解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7對采后臍橙綠霉病的防治作用及機制

閻 然，傅茂潤，陳蕾蕾，李有媛，徐敏慧,3，何志平*，周慶新,*

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，山東 濟南 250353；2.山東省農業科學院農產品研究所，山東 濟南 250100；3.諸城一中慈海學校，山東 諸城 262201；4.浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江 臨安 311300）

臍橙味甜、清香，經常食用有抗癌、養顏等功效。臍橙果實在世界范圍內廣泛種植，我國是世界上臍橙種植面積最大的國家[1]。臍橙在采后運輸以及貯藏過程中，極易受到病原微生物侵染而腐爛。指狀青霉（Penicillium digitatum）是侵染柑橘類果實而使其發生綠霉病的主要真菌[2]。此前，防治臍橙綠霉病的方式主要以化學殺菌劑為主，例如多菌靈、咪鮮胺等[3]。然而，過量使用化學殺菌劑加之其自身固有的缺點，在使用過程中易產生環境污染、人畜中毒、農藥殘留以及病菌抗藥性等一系列問題。因此，利用具有對人畜和環境安全、不受設備條件限制、操作簡單、易推廣等特點的生物拮抗劑來防治臍橙綠霉病應運而生[4-5]。

解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌具有較高親緣性的革蘭氏陽性菌，存在于自土壤、水、空氣等環境中[6]。由于其產孢量高、存活能力強、理化性質穩定，被認為是一種有潛力的生防菌[7]。國內外學者廣泛地使用解淀粉芽孢桿菌來抑制由采后病原菌所引起的侵染性病害，例如櫻桃的褐腐病[8]、蘋果的火疫病[9]、獼猴桃的灰霉病[10]。解淀粉芽孢桿菌可分泌較多高活性的抗菌物質，主要為抑菌蛋白、脂肽類、氨基酸類以及聚酮化合物等[11]。解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7是分離自姜田土壤的一株廣譜拮抗菌株，對造成采后果蔬品質劣變的多種致病真菌具有良好的抑制作用[12]。本課題組前期研究結果表明解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7對于葡萄灰霉病具有良好的抑制效果[13]。然而，其作為拮抗菌來抑制采后臍橙綠霉病的相關報道較少。本實驗主要探討NCPSJ7對臍橙果實指狀青霉的防治效果，分析臍橙體內、外的抗菌作用以及潛在抑菌機制，以期對解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7在果蔬采后病害防治中的應用提供指導意見。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臍橙為市售臍橙，解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7由山東省農業科學院農產品研究所提供；指狀青霉由中國科學院植物研究所提供；NCPSJ7的培養和保存使用牛肉膏蛋白胨培養基（nutrient broth，NB）；指狀青霉的培養、保存使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）。

愈創木酚 上海源葉生物科技有限公司；乙二胺四乙酸 上海展云化工有限公司；聚乙烯吡咯烷酮、冰醋酸、次氯酸鈉 上海麥克林生化科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海市申安醫療器械廠；SPX-250生化培養箱 浙江省托普儀器有限公司；YP電子天平 余姚市金諾天平儀器有限公司；BCD-316WGVP海信冰箱 北京市海信電器有限公司；UB100i生物顯微鏡 重慶市澳浦光電技術有限公司；HNY-200B生物搖床 天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NCPSJ7發酵原液的制備

將NCPSJ7接種在NB平板上，33.8 ℃培養24 h后，挑取單菌落接種于NB液體培養基中，在33.8 ℃、152 r/min條件下培養18 h，即得NCPSJ7發酵原液。使用血球計數板計數，使用含有0.01%（體積分數，后同）吐溫-80的無菌水稀釋得到不同菌體濃度的發酵原液。

