花生主要過敏原Ara h 1線性B細胞表位的預測及鑒定

王俊娟，李欣芮，陳 成，孫善峰，劉桂蓉，車會蓮*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，食品質量與安全北京實驗室，北京 100083）

花生過敏是最嚴重的食物過敏之一。食用花生而引發的過敏因其潛在的普遍性、危險性、長期性以及不斷增加的發病率而日益受到重視[1-2]。到目前為止，已有16 種花生過敏原蛋白被國際免疫學會聯合會、變應原命名小組委員會報道并注冊[3]。過敏原分為主要食物過敏原和次要食物過敏原，對超過50%患者血清的免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）具有反應性的過敏原為主要食物過敏原，而低于50%則被視為次要食物過敏原。花生過敏原Ara h 1被認為是花生的主要過敏原，也是花生蛋白的主要組成部分[4-5]。

Ara h 1是豌豆球蛋白家族蛋白中的7S球蛋白，分子質量范圍為63～65 kDa。Ara h 1結構是由3 個具有類似于其他7S球蛋白結構特征的相同單體組成的三聚體，其核心氨基酸序列與其他7S球蛋白非常相似，熱降解溫度為88.3 ℃，略高于其他7S球蛋白的平均值（87.5 ℃）[6-8]。該序列與大豆β-球蛋白（PDB:1UIK）和小豆蛋白（PDB:2EA7）具有53%的同源性，屬于Cupin超家族[9-10]。Ara h 1具有熱穩定性和消化穩定性，并且大多數Ara h 1表位以其固有結構暴露在蛋白質表面[11-12]。

抗原表位又稱抗原決定簇，是指抗原分子表面具有特殊結構和免疫活性的氨基酸序列，且具有能刺激機體產生免疫反應的免疫活性區。根據與抗原結合的受體細胞不同，可將抗原表位分為T細胞抗原表位和B細胞抗原表位。T細胞抗原表位僅能識別由抗原提呈細胞加工后表達于細胞表面的肽段-主要組織相容性復合物，檢測方法較為復雜，相關研究多停留在預測階段[13]。B細胞表位是被抗體可變區識別的抗原的一小部分。抗體互補位通過非共價力與其對應的抗原表位相互作用。這種相互作用是高度特異性的，并且是肥大細胞或嗜堿性粒細胞表面上IgE的變應原交聯以及隨后的細胞脫顆粒的分子基礎。B細胞表位包括連續氨基酸組成的線性表位和三維基序組成的構象表位[14]。過敏原在致敏過程中，其線性B細胞表位發揮了至關重要的作用，但目前對于Ara h 1線性細胞表位的鑒定仍停留在檢測覆蓋過敏原氨基酸全序列的肽段與過敏患者血清IgE的結合強度上，工作量巨大。較準確的方法是，獲得Ara h 1特異性抗體，利用噬菌體展示技術篩選獲得結合表位肽段，但目前Ara h 1特異性抗體較難獲得[15-16]。另外，過敏原在經口攝入后，要經過胃和腸道的消化才會被小腸吸收。因此，過敏原或其主要線性B細胞表位必須具有抵抗胃腸道消化酶的性質，在經過胃腸道后能保留其相對完整或具有免疫活性能力結構[17]。據此，本研究先采用生物信息學分析花生主要過敏原Cupin超家族Ara h 1線性B細胞表位的氨基酸組成，及其與Ara h 1二級、三級結構之間關系，總結歸納線性表位存在的規律。從天然花生中提取粗蛋白，經體外模擬胃腸道消化后，利用高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）技術檢測過敏原Ara h 1保留的抗消化肽段。通過比較測定得到的抗消化肽段與預測得到的線性B細胞表位序列片段來預測更精確的Ara h 1線性B細胞表位。本研究建立的體外模擬胃腸道消化結合生物信息學鑒定Cupin超家族過敏原線性B細胞表位的方法可為低致敏性蛋白的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生（中粒，‘冀花4號’）購自北京市美廉美超市。

BCA蛋白定量試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；蛋白上樣緩沖液 北京百瑞極生物科技有限公司；標準蛋白（Marker）、辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素 美國Thermo Fisher公司；牛血清白蛋白、生物素標記山羊抗人IgE抗體、胃蛋白酶（P7000）、胰酶（P3292） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

