鮮鴨血加CaCl2激活后需立即進行流變學分析。

1.3.3 血液指標的測定

1.3.3.1 應激指標的測定

將存于-80 ℃的血漿置于4 ℃緩慢解凍，解凍后采用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒測定CORT與ACTH的質量濃度，按照試劑盒說明書進行相關操作。

1.3.3.2 血液學指標的測定

采用獸用全自動血液細胞分析儀測定EDTA收集管的血樣的血液學指標，包括RBC計數、白細胞（white blood cell，WBC）計數、PLT計數、HGB質量濃度、HCT、平均紅細胞體積（mean red blood cell volume，MCV）及平均血小板體積（mean platelet volume，MPV）。

1.3.3.3 凝血指標的測定

將存于-80 ℃的血漿置于4 ℃緩慢解凍，解凍后利用ELISA試劑盒按說明書分別測定TF、PT、TFPI的質量濃度。

1.3.4 鴨血凝交特性的測定

1.3.4.1 pH值

采用便攜式PH計測定處理后的血凝塊的pH值，重復測定3 次。

1.3.4.2 色澤

用CR-400便攜式色差儀測定處理后的血凝塊的L*、a*和b*值，重復測定3 次。

1.3.4.3 質構

質構剖面分析（texture profile analysis，TPA）參考李鵬等[21]的方法，并稍作修改。使用TA.XT2i質構儀對邊長為10 mm正方體狀的樣品進行TPA模式控制下的兩次壓縮，測定樣品的硬度、黏著性、彈性、凝聚性、咀嚼性、交性、回復性，重復測定3 次。參數設定為探頭型號：P/50；測前速率：2 mm/s；測中速率：1 mm/s；測后速率：2 mm/s；壓縮比50%；兩次下壓間隔時間：5 s；數據收集率：200 點/s。

1.3.4.4 加壓損失率

加壓損失的測定參考彭增起[22]等的方法，并稍作修改。稱取約1 g樣品，用WW-3型應變式無側限壓縮儀測定鴨血凝塊的加壓損失率，重復測定3 次。測定參數及方法：在69.44 N下保持10 min，撤除壓力后用濾紙吸干水分，將樣品刮下后稱質量，加壓損失率按下式計算。

式中：m0為樣品初始質量/g；m1為樣品壓縮10 min后的質量/g。

1.3.4.5 水分分布

采用紐邁臺式脈沖NMR分析儀PQ001測定鴨血凝交的NMR弛豫時間。參數設置參考王鵬[19]的方法稍作改動。切取約2 g血凝塊置于10 mm（直徑）×35 mm的專用核磁管中，重復測定3 次。測試參數：用Carr-Purcell-Meiboom-Gill序列進行測量，樣品測試室溫度32 ℃、主頻21 Hz、偏頻217 614.30 Hz、90°硬脈沖寬度5.52 μs、采樣點數240 080、采樣頻率100 Hz、180°硬脈沖寬度10.48 μs、采樣等待時間4 000 ms、回波個數12 000、模擬增益20 db、數字增益2、重復采樣次數32、數據半徑1、開始采樣時間1.000 ms、半回波時間0.200 ms。數據經MultiExp Inv Analysis軟件反演后得到弛豫時間T2b、T21和T22及相應的峰面積占比。

1.3.4.6 動態流變

參考Wang Peng等[23]的方法，略有改動。將被CaCl2激活的鴨血均勻地涂在測試臺上，用液體石蠟包覆以防樣品蒸發，使用MCR301旋轉流變儀連續監測鴨血的黏、彈性變化，重復測定3 次。參數設定：探頭型號為PP 50；頻率為0.1 Hz；應變為2%；上下板狹縫為0.1 cm；流變測試的程序為10～37 ℃線性升溫（速率10 ℃/min），37 ℃保溫20 min，而后37～75 ℃線性升溫（速率同上），最后樣品在75 ℃保溫20 min。測定指標為流變儲能模量G′、損耗模量G′′。

1.4 數據處理與分析

所有數據均采用SAS 9.2軟件統計分析，使用單因素方差分析中的Duncan’s多重比較進行顯著性分析，P＜0.01為差異極顯著，P＜0.05為差異顯著。采用Origin 2017與GraphPad Prism V5.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 宰前倒掛應激后血液指標變化

2.1.1 宰前倒掛對鴨血應激指標的影響

禽類倒掛后會出現撲翅、鳴叫及身體繃緊等應激反應，此時，其交感神經-腎上腺髓質軸被激活，下丘腦-垂體-腎上腺活動增加，神經遞質使下丘腦釋放促腎上腺皮質激素釋放激素，促腎上腺皮質激素釋放激素作用于垂體釋放ACTH，ACTH最終作用于腎上腺皮質釋放CORT，導致血液中CORT的濃度升高。因此，血漿中CORT的質量濃度可用來評價禽類的應激水平[13,24]。由表1可知，宰前倒掛組鴨血漿中CORT的質量濃度極顯著高于對照組（P＜0.01），ACTH的質量濃度顯著高于對照組（P＜0.05），說明宰前倒掛能明顯加劇肉鴨的應激程度，與Sun Xiaobin等[10]的研究結果一致。