1.3.2 指狀青霉孢子懸浮液的制備

將指狀青霉接種于PDA平板，28 ℃下恒溫培養5 d。刮取適量產孢菌絲放入裝有適量無菌水及玻璃珠的10 mL離心管中，漩渦振蕩10 s，經兩層無菌紗布過濾掉菌絲體得孢子懸浮液[14]。使用血球計數板計數，用含有0.01%吐溫-80的無菌水稀釋得到1×104CFU/mL的病原菌孢子懸浮液。

1.3.3 不同濃度NCPSJ7對指狀青霉的抑菌效果的分析

取100 μL 1×104CFU/mL孢子懸浮液加到PDA平板（直徑為90 mm）上并進行反復涂布。涂布30 min后，每個平板中央放入1 個牛津杯，分別添加200 μL呈梯度稀釋的NCPSJ7發酵原液（0、1×105、1×106、1×107、5×107、1×108CFU/mL），28 ℃下培養4 d，觀察抑菌情況并測量抑菌圈直徑。每個處理重復3 次。

1.3.4 指狀青霉孢子萌發和芽管長度的測定

將100 μL不同濃度的NCPSJ7培養液（0、1×107、2.5×107、5×107、7.5×107、1×108CFU/mL）加入到裝含有5 mL液體馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基（potato dextrose broth，PDB）的試管中，同時向試管中加入100 μL 1×104CFU/mL的指狀青霉孢子懸浮液，在25 ℃的條件下，搖床（50 r/min）培養15 h，進行顯微鏡觀察，在400 倍下用顯微測微尺測量指狀青霉孢子的芽管長度，按式（1）計算指狀青霉孢子的萌發率，每組至少觀察200 個孢子。實驗共重復3 次。

1.3.5 指狀青霉菌絲形態的觀察

參照產祝龍[15]的方法并加以改進，對指狀青霉菌絲形態進行觀察。取培養2 d的指狀青霉菌餅倒置放于PDA平板中央，繼續培養2 d后，在新長出的菌絲邊緣滴加20 μL 1.0×107CFU/mL NCPSJ7培養液，于28 ℃下培養2 d，用鋒利的薄片刀片將帶有兩種微生物的培養基切成小塊，用質量分數2.5%戊二醛溶液固定24 h后，轉移到體積分數95%的乙醇溶液中靜置12 h。然后依次在體積分數95%乙醇、乙酸異戊酯、乙醇-乙酸異戊酯（體積比為3∶1）、乙醇-乙酸異戊酯（體積比為1∶1）、乙醇-乙酸異戊酯（體積比為1∶3）和乙酸異戊酯中進行的脫水處理（每級脫水時間為15 min）。脫水完畢后，常溫下干燥5 d。將處理好的樣品塊用雙面交粘到金屬臺上，用離子濺射儀鍍金并在掃描電子顯微鏡下進行觀察拍照。

1.3.6 臍橙果實的發病率和腐爛指數測定

將96 個臍橙分為0、1×108、2×108、3×108CFU/mL組，每組4 筐，每筐6 個臍橙。用滅菌后的鋼釘在臍橙赤道位置對稱刺2 個直徑3 mm、深度3 mm的孔，室溫下放置20 min，各組分別加入20 μL無菌水和不同濃度的NCPSJ7發酵原液，室溫放置20 h后注入10 μL 104CFU/mL指狀青霉孢子懸浮液。放入用次氯酸鈉溶液處理食用筐中，聚乙烯保鮮袋密封，在25 ℃條件下貯藏6 d，按式（2）計算貯藏第4、5、6天時果實發病率，在貯藏第6天拍照觀察果實表面發病情況，采用十字交叉法測量病斑直徑并按式（3）計算果實腐爛指數。

按照果實腐爛部分占總果實的面積將果實分為0～4級，其中，0級果實未腐爛、1級果實腐爛面積比例為1%～25%、2級果實腐爛面積比例為26%～50%、3級果實腐爛面積比例為51%～75%、4級果實腐爛面積比例為76%～100%。

