曲酸處理對娃娃菜采后褐變的影響

曾詩嫻，趙孝玲，左進華，閆志成，史君彥，王 清,*，崔京春，隋 媛

（1.北京市農林科學院蔬菜研究中心，農業農村部蔬菜產后處理重點實驗室，果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室，農業農村部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，農業農村部都市農業（北方）重點實驗室，北京 100097；2.大連民族大學生命科學學院，遼寧 大連 116600；3.重慶文理學院園林與生命科學學院，重慶 402160）

娃娃菜（Brassica oleraceavar.bullata），屬十字花科蕓薹屬白菜亞種，生長周期短、幫薄甜嫩、味道甘甜。娃娃菜營養價值較高，含有豐富的纖維素、維生素及微量元素，其中鈣、鉀含量是白菜的2～3 倍[1]，深受消費者喜愛。娃娃菜采后代謝旺盛，營養物質損耗快，修整加工過程會造成損傷脅迫，加速娃娃菜切莖褐變，導致其品質和商品價值降低[2]。因此，采用有效的保鮮方法抑制娃娃菜莖部褐變，對延長其貨架期及提高經濟效益具有重要意義。目前抑制娃娃菜褐變的方法主要是使用二氧化硫、亞硝酸鹽和抗壞血酸等化學抑制劑。二氧化硫能夠通過其強還原性抑制褐變，但二氧化硫會在食品中殘留，可能會誘發過敏和哮喘[3]。亞硝酸鹽主要是通過抑制酶活性來延緩褐變，但亞硝酸鹽可能具有致癌性，會破壞組織維生素，并產生惡臭味。抗壞血酸是通過自身氧化以導致缺氧條件，其在含氧量高的組織或包裝中作用不大[4]。

曲酸是一種由好氧微生物發酵產生的有機酸[5]，具有抗氧化作用，對多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性具有抑制作用[6]；相同濃度條件下，曲酸對PPO活性的抑制效果優于抗壞血酸和植酸[3]。曲酸易溶于水，并具有抗菌能力強、熱穩定性高、pH值適應范圍廣、對人體刺激性小等優點[7]。曲酸具有的獨特性質使其成為非常有潛力的果蔬保鮮劑。王擎等[8]發現用質量分數0.3%和0.5%曲酸可將馬鈴薯片與蓮藕片的貨架期分別延長2～4 d和4～6 d。曲酸可應用于防止蘋果汁褐變[9]，還可用于鮮切山藥[10]及荔枝[11]的保鮮。Yan Zhicheng等[12]發現用曲酸和CaCl2復合處理西蘭花能有效延緩西蘭花黃化和異味的產生。張婷婷等[13]發現曲酸對鮮切蘋果褐變的抑制作用優于檸檬酸和抗壞血酸，曲酸可作為鮮切蘋果的保鮮劑和護色劑。目前研究較多的是曲酸與其他物質組成的復合保鮮劑對果蔬的保鮮效果[14-16]，以及曲酸的抑菌效果[17]，鮮有曲酸抑制娃娃菜莖部褐變的研究。本實驗研究了曲酸處理對抑制娃娃菜莖部切口褐變的影響，以期為娃娃菜貯藏保鮮提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘京春娃3號’娃娃菜采摘于北京市農業發展有限公司順義農場，采收后2 h內運送至實驗室，選擇大小一致且無爛葉、無萎蔫的新鮮娃娃菜作為實驗材料。

聚乙烯（polyethylene，PE）膜（40 cm×30 cm，厚度0.03 mm） 北京華盾雪花有限公司；濃鹽酸、甲醇、乙酸、無水乙酸鈉、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、PVP-40、Triton X-100、愈創木酚 西隴化工有限公司；30%過氧化氫溶液、Na2HPO4、NaH2PO4國藥集團化學試劑有限公司；曲酸、鄰苯二酚、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、NaOH、硼酸、硼酸鈉、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、β-巰基乙醇、L-苯丙氨酸 北京科創欣達科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司；TGL-16G-A高速冷凍離心機 廣州晟龍實驗儀器有限公司；7820A氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；CR-400色度計 日本Konica Minolta公司；GXH-3052L型便攜式紅外線氣體分析器 北京均方理化科技研究所；All Basic分析研磨機 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 娃娃菜處理

去除娃娃菜莖部表層約1 mm后將其隨機平均分為2 組，每組24 袋，每袋3 顆娃娃菜。將娃娃菜莖部在超純水（對照）或0.05 g/L曲酸溶液中浸泡1 min，取出晾干水分后裝入PE袋（折口不密封），再將其于20 ℃、相對濕度90%冷庫中貯藏5 d，每天取樣測定相關指標。