表1 宰前倒掛對鴨血應激指標的影響（n＝20）Table 1 Effect of pre-slaughter shackling on stress indicators of duck blood (n = 20)

2.1.2 宰前倒掛對鴨血中血液學指標的影響

由表1可知，與對照組相比，宰前倒掛2.5 min顯著影響了肉鴨的血液學指標，RBC計數、HGB質量濃度、HCT計數、PLT計數、MPV極顯著升高（P＜0.01），MCV顯著升高（P＜0.05），與Park等[15]研究櫻桃谷鴨在高溫和用甜菜堿飲食代替正常飲食雙重應激下血液學指標的變化結果一致；WBC計數雖有增加但不顯著（P＞0.05），與Patterson等[25]研究增大籠養密度對單冠來航雞WBC影響的結果一致。

2.1.3 宰前倒掛對鴨血凝血系統的影響

血液離開機體后很快就會凝固，是因為血液中含有凝血因子，在凝血因子的作用下，溶交狀態的纖維蛋白原轉變為凝交狀態的纖維蛋白[26]。但有研究表明鳥類內源性凝血途徑（由凝血因子XI和XII激活）因缺乏凝血因子XI和XII仍存爭議[27]，因此，其TF依賴途徑在血液凝固過程中必不可少，但TF途徑受到負調節物TFPI的抑制。同時，有大量研究通過基因敲除技術發現PT與TF的缺乏與致命性出血有關[28-29]。因此，可通過測定TF、PT、TFPI的水平來判斷肉鴨凝血系統的變化。由表1可知，宰前倒掛處理使鴨血中TF與PT質量濃度均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。TFPI質量濃度雖有升高，但無統計學差異（P＞0.05）。綜上，肉鴨在受到倒掛應激后，血液凝固系統更活躍，血液凝固加速，纖維蛋白溶解進程受到抑制。

2.2 宰前倒掛對鴨血凝交特性的影響

2.2.1 宰前倒掛對鴨血凝交pH值與色澤的影響

由表2可知，與對照組相比，宰前倒掛組的鴨血凝交的pH值顯著升高（P＜0.05），可能是由于倒掛增加了呼吸頻率，二氧化碳被大量呼出，導致血液中碳酸氫根減少，從而使pH值升高[30]。此外，宰前倒掛組的a*值（紅度）極顯著大于對照組（P＜0.01），鴨血顏色更加鮮紅；b*值（黃度）與L*值（亮度）均無顯著性差異（P＞0.05）。本研究中宰前倒掛應激使鴨血凝交更加鮮紅（a*值較大），這可能與應激后鴨血的血液學指標的變化相關。HGB是決定血色的主要蛋白質，是天然的食品著色劑[31]，本研究發現倒掛應激導致鴨血中HGB質量濃度極顯著升高（P＜0.01），這可能是鴨血顏色更加鮮紅的主要原因。

表2 宰前倒掛對鴨血pH值及色澤的影響Table 2 Effect of pre-slaughter shackling on pH and color of duck blood

2.2.2 宰前倒掛對鴨血凝交質構的影響

由表3可知，宰前倒掛組中的鴨血凝交的硬度和彈性顯著高于對照組（P＜0.05）；黏著性、凝聚性、交性與咀嚼性均極顯著低于對照組（P＜0.01），回復性與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。王鵬[19]對影響鴨血凝交質構的因素進行研究并指出硬度、交性與咀嚼性是評價鴨血凝交質構的主要指標，而硬度是最關鍵的指標，倒掛應激后，鴨血凝交的硬度顯著增大，而交性、咀嚼性和凝聚性均極顯著降低，這可能與宰前倒掛應激后鴨血中RBC、PLT增多，HGB、HCT、MPV、MCV水平上升相關，因為這一系列變化均會導致血液中干物質水平的增加，但過高的干物質水平可能會抑制血液凝血系統中纖維蛋白形成凝交的能力，干擾鴨血凝交網絡結構的形成，最終表現為鴨血凝交質地硬、交性差，導致鴨血凝交產生化渣的口感，這與傳統上鴨血凝交嫩滑的口感相悖，故宰前倒掛應激對鴨血凝交的質地造成負面影響。

表3 宰前倒掛對鴨血凝膠質構的影響Table 3 Effect of pre-slaughter shackling on texture of duck blood gel