1.3.7 NCPSJ7在臍橙果實傷口處的生長動態

參照朱瑞瑜[16]的方法并稍作改動。用滅菌鋼釘在臍橙赤道位置對稱刺2 個直徑3 mm、深度3 mm的孔，注入20 μL 3×108CFU/mL的NCPSJ7發酵原液，室溫干燥后，放入用次氯酸鈉溶液處理的食用筐中，聚乙烯保鮮袋密封，25 ℃下持續觀察。利用血球計數板統計孔內NCPSJ7數（實驗中NCPSJ7完全滲入橙皮組織時作為0 h），連續觀察3 d。傷口內NCPSJ7的獲取方法：將1 mL無菌水分多次注入傷口內，用移液槍不斷吸打，最終獲得NCPSJ7懸浮液。每個處理由兩個臍橙組成，共3 個平行。實驗重復兩次。

1.3.8 臍橙果實相關代謝酶活力的測定

用滅菌鋼釘在臍橙赤道位置對稱刺2 個直徑3 mm、深度3 mm的孔，根據不同處理注入濃度為3×108CFU mL的NCPSJ7菌懸液和104CFU/mL指狀青霉孢子懸浮液。CK組：20 μL無菌水；指狀青霉處理組：10 μL指狀青霉孢子懸浮液；NCPSJ7和指狀青霉復合處理組：先接種20 μL NCPSJ7培養液，20 h后再注入10 μL指狀青霉孢子懸浮液。室溫干燥后，放入用次氯酸鈉溶液處理的食用筐中，在果盤中放入適量無菌水保持濕度，聚乙烯保鮮袋密封，每隔1 d取樣。CK組和復合處理組取打孔處周圍1 cm的果皮組織，而指狀青霉處理組取病斑周圍1 cm的果皮組織。不同處理取下的組織剪碎，用于臍橙酶活性、抗氧化物質含量和能力的測定。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、幾丁質酶（chitinase，CHI）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-glucanase，GLU）活力測定均參照文獻[17]。

1.3.9 臍橙果實抗氧化物質含量和抗氧化能力的測定

1.3.9.1 總酚和總黃酮

總酚的測定采用福林-酚比色法[18]，總黃酮采用分光光度法[19]。總酚含量以沒食子酸的標準曲線（y＝0.227 7x-0.248 9，R2＝0.992 7）來計算，總黃酮以蘆丁的標準曲線（y＝0.489 2x-0.462，R2＝0.993 5）來計算，單位均為mg/g。

1.3.9.2 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力和還原力1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力以及還原力的測定均參照Qu Qingli等[20]的方法，臍橙果實的DPPH自由基清除能力用DPPH自由基清除率表示，還原力用OD700nm表示。

1.4 數據處理與分析

所有數據均采用SPSS 15.0軟件和Excel 2003軟件進行分析。實驗設置3 個平行，數據用平均值±標準差表示。采用單因素方差分析中的鄧肯檢驗進行顯著性差異分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的NCPSJ7對指狀青霉的抑菌效果

在離體實驗中，不同濃度的NCPSJ7均對指狀青霉有較為明顯的抑制效果（圖1A），并且抑菌圈的直徑隨著NCPSJ7濃度的升高而顯著增加（P＜0.05）（圖1B），當NCPSJ7濃度為1×108CFU/mL時，抑菌圈直徑為3.50 cm，是1×105CFU/mL NCPSJ7處理組抑菌圈直徑（1.75 cm）的2 倍。由此可知，在一定范圍內NCPSJ7濃度越高，抑菌效果越明顯。

圖1 不同濃度的NCPSJ7對指狀青霉的抑菌活性（A）和抑菌圈直徑（B）的影響Fig.1 Effects of different concentrations of NCPSJ7 against P.digitatum: antifungal activity (A) and diameter of inhibition zones (B)