1.3.2 感官評價

參照SB/T 10879—2012《大白菜流通規范》[18]以及King等[19]的方法，根據娃娃菜莖部橫切面的外觀色澤、新鮮度、顏色均勻度以及整棵娃娃菜的完整性進行評分，評分標準見表1。

表1 娃娃菜的感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of baby cabbages

1.3.3 莖部褐變指數測定

褐變指數測定參考虎云青等[20]的方法。按照娃娃菜莖部橫切面的褐變面積評級：0級，無褐變；1級，褐變面積比例≤5%；2級，5%＜褐變面積比例≤10%；3級，10%＜褐變面積比例≤30%；4級，30%＜褐變面積比例≤60%；5級，褐變面積比例＞60%。莖部褐變指數按式（1）計算。

1.3.4 莖部色澤測定

采用色差儀測定娃娃菜的L*值、a*值、b*值。選取娃娃菜莖部橫切面任意1/3面積測定，重復3 次。

1.3.5 質量損失率測定

采用差量法測定質量損失率，具體按公式（2）計算。

1.3.6 呼吸強度測定

呼吸強度采用氣流法[21]測定，將樣品從保鮮袋中取出，置入樣品所在庫中的呼吸罐，采用氣體分析儀測定呼吸罐中的CO2濃度，測定時長為30 min，每次測定結束后放回原處繼續貯藏，以備繼續測定。以每千克鮮質量樣品每小時產生的CO2質量定義為呼吸強度，單位為mg/（kg·h）。

1.3.7 乙烯釋放速率測定

乙烯釋放速率測定參照曹建康等[22]的方法。將專用于測定乙烯釋放速率的娃娃菜放于塑料筐中用保鮮膜密封1 h，用氣相微量進樣器抽取1 000 μL氣體，利用氣相色譜儀測定乙烯體積分數，并以每千克鮮質量樣品每小時釋放的乙烯體積定義為乙烯釋放速率，單位為μL/（kg·h）。

1.3.8 總酚、類黃酮含量測定

總酚、類黃酮含量采用曹建康等[22]的比色法測定。以每克樣品在280、325 nm波長處的光密度值分別表示總酚、類黃酮含量。

1.3.9 丙二醛含量測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法[22]。切取1 cm厚的娃娃菜莖部作為樣品，并用分析研磨機將樣品磨成粉末。取磨樣后的娃娃菜組織1 g，準確量取5 mL 100 g/L的三氯乙酸與娃娃菜樣品均勻混合，然后4 ℃、13 000×g離心20 min，將2 mL上清液與2 mL 5 g/L的硫代巴比妥酸混合煮沸30 min，冷卻后測定混合液于450、532 nm和600 nm波長處的吸光度，實驗重復3 次。

1.3.10 苯丙氨酸解氨酶活力測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalamine ammonia lyase，PAL）活力測定參考靜瑋等[23]的方法，取1.3.9節中研磨后的樣品1.0 g與5.0 mL 0.1 mol/L pH 8.8的硼酸-硼砂緩沖液（每100 mL含3 g PVP、0.037 g乙二胺四乙酸鈉鹽和0.137 mLβ-巰基乙醇，下同）混合，4 ℃、15 000 r/min離心15 min，上清液即為粗酶液。反應體系包括0.1 mL粗酶液、3.9 mL硼酸-硼砂緩沖液和1.0 mL 0.6 mmol/LL-苯丙氨酸溶液，對照以0.1 mL蒸餾水代替0.1 mL粗酶液。將反應液置于37 ℃恒溫水浴中保溫1 h后測定290 nm波長處的吸光度，以吸光度每小時變化0.01所需酶量為1 個PAL活力單位（U），結果以組織鮮質量計，單位為U/g。

1.3.11 PPO、過氧化物酶、過氧化氫酶活力測定

PPO、過氧化物酶（peroxidase，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活力的測定均參考曹建康等[22]的方法。

1.4 數據處理與分析

采用Origin 8.5軟件作圖，實驗結果取3 次測定平均值，利用SPSS 19.0軟件對數據進行差異顯著性檢驗（Duncan法）及皮爾遜相關性分析，P＜0.05、P＜0.01分別表示差異顯著、極顯著。使用HemI軟件制作熱圖。