DYY-7C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；GenoSens 1850凝交成像分析系統、ChemiScope 3300 mini化學發光成像系統 上海勤翔科學儀器有限公司；生化培養箱 寧波萊福科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花生粗蛋白提取

參考Rezende等[18]的方法提取花生粗蛋白。挑選新鮮無蟲害的花生米，去除紅衣后，粉碎過40 目篩，得花生粉末。用丙酮脫脂2 次，脫脂后的花生粉末在通風櫥中放置過夜，使丙酮充分揮發，得到脫脂花生粉末。取5 g脫脂花生粉末，加入25 mL Tris緩沖液（20 mmol/L、pH 7.2），室溫振蕩2 h后，3 000×g、4 ℃離心30 min，取上清液，將上清液10 000×g、4 ℃離心30 min，取上清液，得到粗蛋白溶液（用BCA蛋白定量試劑盒測定其蛋白質量濃度為22.36 mg/mL），貯存于-80 ℃待用。

1.3.2 體外模擬胃腸液消化

模擬胃液（stimulated gastric fluid，SGF）的配制：稱取0.175 g氯化鈉和350 mg胃蛋白酶，加入90 mL蒸餾水，用鹽酸調節pH值至1.2，加蒸餾水定容至100 mL。模擬腸液（stimulated intestinal fluid，SIF）的配制：稱取0.68 g磷酸二氫鉀溶于90 mL蒸餾水中，加入1.0 g胰酶，用1 mol/L NaOH溶液調pH值至7.5，加蒸餾水定容至100 mL。SGF和SIF均現配現用。

參考Toomer等[19]的方法進行體外模擬胃腸液消化實驗。分別取250 μL SGF、不含胃蛋白酶的SGF（對照）、SIF和不含胰酶的SIF（對照）加入至不同的離心管中，37 ℃恒溫水浴5 min，加入一定體積的粗蛋白溶液（含800 μg蛋白），迅速漩渦振蕩并快速置于37 ℃水浴鍋內，準確記錄時間，分別在反應的0 s、30 s、5 min、15 min、30 min和60 min時取出對應的離心管（對照管60 min取出），加入37.5 μL 1 mol/L碳酸氫鈉溶液，冰浴。隨后進行聚丙烯酰胺凝交電泳（sodium dodecyl sulphatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。

1.3.3 SDS-PAGE分析蛋白組成

分別制備質量分數10%的分離交和質量分數4%的濃縮交。取30 μL粗蛋白溶液，與上樣緩沖液（6×）按5∶1的體積比充分混合，100 ℃煮沸5 min，離心后上樣。首先以80 V恒壓進行電泳，待樣品指示條帶進入分離交并被壓成一條直線時，將電壓調成120 V。待樣品指示條帶遷移至凝交底部時，結束電泳。取出凝交，置于染色液中緩慢搖動染色30 min。使用脫色液脫色至凝交顯示出清晰條帶，凝交成像儀拍照，并進行灰度分析。

1.3.4 花生主要過敏原線性B細胞表位的生物信息學分析

在致敏蛋白結構數據庫（http://fermi.utmb.edu/cgibin/SDAP/）中獲取花生主要過敏原Ara h 1的23 個線性B細胞表位序列，同時確定每個表位中的關鍵氨基酸。利用Bioedit 7.0軟件對Ara h 1的線性B細胞表位中各氨基酸出現頻率進行分析。在PDB數據庫中獲取Ara h 1的二級結構和高級結構信息，使用Cn3D 4.1軟件查看線性B細胞表位在Ara h 1高級結構中的位置。

1.3.5 抗消化肽段檢測

經胃蛋白酶和胰酶消化后的樣品采用納升級HPLC-Q-Exactive-MS/MS進行檢測。流動相：A液為體積分數0.1%甲酸溶液，B液為體積分數0.1%甲酸-乙腈溶液。樣品由自動進樣器上樣到05M-4252-AC Luna?C18trap捕集柱（20 mm×3 mm，0.10 mm）進行去雜質，再經色譜柱C18柱（120 mm×1.9 mm，0.15 mm）（以體積分數95% A液平衡）分離，流速為600 nL/min。質譜條件：離子源：電噴霧離子源；采集方式：正、負離子切換采集；質譜掃描方式：一級質譜全掃描加數據依賴的二級質譜掃描（Full MS/dd MS2）。