2.2 不同濃度NCPSJ7對指狀青霉孢子萌發率和芽管長度的影響

不同濃度NCPSJ7對指狀青霉孢子萌發率和芽管長度的影響如圖2所示，隨著NCPSJ7濃度的升高，指狀青霉孢子萌發率和芽管長度均明顯下降。當NCPSJ7的濃度從2.5×107CFU/mL增加至5×107CFU/mL時，指狀青霉的孢子萌發率由70%下降至24%。當NCPSJ7濃度提高至1×108CFU/mL時，指狀青霉的孢子萌發率僅為5%（圖2A）。這表明NCPSJ7能明顯抑制指狀青霉孢子的萌發率，相似地，當NCPSJ7菌液濃度為7.5×107CFU/mL時，指狀青霉的芽管長度為2.01 μm，而NCPSJ7濃度提高至1×108CFU/mL時，指狀青霉的芽管長度僅為0.6 μm，較NCPSJ7菌液濃度為7.5×107CFU/mL時減小了約70%（圖2B）。由此可見，NCPSJ7也能明顯抑制指狀青霉芽管長度的增加。

圖2 不同濃度NCPSJ7對指狀青霉孢子萌發率（A）和芽管長度（B）的影響Fig.2 Effects of different concentrations of NCPSJ7 on spore germination (A) and germ tube length (B) in P.digitatum

2.3 NCPSJ7對指狀青霉菌絲形態的影響

由圖3A可知，指狀青霉菌絲表面光滑，菌絲數量多。而加入NCPSJ7后，大量的拮抗菌附著于指狀青霉菌絲的表面，使菌絲無法正常生長，出現表面粗糙、菌絲稀疏的現象（圖3B）。

圖3 掃描電子顯微鏡下觀察NCPSJ7對指狀青霉菌絲的影響Fig.3 Effects of NCPSJ7 on the mycelium of P.digitatum under scanning electron microscope

2.4 NCPSJ7在臍橙傷口處的生長動態

如圖4所示，NCPSJ7可在24 h時快速定植在臍橙表面的傷口處，且在48 h達到峰值，之后趨于平穩。這表明NCPSJ7能較長時間存在于植物體內，對植物產生持續性保護，可更好地延長果實的貨架期。同時這也證明NCPSJ7能夠搶占指狀青霉生長所需的營養和空間。

圖4 NCPSJ7在臍橙傷口處的生長動態Fig.4 Growth curve of NCPSJ7 in wounds in oranges

2.5 不同濃度NCPSJ7和指狀青霉在臍橙上的互作效果

不同濃度NCPSJ7和指狀青霉在臍橙上的互作效果如圖5所示。與0 CFU/mL NCPSJ7組相比，不同濃度的NCPSJ7均使臍橙的發病數量和發病的嚴重程度明顯降低。并且隨著NCPSJ7濃度的不斷增加，效果更為明顯。

圖5 不同濃度NCPSJ7和指狀青霉在臍橙上的互作效果Fig.5 Inhibitory effect of different concentrations of NCPSJ7 on navel oranges inoculated with P.digitatum

2.6 不同濃度NCPSJ7對臍橙果實發病率、病斑直徑和腐爛率的影響

如圖6所示，隨著NCPSJ7濃度的增加，臍橙果實的發病率、腐爛指數以及病斑直徑均呈下降趨勢。其中當貯藏時間相同時，3×108CFU/mL NCPSJ7處理組果實發病率顯著低于其他處理組（P＜0.05）（圖6A）。這表明NCPSJ7能明顯抑制果實的發病率，且高濃度NCPSJ7效果更好。相似地，臍橙經過3×108CFU/mL NCPSJ7處理后，果實的腐爛指數和病斑直徑均顯著低于其他處理組（P＜0.05）（圖6B、C）。

圖6 不同濃度NCPSJ7對臍橙發病率（A）、腐爛指數（B）和病斑直徑（C）的影響Fig.6 Effects of different concentrations of NCPSJ7 on decay incidence (A), decay index (B) and lesion diameter (C) in orange fruit inoculated with P.digitatum