2 結果與分析

2.1 曲酸處理對娃娃菜外觀品質的影響

感官評分能直觀體現娃娃菜的商品價值。由圖1A可知，娃娃菜的感官評分在整個貯藏期間呈下降趨勢，其中曲酸處理組感官評分一直高于對照組，且2 d后組間呈極顯著差異（P＜0.01）。由此表明，曲酸處理可明顯提高娃娃菜的外觀品質。由圖1B可知，娃娃菜的褐變指數在整個貯藏期間呈上升趨勢。曲酸處理組的褐變指數在3～5 d顯著低于對照組（P＜0.05）。說明0.05 g/L曲酸處理能有效抑制娃娃菜在貯藏后期的切莖褐變。

圖1 曲酸處理對娃娃菜感官評分（A）和褐變指數（B）的影響Fig.1 Effect of kojic acid treatment on sensory evaluation (A) and browning index (B) of baby cabbages

2.2 曲酸處理對娃娃菜色澤的影響

L*值表示亮度，L*值越接近100，表示樣品越亮。由圖2A可知，在整個貯藏期間，曲酸處理組的L*值明顯高于對照組，且2 d后存在顯著差異（P＜0.05），表明0.05 g/L曲酸處理組娃娃菜的莖部亮度更高。a*值代表紅綠度，正值代表紅色，負值代表綠色。如圖2B所示，兩組娃娃菜莖部在貯藏過程中的a*值均呈上升趨勢，在2 d后曲酸處理組a*值開始明顯低于對照組，從第3天開始存在顯著差異（P＜0.05）。b*值代表藍黃度，正值為黃色，負值為藍色。在本實驗中，b*值越大，表示娃娃菜莖部切口褐變程度越深。由圖2C可知，從第1天開始，曲酸處理組b*值顯著低于對照組（P＜0.05），與貯藏0 d相比，曲酸處理組和對照組在貯藏第5天時b*值分別增加了34%、43%。

圖2 曲酸處理對娃娃菜L*值（A）、a*值（B）、b*值（C）的影響Fig.2 Effect of kojic acid treatment on L*(A), a*(B) and b*(C) values of baby cabbages

以上結果說明0.05 g/L曲酸處理的娃娃菜莖部切口顏色變化比對照組小，褐變程度更低，與感官評分和褐變指數結果一致。

2.3 曲酸處理對娃娃菜質量損失率的影響

質量損失率常作為果蔬保鮮的一項重要考核指標[24]。由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，娃娃菜的質量損失率逐漸增加，且曲酸處理組的質量損失率極顯著低于對照組（P＜0.01）。可能是曲酸處理能抑制娃娃菜貯藏期間的蒸騰作用和呼吸作用，減少水分流失。

圖3 曲酸處理對娃娃菜質量損失率的影響Fig.3 Effect of kojic acid treatment on mass loss percentage of baby cabbages

2.4 曲酸處理對娃娃菜呼吸強度和乙烯釋放速率的影響

呼吸消耗是果蔬采后貯藏過程中質量損耗和新鮮度下降的主要原因之一。如圖4A所示，在貯藏期間，兩組娃娃菜呼吸強度總體均呈先上升再下降的趨勢，對照組和曲酸處理組娃娃菜的呼吸強度均在貯藏的第1天達到最高峰，分別為182.56 mg/（kg·h）和155.45 mg/（kg·h）。在貯藏前3 d，曲酸處理組呼吸強度極顯著低于對照組（P＜0.01）。說明曲酸處理對娃娃菜的呼吸有抑制作用。

圖4 曲酸處理對娃娃菜呼吸強度（A）和乙烯釋放速率（B）的影響Fig.4 Effect of kojic acid treatment on respiration intensity (A) and ethylene release rate (B) of baby cabbages

乙烯是果蔬自身生成的內源激素，能催化果實成熟，加速果實衰老；且乙烯釋放速率越高，衰老程度越嚴重[25]。如圖4B所示，對照組娃娃菜乙烯釋放速率在前3 d處于上升趨勢，在第3天達到最大值，為0.108 1 μL/（kg·h），隨后下降，第5天時為0.084 8 μL/（kg·h）。而曲酸處理組娃娃菜乙烯釋放速率在前2 d處于上升趨勢，第2天達到最大值，為0.100 8 μL/（kg·h），隨后下降，第5天時為0.077 7 μL/（kg·h）。對照組的乙烯釋放速率最大值高于曲酸處理組，且在貯藏第3～5天，曲酸處理組的乙烯釋放速率顯著低于對照組。

