榆干離褶傘溶栓酶對酒精誘導大鼠肝損傷的保護作用

李芳芳，張蕊萌，叢 賀，沈明花*

（延邊大學醫學院，吉林 延吉 133000）

酒精性肝病是長期大量飲酒引起的肝臟損傷性疾病。適量的飲酒可以促進機體的新陳代謝，但長期大量飲酒會引起肝臟的損傷[1-2]、脂質代謝的紊亂及心血管意外的發生[3-4]。經消化道吸收的酒精90%以上在肝臟進行代謝[5]，因此肝臟是酒精代謝的主要器官。酒精在乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的催化作用下轉變為乙酸[6]，后者進一步被氧化成二氧化碳和水。當攝入的酒精量超過機體的代謝能力時，酒精及其代謝產物可在體內蓄積，引起肝組織的損傷[7-8]。研究表明，酒精代謝紊亂引起的氧化應激和炎癥反應是酒精性肝病的主要誘因[9-11]。因此，通過提高機體的抗氧化和抗炎能力，可以抑制或減輕酒精性肝損傷。

榆干離褶傘溶栓酶（Lyophyllum ulmariumfibrinolytic enzyme，LUFE）是從榆干離褶傘菌絲體中分離純化的分子質量為50 kDa的溶栓酶[12]，具有抗氧化[13]、抗血栓[14]和抑制血小板活化[15]等作用。前期研究結果表明，LUFE能夠通過降低細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平來抑制酒精誘導的血管內皮細胞的損傷[13]，并通過抗炎作用減輕脂多糖引起的大鼠肝組織的損傷[16]。所以推測LUFE有可能對酒精性肝損傷也具有保護作用，其目前鮮見相關的研究報道。因此，本實驗以酒精誘導大鼠肝損傷模型探討LUFE對酒精性肝損傷的保護作用，為榆干離褶傘的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LUFE由延邊大學醫學院生物化學與分子生物學教研室提供。40 只SD大鼠（生產許可證號：SCXK（吉）2017-0003；使用許可證號：SYXK（吉）2020-0010），雌雄各半，體質量180～220 g，由延邊大學動物實驗中心提供。

丙氨酸氨基轉移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、清蛋白（albumin，Alb）、γ-谷氨酰轉移酶（γ-glutamyltranspeptidase，γ-GT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽紅素（total bilirubin，T-BIL）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素6（interleukin 6，IL-6）試劑盒 南京建成生物有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-кB）p65抗體、p-NF-κB p65抗體 英國Abcam公司；抑制性-κBα（inhibitory kappa B-alpha，I-κBα）抗體 上海艾博抗體貿易有限公司；β-actin抗體 美國 Sigma公司；乙醇 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BX53F光學顯微鏡 日本OLYMPUS株式會社；RT-2100型酶標儀 深圳雷杜公司；凝交成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及處理

將40 只SD大鼠隨機分為4 組，即正常對照組、模型組、LUFE低劑量組和LUFE高劑量組，每組10 只。每日上午8時，除正常對照組以外的其余組按10 mL/kgmb灌胃體積分數40%的酒精，誘導肝損傷，正常對照組以等量生理鹽水代替。于每日下午4時，LUFE低、高劑量組分別按100 mg/kgmb和400 mg/kgmb灌胃LUFE，正常對照組和模型組以等量生理鹽水代替。連續灌胃28 d后將大鼠禁食禁水。于次日將大鼠處死，采血并取肝，用于血清學指標的檢測、肝組織形態學觀察和Western blot檢測。

1.3.2 肝組織形態觀察

取約0.2 g左右的肝組織，用體積分數10%中性福爾馬林溶液固定，將經脫水、浸臘、包埋處理后的切片進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織的形態。

1.3.3 血清學指標檢測

采用比色法檢測血清中AST、ALT、Alb、γ-GT、ALP、T-BIL、TG、T-CHO、HDL-C、LDL-C、T-AOC、SOD及MDA水平，檢測方法按照試劑盒說明書進行。血清TNF-α、IL-6水平按酶聯免疫吸附測定試劑盒說明書測定。

1.3.4 Western blot法檢測肝組織I-κBα和p-NF-κB蛋白表達水平

用RIPA裂解液處理肝勻漿液30 min，以4 000 r/min離心10 min后取上清液。將上清液用BCA法蛋白定量后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝交電泳。經電泳分離的蛋白質轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用脫脂奶粉封閉1 h后加入相應的一抗（I-κBα、NF-κB p65抗體、p-NF-κB p65抗體），在4 ℃下孵育過夜。次日洗滌、加入二抗并室溫孵育2 h，用凝交成像儀進行分析。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 LUFE對大鼠肝組織形態的影響