2.7 NCPSJ7對臍橙果實抗病相關酶活力的影響

如圖7A所示，臍橙在貯藏0～4 d時，復合處理處理組果實內PPO活力高于指狀青霉組和CK組，說明NCPSJ7主要在果實貯藏的前期對PPO的活性產生積極影響。如圖7B所示，臍橙果實在貯藏第1天時，復合處理處理組的POD活力為201.67 U/gmf，顯著高于CK組和指狀青霉處理組（P＜0.05）。如圖7C、D所示，復合處理組果實的CHI和GLU活性在貯藏第4天顯著高于CK組和指狀青霉處理組（P＜0.05）。

圖7 3×108 CFU/mL NCPSJ7對臍橙果實抗病相關酶活性的影響Fig.7 Effect of 3 × 108 CFU/mL NCPSJ7 on defense-related enzyme activities in inoculated navel oranges

2.8 NCPSJ7對臍橙果實抗氧化物質含量和抗氧化能力的影響

如圖8所示，隨著貯藏時間的延長，臍橙果實的抗氧化物質（總酚和總黃酮）含量和抗氧化能力（DPPH自由基清除能力和還原力）均不斷升高。從圖8A可以看出，指狀青霉單一處理組和CK組的總酚含量分別在貯藏第3天和第4天均呈現不同程度的下降，而復合處理處理組在果實貯藏至第5天時仍處于上升的狀態。在貯藏至第5天時，復合處理果實中總酚含量為1.57 mg/g，分別是對照處理（1.08 mg/g）和單一處理（1.30 mg/g）的1.45 倍和1.21 倍。果實中的總黃酮含量在不同的處理組中出現峰值的時間有所差異。指狀青霉單一處理在貯藏第3天出現峰值，而對照組和復合處理組出現峰值的時間分別為第4天和第5天（圖8B）。從圖8C、D中可以看出，在貯藏中后期（第4～6天），復合處理處理組果實中DPPH由基清除能力和還原力均顯著高于指狀青霉處理組和CK組（P＜0.05）。

圖8 3×108 CFU/mL NCPSJ7對臍橙果實抗氧化物質含量和能力的影響Fig.8 Effect of 3 × 108 CFU/mL NCPSJ7 on bioactive substance contents and antioxidant capacity in inoculated navel oranges

3 討 論

真菌病原體一旦附著于果實表皮，可通過果實自身的傷口和氣孔獲取營養，這可能刺激其孢子萌發和芽管伸長，從而造成嚴重的采后病害[21]。體外研究發現，NCPSJ7可以顯著抑制指狀青霉的孢子萌發率和芽管長度，并且對于NCPSJ7的濃度具有一定的依賴性，即抑菌效果隨NCPSJ7的濃度增大而增強，且體內外實驗結果相一致。這在Zhu Huimin等[22]的研究中得到證實，其認為高濃度的拮抗酵母Yarrowia lipolytica可以顯著抑制指狀青霉和意大利青霉孢子萌發和芽管伸長，且體內外抑制效果均直接取決于NCPSJ7的濃度。

生物拮抗過程中一種重要機制為拮抗菌通過競爭空間和營養來抑制致病菌的生長繁殖。Zhang Xuehua等[23]將Bacillus amyloliquefaciensCMN1308應用于防治板栗采后病害中，發現其對根霉、腐皮鐮刀菌、葡萄穗霉屬、青霉菌和黑曲霉等致病菌表現出了極強的空間和營養競爭現象。本實驗研究了NCPSJ7在臍橙傷口處的生長動態變化，發現NCPSJ7可在24 h快速定植在果實傷口處，48 h到達頂峰，隨后保持穩定狀態。電子顯微鏡觀察的結果表明，NCPSJ7生長較為密集的區域，指狀青霉的菌絲表面粗糙且數量較少，推測原因為NCPSJ7通過搶奪空間和營養來抑制指狀青霉的生長。