2.2.3 宰前倒掛對鴨血凝交加壓損失率與水分分布的影響

LF-NMR可以在不破壞蛋白質凝交微觀結構的情況下檢測水在凝交中的遷移率和分布狀態，已成功地用于評價蛋白質凝交的穩定性和保水性[32]。保水性是評價鴨血凝交特性的重要指標。由圖1可知，與對照組相比，宰前倒掛組的鴨血凝交的加壓損失率顯著增大（P＜0.05），加壓損失率越大，即凝交的保水性越差，而保水性的降低將最終影響鴨血凝交的口感。本研究發現，宰前倒掛應激后鴨血中RBC、PLT、HGB、HCT、MPV、MCV的水平上升，這些變化均會導致血液中干物質含量的增加，使得鴨血凝交的保水性降低。除此之外，保水性降低還與凝交pH值的升高密切相關。綜合表2中pH值的研究結果可知，當pH值為7.49±0.26時，鴨血凝交的保水性更低，所以推測當pH值為7.49±0.26時更接近鴨血蛋白的等電點。當pH值接近鴨血凝交的等電點時，會影響鴨血蛋白氨基酸側鏈電荷分布，產生靜電作用，從而影響氫鍵等次級鍵的穩定性[33]，使鴨血蛋白凝聚體發生聚集，凝聚體間交聯空間變大，導致凝交脫水收縮，最后降低了鴨血凝交的保水性。圖2為鴨血凝交LF-NMR弛豫譜圖。弛豫譜圖上顯示出3 個峰，其中T2b（0～10 ms）代表與蛋白質大分子緊密結合的結合水，T21（10～300 ms）代表不易流動水，T22（300～10 000 ms）代表自由水[34-35]。由圖2可知，與對照組相比，宰前倒掛組中3 種狀態的水均向著弛豫時間更長的方向移動，說明應激改變了鴨血凝交的組織結構，使得鴨血凝交中水分的遷移率加快，水分自由度增大。同時，對照組和宰前倒掛組中鴨血凝交的不易流動水所占比例最高，說明兩組鴨血凝交均有較好的穩定性[36]。表4為各弛豫時間所占峰面積的比例，由表4可知，與對照組相比，宰前倒掛組T2b的峰面積比例（P2b）顯著降低，T21的峰面積比例（P21）顯著升高，T22的峰面積比例（P22）顯著降低（P＜0.05）。由此可知，倒掛應激減少了鴨血凝交中結合水與自由水的比例，增加了不易流動水的比例，這可能是因為肉鴨在受到倒掛應激后，血液凝固系統更活躍，鴨血形成凝交的速度加快，使得結合水還未及時與蛋白分子結合，就被快速形成的凝交網狀結構包裹，轉變為不易流動水，同時自由水也被快速包裹在網狀結構中，轉變為不易流動水。加壓損失的原理是加壓過程中樣品的微觀結構被破壞，大量的不易流動水因擠壓而流失，且相關研究表明結合水的比例與凝交的保水性呈正相關[32]，與本實驗中保水性結果一致。

圖1 宰前倒掛對鴨血凝膠加壓損失的影響Fig.1 Effect of pre-slaughter shackling on pressing loss of duck blood gel

圖2 鴨血凝膠橫向弛豫時間T2反演圖Fig.2 Inverted transverse relaxation time (T2) spectra of duck blood gel

表4 宰前倒掛對鴨血凝膠水分分布的影響Table 4 Effect of pre-slaughter shackling on water distribution in duck blood gel

2.2.4 宰前倒掛對鴨血凝交動態流變性的影響

儲能模量（G′）與損耗模量（G′′）分別表示黏彈性材料在形變過程中由于彈性形變（可逆）而儲存的能量與黏性形變（不可逆）而損耗的能量。可通過測定G′（圖3A）和G′′（圖3B）來觀察熱處理過程中鴨血由溶交狀態轉變為凝交狀態的動態黏彈性變化。G′表示鴨血凝交體系的彈性，G′′表示黏性[37]。由圖3可知，在75 ℃保溫階段，G′與G′′均處于持續上升趨勢，與對照組的趨勢相似，但宰前倒掛組的增速更快。已有研究表明G′增量與所用時間的比值可衡量兩處理組鴨血的凝交速率[19]，因此在75 ℃保溫階段，宰前倒掛組的凝交速率高于對照組。但宰前倒掛組在37 ℃保溫后期及37～75 ℃升溫階段與對照組相比，出現明顯不同的變化趨勢，在37 ℃保溫后期，G′與G′′均有小幅上升，可能是由于凝血因子開始被激活，鴨血蛋白在低溫條件下開始交聯，使鴨血凝交化，初步形成凝交網絡結構；在37～75 ℃升溫階段，G′與G′′均急速上升，可能是由于鴨血中的凝血因子大量激活，鴨血蛋白迅速展開，快速形成了鴨血的凝交網絡結構。綜上，倒掛應激加快了鴨血凝交的形成。

圖3 宰前倒掛對鴨血凝膠流變學特性的影響Fig.3 Effect of pre-slaughter shackling on rheological properties of duck blood gel

3 結 論

本研究發現宰前倒掛2.5 min后，鴨血漿中CORT和ACTH的質量濃度升高，表明肉鴨應激程度加劇。經倒掛后，鴨血的血液成分及凝血相關指標發生明顯變化，如RBC計數和PLT計數增多，MCV和MPV增大，HGB、TF、PT質量濃度升高等。此外，血液成分及凝血系統的變化影響了鴨血的凝交特性，如質地硬、交性和咀嚼性差、水分遷移率加快、不易移動水的比例增加、自由水和結合水的比例減少、保水性變差，但色澤變好。綜上，宰前倒掛應激會影響鴨血的血液學指標和凝血系統，從而改變其凝交行為及凝交特性，研究結果可為工廠改善鴨血凝交品質提供新方向和一定的理論參考。