如圖1所示，正常對照組大鼠的肝細胞排列整齊，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞形態及結構正常。經酒精誘導以后可見肝細胞排列紊亂，肝索及肝細胞結構被破壞，大量肝細胞發生脂肪變性，部分肝細胞發生壞死等病理改變。與模型組相比，LUFE高、低劑量組肝細胞的病理損傷明顯減輕，細胞排列比較整齊，肝細胞變性、壞死灶減少，但局部仍可見變性的肝細胞。

圖1 大鼠肝組織的形態（200×）Fig.1 Morphology of liver tissues in rats (200 ×)

2.2 LUFE對大鼠血清AST、ALT活力和Alb水平的影響

AST和ALT在肝細胞受損時逸出到血液中，導致血清中其活力升高[17]，因此血清AST和ALT活力可作為肝功能檢測指標[18]。Alb主要在肝臟合成，血清中的Alb質量濃度可反映肝功能受損程度[19]。在酒精性肝損傷過程中細胞受到ROS和炎癥反應的影響，其通透性增加，引起血清ALT、AST水平升高[20]。如表1所示，與正常對照組比較，模型組的AST和ALT活力極顯著升高，而Alb質量濃度極顯著降低（P＜0.01），說明酒精引起了肝組織的損傷。與模型組相比，LUFE高劑量組AST和ALT活力極顯著降低（P＜0.01），而Alb質量濃度顯著升高（P＜0.05），提示LUFE對肝細胞有一定的保護作用。

表1 LUFE對大鼠血清AST、ALT活力和Alb質量濃度的影響Table 1 Effect of LUFE on AST and ALT activity and Alb concentration in the serum of rats

2.3 LUFE對大鼠血清γ-GT、ALP活力和T-BIL水平的影響

γ-GT活力作為診斷酒精性肝病的較敏感指標，在一定程度上可以反映肝細胞的受損程度。ALP活力是肝臟重要的酶學指標，發生酒精性肝損傷時血清中γ-GT和ALP活力明顯升高[21-22]。血紅素代謝過程中產生的膽紅素經肝臟的生物轉化作用轉變為結合膽紅素，并隨膽汁排入腸道后進一步代謝。當肝細胞損傷時肝臟的生物轉化能力下降，導致血液中膽紅素含量增多。大量研究表明，酒精所致的肝損傷中T-BIL水平顯著升高[21]。由表2可知，與正常對照組相比，經酒精誘導后模型組大鼠血清γ-GTP、ALP和T-BIL水平極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，LUFE高劑量組γ-GTP、ALP和T-BIL水平均極顯著降低（P＜0.01），說明LUFE可以抑制酒精所致的γ-GTP、ALP和T-BIL水平升高。

表2 LUFE對大鼠血清γ-GT、ALP活力和T-BIL水平的影響Table 2 Effect of LUFE on γ-GT and ALP activity and T-BIL concentration in the serum of rats

2.4 LUFE對大鼠血清TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C濃度的影響

肝臟是脂類和膽固醇代謝的主要臟器。攝入大量酒精后會伴有肝臟脂類和膽固醇代謝的異常，這也是酒精性肝損傷的早期表現之一[23-24]。由表3可知，與正常對照組比較，模型組大鼠的TG、T-CHO和LDL-C濃度顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。LUFE高、低劑量組的大鼠血清TG和T-CHO濃度極顯著低于模型組（P＜0.01），說明LUFE一定程度上抑制酒精所致的脂類和膽固醇代謝的紊亂。

表3 LUFE對大鼠TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C濃度的影響Table 3 Effect of LUFE on TG, T-CHO, LDL-C and HDL-C concentrations in the serum of rats

2.5 LUFE對大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6質量濃度的影響

酒精刺激肝臟Kupffer細胞，激活NF-κB信號通路，進而促進TNF-α、IL-6等致炎因子的表達，引起肝細胞變性、壞死和纖維增生[25]。由表4可知，與正常對照組相比，模型組大鼠TNF-α和IL-6質量濃度極顯著升高（P＜0.01），與Mandrekar等[26]的研究結果一致，說明酒精或其代謝產物可引起機體的炎癥反應。與模型組比較，LUFE高劑量組TNF-α、IL-6質量濃度極顯著降低（P＜0.01），提示LUFE具有一定的抗炎作用。

表4 LUFE對大鼠血清TNF-α和IL-6質量濃度的影響Table 4 Effect of LUFE on TNF-α and IL-6 levels in the serum of rats