當植物受到病原菌侵染時，在啟動自我防御的早期階段會出現活性氧的爆發，導致大量過氧化氫、超氧陰離子等中間體在植物細胞積累并造成傷害。因此，植物中存在著大量的抗氧化酶以防御氧化脅迫[24]。POD、PPO可參與調節植物細胞活性氧代謝過程并使其處于動態平衡之中。此外，二者均參與宿主植物細胞的木質化過程，是引起病原菌侵染防御反應的關鍵酶。鄭香香等[25]研究發現芽孢桿菌通過在杏果實貯藏的前中期誘導PPO的POD活性增加來提高果實的抗病性，起到保鮮效果。Zhu Huimin等[22]的研究表明拮抗酵母可在柑橘果實貯藏前期和中期誘導PPO和POD活性到達峰值，其活性的升高與果實病害的下降呈正相關關系。本實驗研究也發現NCPSJ7在果實貯藏前中期可以誘導PPO活性的增加并且顯著而快速的誘導POD活性高峰的出現。CHI和GLU是植物系統獲得抗病性的標志，可水解致病菌細胞膜中幾丁質和葡聚糖，通過破壞原生質膜將其殺死[26]。且GLU和CHI會協同作用于病原微生物細胞膜的降解[27]。拮抗菌B.amyloliquefaciensMG-3接種于枇杷后可誘導產生GLU和CHI，從而提高對炭疽病菌的抗性和降低果實的發病率和褐變度[28]。與之類似的作用結果在荔枝[29]、櫻桃番茄[24]、柑橘[22]、葡萄柚[30]等果實均有報道。本實驗也發現NCPSJ7可在臍橙果實貯藏后期可協同誘導GLU和CHI的活性提高。以上結果表明果實的抗病性可通過拮抗菌誘導防御酶活性的升高來獲得。

酚類物質氧化形成的醌類物質是潛在的抗病因子，因此酚類物質具有直接抗病性[31]，同時也具有一定的抗氧化性。本研究結果表明，總酚、總黃酮的含量在果實貯藏前中期呈不斷上升的變化趨勢并且指狀青霉處理組顯著高于對照組和復合處理處理組，推測原因為指狀青霉處理組的臍橙病變程度更高，果實在高病害侵染條件下所產生的應激反應。該現象與酚類物質在病原菌入侵后含量升高并參與抵抗龍眼的擬莖點霉菌[32]、草莓的灰霉菌[33]相一致。另外，總酚、總黃酮在復合處理處理組中隨著果實貯藏時間的延長而不斷積累，從而在果實貯藏后期表現出更強大地防御病害侵染的能力。當果實遭到病原菌入侵或自身細胞衰老等因素出現時，自由基生成過多或清除能力減弱會導致細胞結構和功能遭到破壞，進而使細胞失去防御能力[34]。相比于指狀青霉單一處理和CK組，復合處理處理組的臍橙果實在貯藏中期顯著提高DPPH自由基清除能力和還原力，并且能不斷提高直至貯藏結束。這可能是由于NCPSJ7的存在能減輕指狀青霉對果實的損害，保護果實中總酚、黃酮等有機自由基清除劑，促進POD和PPO活性增強，進而使果實總體抗氧化能力得到提升。這或許也是解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7抑制綠霉病發生的機理之一。

解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7能顯著降低指狀青霉的發病率、病斑直徑和腐爛指數。NCPSJ7對指狀青霉的作用機制主要包括以下3 個方面：1）NCPSJ7可以迅速定植在臍橙傷口內部，通過競爭空間和營養來抑制指狀青霉菌絲的生長；2）NCPSJ7誘導抗性相關酶PPO、POD、CHI和GLU活性增加，從而增強果實對指狀青霉的抵抗能力；3）NCPSJ7提高了臍橙總酚、總黃酮含量以及DPPH自由基的清除能力和還原力，增加了果實的抗氧化能力以抑制臍橙綠霉病的發生。綜上，解淀粉菌NCPSJ7可作為一種有效抑制臍橙果實綠霉病的生物拮抗劑。