1.4 數據處理與分析

采用ExPASy PeptideMass網站（https://web.expasy.org/peptide_mass/）預測胃腸液消化Ara h 1后獲得的肽段，用DSSP軟件分析Ara h 1的二級結構，采用SPSS 22.0軟件分析數據。

2 結果與分析

2.1 花生中主要過敏原Ara h 1線性B細胞表位的氨基酸組成特性

在致敏蛋白結構數據庫中獲取花生主要過敏原Ara h 1的23 個線性B細胞表位序列，具體如表1所示。使用Bioedit軟件分析各種氨基酸在23 個Ara h 1 線性B細胞抗原表位中的分布，結果如圖1所示，Ara h 1的線性B細胞表位由19 種氨基酸組成，構成全序列的甲硫氨酸（Met，M）沒有出現。天冬氨酸（Asp，A）、谷氨酸（Glu，E）、甘氨酸（Gly，G）、脯氨酸（Pro，P）和精氨酸（Arg，R）的出現頻率較高；親水性氨基酸和帶電氨基酸（如Glu、Arg等）在Ara h 1線性B表位出現頻率較高。

表1 花生主要過敏原Ara h 1的線性B細胞表位序列Table 1 IgE binding fragments of linear B cell epitope on peanut allergen Ara h 1

圖1 23 個Ara h 1線性B細胞表位的氨基酸組成Fig.1 Amino acid compositions of 23 Ara h 1 epitopes

2.2 花生中主要過敏原Ara h 1線性B細胞表位二級結構分析結果

為了進一步探究Ara h 1的線性B細胞表位與其二級結構之間的關系，使用DSSP二級結構分析程序計算出二級結構的分布情況。從圖2可以看出，Ara h 1線性B細胞表位的二級結構主要由α-螺旋、β-片層和β-折疊組成，具有一定的回轉折疊構象，全長包含418 個氨基酸，對應于Ara h 1中氨基酸序列的170～587位，涵蓋了10～22號線性B細胞表位。大多數線性B細胞表位各二級結構并沒有明顯的分布規律，且不同表位的二級結構相差較大，還需對其高級結構進行進一步分析。

圖2 Ara h 1的二級結構分布Fig.2 Secondary structure distribution of Ara h 1

2.3 花生中主要過敏原Ara h 1線性B細胞表位的高級結構

使用Cn3D軟件將Ara h 1的10～22號線性B細胞表位標注于Ara h 1的空間結構上，即圖3中深棕色單體的黃色區域。可以看到，大部分線性B細胞表位都位于單體之間的疏水相互作用結合區域，其結果也與線性B細胞表位的氨基酸組成分析結果一致性，即親水性氨基酸在Ara h 1線性B表位中的出現頻率較高。此外，有一部分線性B細胞表位埋入了Ara h 1三聚體的構象內部，不易被蛋白酶作用；另外，由于空間位陰效應，Ara h 1三級結構表現出B細胞表位被屏蔽，相比于那些露出甚至位于Ara h 1表面的表位，這些被屏蔽的表位可能需要經過變性后暴露出來才能發揮IgE結合活性。

圖3 線性B細胞表位在Ara h 1三聚體三級結構中的定位Fig.3 Localization of linear B cell epitopes in tertiary structures of Ara h 1 trimer

2.4 花生主要過敏原Ara h 1抗消化片段

如圖4所示，花生粗蛋白提取液在63 kDa處左右出現一條明顯條帶，其對應的是Ara h1。經不含胃蛋白酶的SGF和不含胰酶的SIF消化60 min后，其蛋白質條帶未發生明顯變化，說明提取的總花生粗蛋白在不含胃蛋白酶和胰酶的條件下具有熱穩定性。經SGF、SIF消化30 s時，花生蛋白條帶分布出現明顯變化，大分子質量的條帶變淺甚至消失，說明原樣中的蛋白都被消化成小分子片段。在經SGF消化的整個過程中一直存在一條分子質量低于15 kDa的條帶，在經SIF消化的整個過程中一直存在一條分子質量為10 kDa左右的抗消化片段。以上結果表明，花生提取物中的Ara h 1容易被胃蛋白酶和胰酶降解，但仍保留小分子片段，可能具有致敏活性。