2.6 LUFE對大鼠血清T-AOC、SOD活力及MDA水平的影響

大量酒精被攝入后，其代謝過程中產生的自由基會引起肝細胞的損傷[27]。體內的SOD等抗氧化酶可以清除自由基，從而減輕脂質過氧化反應。MDA作為脂質過氧化反應的產物，其含量可間接反映機體的自由基水平和脂質過氧化程度[28]。為了研究LUFE對酒精所致氧化應激反應的影響，本實驗中測定了T-AOC、SOD活力和MDA水平。如表5所示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清T-AOC、SOD水平極顯著降低，而MDA濃度極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，LUFE高劑量組T-AOC和SOD水平極顯著提高，而MDA濃度極顯著下降（P＜0.01），說明LUFE具有抗氧化作用。

表5 LUFE對大鼠血清T-AOC、SOD活力及MDA水平的影響Table 5 Effect of LUFE on total antioxidant capacity, superoxide dismutase and malondialdehyde levels in the serum of rats

2.7 LUFE對NF-κB信號通路的影響

NF-κB是一種多功能轉錄因子，參與氧化應激、炎癥等反應過程[29]。NF-κB與酒精性肝病的發生、發展關系密切[30]。為了探討LUFE的保肝作用機制，檢測了其對NF-kB信號通路中的I-κBα蛋白的表達和NF-κB磷酸化水平的影響。如圖2所示，與正常對照組相比，模型組I-κBα相對表達量極顯著降低，而NF-κB的磷酸化水平極顯著升高（P＜0.01），提示酒精可激活NF-κB信號通路。與模型組相比，LUFE高劑量組大鼠肝組織的I-κBα相對表達量顯著升高，p-NF-κB相對表達量極顯著下降，提示LUFE對酒精所致NF-κB信號通路的激活有抑制作用。

圖2 LUFE對I-κBα和p-NF-κB蛋白表達的影響Fig.2 Effect of LUFE on the expression of I-κBα and p-NF-κB in the liver of rats

3 討 論

攝入大量酒精可引起肝損傷[20,27]。為了觀察LUFE對酒精性肝損傷的保護作用，本研究以酒精灌胃的方法建立了大鼠酒精性肝損傷模型。實驗結果表明，經酒精誘導后大鼠的正常肝組織結構發生肝索排列紊亂、細胞發生脂肪變性、部分細胞壞死等病理變化。生化指標的檢測結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠血清AST、ALT、Alb、γ-TG、T-CHO水平極顯著升高，與肝臟病理形態改變結果相符。同時，模型組大鼠氧化應激指標——MDA水平和促炎因子水平極顯著升高，提示酒精性肝損傷模型建立成功。

本研究結果表明，LUFE可以減輕酒精或其代謝產物對肝臟的損傷，對酒精性肝損傷有一定的保護作用。酒精性肝損傷與酒精代謝過程中產生的ROS有關[31]。與模型組相比，LUFE能提高大鼠SOD水平，減少MDA的生成，其中LUFE高劑量組改善效果顯著，提示LUFE通過降低氧化應激水平來保護肝細胞。酒精性肝損傷除氧化應激外，還表現為炎癥反應。酒精及其代謝產物可誘導促炎因子的釋放，從而加劇肝臟的炎癥反應[32]。本實驗結果顯示，與模型組相比，高劑量LUFE能極顯著降低TNF-α、IL-6促炎因子的水平，減輕肝臟的炎性損傷，這可能與LUFE對NF-κB信號通路的調控有關。在靜息狀態下，由p50和p65二聚體組成的NF-κB在胞漿中與I-κBα結合成無活性的p50-p65-IκB三聚體形式。但在某種誘因的作用下，NF-κB信號通路中的I-κBα被磷酸化、降解，釋放p65，后者發生磷酸化并進行核轉移而被激活，促進TNF-α和IL-6等促炎因子的表達。研究表明，乙醇代謝過程中生成的乙醛可以激活I-κBα激酶，促進I-κBα的磷酸化和降解，從而上調NF-κB p65的表達[33]。本實驗中，與正常對照組相比，經酒精誘導后I-κBα的表達量降低，NF-κB p65磷酸化水平升高，這與Novitskiy等[33]的研究結相符。與模型組相比，經LUFE干預后能抑制I-κBα的降解和NF-κB p65磷酸化，提示與模型組相比，LUFE能下調NF-κB信號通路，進而抑制促炎因子的表達。本實驗結果還顯示，LUFE干預會抑制酒精所致的TG、T-CHO、T-BIL、γ-GT等生化指標水平的升高，這可能與LUFE的保肝作用有關。

綜上，LUFE對酒精所致的肝損傷有保護作用，其機制可能與抗氧化、抗炎作用有關。