圖4 SGF（A）和SIF（B）消化對花生蛋白質的影響Fig.4 Effect of stimulated gastric fluid (A) and stimulated intestinal fluid (B) digestion on peanut proteins

對經過SGF或SIF消化60 min后的花生蛋白消化產物進行HPLC-MS/MS檢測，鑒定出氨基酸長度超過4 個的抗消化肽段，并確定了多肽所屬的蛋白質序列。花生粗蛋白經SGF消化后，共鑒定出28 條屬于過敏原蛋白質的片段，其中有15 條與Ara h 1匹配（表2）。這15 條多肽覆蓋了Ara h 1全序列的19.38%，且主要分布于蛋白質的氨基端。經SIF消化后，共檢測出8 條屬于過敏原蛋白的肽段，其中有4 條屬于Ara h 1，覆蓋了Ara h 1全序列的6.39%（表3）。表4和表5是ExPASy PeptideMass網站對Ara h 1分別經胃蛋白酶和胰蛋白酶酶切后的預測肽段，結果只有小部分的預測肽段與實際測定的肽段完全匹配。

表2 Ara h 1抗SGF消化的肽段在Ara h 1全序列中的分布Table 2 Distribution of peptide fragments resistant to simulated gastric digestion in the Ara h 1 sequence

表3 Ara h 1抗SIF消化的肽段在Ara h 1全序列中的分布Table 3 Distribution of peptide fragments resistant to simulated intestinal fluid digestion in the Ara h 1 sequence

表4 生物信息學預測SGF消化Ara h 1后獲得的肽段Table 4 Bioinformatic prediction of the peptide fragments obtained by stimulated gastric fluid digestion of Ara h 1

表5 生物信息學預測SIF消化Ara h 1后獲得的肽段Table 5 Bioinformatic prediction of the peptide fragments obtained by simulated intestinal fluid digestion of Ara h 1

2.5 抗消化肽段及預測表位在Arah1氨基酸序列的定位

如圖5所示，在Ara h 1氨基酸序列的94～104、299～313、330～337、401～426、505～510、532～543、560～572以及574～582位置的抗消化多肽均與預測的線性表位存在部分氨基酸序列的交叉，證明了部分表位的抗消化性。經SGF消化后可以獲取比SIF消化更多的肽段信息，可能有助于鑒定更多的線性B細胞表位。

圖5 抗消化肽段及預測表位在Ara h 1氨基酸序列的定位Fig.5 Location of anti-digestive peptides and predicted epitopes in the amino acid sequence of Ara h 1

3 討 論

本研究中采用生物信息學結合HPLC-MS/MS測定抗消化肽的方法共同檢測分析Cupin超家族花生過敏原Ara h 1的線性B細胞表位。先通過過敏原結構數據庫獲取花生主要過敏原Ara h 1的線性B細胞表位序列，通過生物信息學分析軟件歸納總結表位在氨基酸組成以及高級結構分布中的存在規律。分析發現，線性B細胞表位親水性氨基酸含量較高。分析其二級結構，主要由α-螺旋、β-片層和β-折疊組成。分析其高級結構，IgE結合表位主要位于Ara h 1單體之間的疏水相互作用區域，有部分表位埋入三聚體構象內部。Ara h 1屬于Cupin超家族，具有其典型的β桶狀結構域。Cupin超家族分為7S球蛋白三聚體和11S球蛋白六聚體，研究表明，7S和11S球蛋白雖然僅約有35%～45%的氨基酸序列相近，但在三級結構上具有高度的相似性[20]。李平等分析了已經確定線性B細胞表位的Cupin家族食物過敏原，歸納出線性B細胞表位一般要具備的3 個特點：1）處于高度暴露于溶劑的區域；2）含有親水性側鏈，有利于與IgE抗體結合；3）有一定的柔韌性，便于抗原抗體的嵌合[21]。這與本實驗的分析結果一致。以上分析表明Cupin超家族的過敏原線性B細胞表位特點具有高度保守性，可將花生主要過敏原Ara h 1作為模式抗原，研究其他Cupin家族內過敏原的線性B細胞表位。

特定的食物致敏蛋白要引發過敏反應，必須在其經過加工處理或機體胃腸消化系統的作用后仍然具有抗原性。因此，目前發現的食物致敏蛋白大多具有良好的熱穩定性及消化酶抗性。這意味著過敏原經消化后生成的多肽片段仍然具有足夠數量的抗原表位[22-23]。Prodic等研究發現花生通過口腔和胃中的酶消化后，其消化后的肽保留了過敏原能力，且從Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3中鑒定出的大量抗消化短肽是連續表位序列的一部分，并具有相當大的致敏潛力，進一步證實了抗消化肽具有致敏潛力[24]。另外，花生過敏原Ara h 1的結構也可能保護其抗原表位免受消化。為了確定Ara h 1四級結構是否在保護其免受蛋白水解作用中發揮一定作用，Maleki等將Ara h 1暴露于酸性條件下室溫孵育1 h，孵育期結束時，進行Ara h 1單體之間的交聯反應，并通過SDS-PAGE分析，結果表明即使在pH 2條件下孵育后，Ara h 1寡聚體仍然是穩定的，并且仍然可以結合IgE[25]。本研究結果也表明，花生過敏原Ara h 1無論是經過SGF消化還是SIF消化，所保留的抗消化肽段都可以部分與線性B細胞表位對應，但不是完全對應。并且線性B細胞表位主要位于疏水相互作用區域，部分表位埋入三聚體構象內部。即線性B細胞表位附近存在抗消化區域。

目前對于食物過敏原線性B細胞表位的研究主要應用重疊肽段合成法，其存在效率低下、合成肽段數目眾多、盲目性較大的問題，不能對數目眾多的食物過敏原進行高通量的預測與研究[26-28]。Wolff等鑒定發現含有71 個氨基酸的肽B為β-球蛋白上IgE結合區，為了確定結合位點的氨基酸序列，合成了長度分別為20 個和10 個氨基酸殘基的重疊肽，這些肽的氨基酸序列與肽B的部分連續序列對應，通過免疫印跡法在這些重疊肽中鑒定出9 個IgE結合抗原表位[29]。另外，Pedraza-Escalona等利用克隆出的鼠單克隆抗體和3 個人類單鏈片段抗Hev b 6.02與天然橡交乳交主要過敏原Hev b 6.02結合篩選分析Hev b 6.02的B細胞表位[30]。噬菌體展示技術也被用于鑒定過敏原表位。通過噬菌體展示技術已經鑒定出樺樹過敏原Bet v 1、塵螨過敏原Der p 1和Der p 2等的抗原表位。但是噬菌體展示技術也是基于獲得特異性抗體進行表位的篩選[31-32]。以上方法主要存在工作量大以及獲得特異性抗體難度大的問題，而本研究主要將Ara h 1的生物信息學和抗消化肽段結合分析，發現花生主要過敏原Ara h 1的已知線性B細胞表位與其胃腸道抗消化肽段之間具有一定的交叉性，可以通過模擬消化后鑒定的抗消化肽段，結合氨基酸組成、高級結構分布等信息，沿過敏原全序列小范圍延伸檢測可能的線性B細胞表位。此方法可以進一步縮小表位的范圍，為檢測Cupin超家族其他過敏原的線性B細胞表位提供了參考。

4 結 論

Ara h 1的線性B細胞表位富含親水性氨基酸如精氨酸（Arg）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）以及天冬氨酸（Asp）等；分析其二級結構，Ara h 1線性B細胞表位的二級結構主要由α-螺旋、β-片層和β-折疊組成，具有一定的回轉折疊構象；對其三級結構進行分析發現，表位主要位于單體之間的疏水相互作用區域，部分表位埋入三聚體構象內部。其抗消化序列與表位之間存在部分重疊。綜上，質譜檢測體外模擬胃腸道消化肽段，并結合表位生物信息學分析，可以作為鑒定線性B細胞表位的新方法，并可為鑒定Cupin超家族過敏原線性B細胞表位和低過敏性蛋白的制備提供參考。