2.5 曲酸處理對娃娃菜總酚和類黃酮含量的影響

娃娃菜莖部受到機械傷后產生大量活性氧，導致細胞結構被破壞，從而加速酶促反應[26]。酚類化合物和PPO接觸后被氧化形成醌類物質，醌再進一步合成黑褐色物質，從而引起褐變[27-29]。不同果蔬中酚類物質的含量和種類差異較大，且在褐變過程中起主要作用的酚類物質各不相同。譚興杰等[30]發現荔枝皮中含有6 種酚類化合物，其中只有一種是PPO作用底物，PPO對其他酚類物質未表現出氧化活性。如圖5A所示，曲酸處理組的總酚含量在第3天達到最大值，隨后逐漸下降。而對照組的總酚含量從第1天開始逐漸上升，在第5天超過曲酸處理組。在貯藏的前4 d，曲酸處理組的總酚含量明顯高于對照組，且在第2～4天有顯著性差異（P＜0.05、P＜0.01）。雖然曲酸處理組的總酚含量高于對照組，但是褐變程度卻低于對照組，可能是因為總酚含量升高，但娃娃菜褐變被抑制，而PPO作用的底物含量沒有升高。

圖5 曲酸處理對娃娃菜總酚含量（A）和類黃酮含量（B）的影響Fig.5 Effect of kojic acid treatment on total phenol (A) and flavonoid (B)contents of baby cabbages

如圖5B所示，在整個貯藏期中，曲酸處理組和對照組類黃酮含量總體均呈上升趨勢，但曲酸處理組的類黃酮含量極顯著高于對照組（P＜0.01）。曲酸處理組的類黃酮含量高于對照組，但是褐變程度卻低于對照組，可能是因為類黃酮不是PPO作用的底物。

2.6 曲酸處理對娃娃菜MDA含量的影響

果蔬中膜系統的損傷是導致酶促褐變發生的一個重要條件。MDA是膜脂過氧化的主要副產物，其含量通常作為反映脂質過氧化程度的指標[31-32]。如圖6所示，曲酸處理組和對照組的MDA含量呈波動變化。在貯藏的前3 d，曲酸處理組MDA含量低于對照組。貯藏結束時，對照組MDA含量為2.25 μmol/g，比此時曲酸處理組MDA含量高32.3%。

圖6 曲酸處理對娃娃菜MDA含量的影響Fig.6 Effect of kojic acid treatment on MDA content of baby cabbages

2.7 曲酸處理對娃娃菜PAL活力的影響

PAL是植物次生代謝物質木質素、酚類等生物合成途徑中的關鍵酶，切割損傷可誘導PAL活性升高[33]。如圖7所示，曲酸處理的娃娃菜在貯藏期內PAL活力高于對照組，在第1、4、5天存在極顯著差異（P＜0.01）。第5天曲酸處理組PAL活力比對照組高1.0%。

圖7 曲酸處理對娃娃菜PAL活力的影響Fig.7 Effect of kojic acid treatment on PAL activity of baby cabbages

2.8 曲酸處理對娃娃菜PPO和POD活力的影響

PPO是果蔬發生酶促褐變的重要酶類，它能夠氧化酚類成醌，引起果實褐變[34]。如圖8A所示，在貯藏期內，兩組的PPO活力均呈上升趨勢，且曲酸處理組的PPO活力極顯著低于對照組（P＜0.01）。POD在果蔬的貯藏過程中會引起其緩慢褐變[35]。如圖8B所示，在貯藏的前4 d，曲酸處理組的POD活力上升并達到最大值（36.80 U/g），之后下降。而對照組POD活力在貯藏的0～2 d上升，2～3 d下降，3～5 d上升，且在第5天達到最大值（45.31 U/g）。在整個貯藏過程中，曲酸處理組POD活力明顯低于對照組。貯藏結束時曲酸處理組PPO、POD活力比對照組分別低28.5%和29.7%。以上結果說明曲酸處理可顯著抑制PPO、POD活性。

圖8 曲酸處理對娃娃菜PPO（A）和POD（B）活力的影響Fig.8 Effect of kojic acid treatment on PPO (A) and POD (B) activity of baby cabbages

2.9 曲酸處理對娃娃菜CAT活力的影響

CAT是最主要的活性氧清除劑，它能將代謝產生的H2O2分解成氧氣和水[36]，維持活性氧代謝平衡[21]。從圖9可以看出，在整個貯藏期間，曲酸處理組的CAT活力始終高于對照組，除第2天外，其他時間點均存在極顯著差異（P＜0.01）。第5天CAT處理組活力比對照組高12.4%。由此可知，曲酸處理能提高娃娃菜中CAT的活力，抑制H2O2對組織造成的氧化損傷，從而延緩娃娃菜莖部切口的褐變。

圖9 曲酸處理對娃娃菜CAT活力的影響Fig.9 Effect of kojic acid treatment on CAT activity of baby cabbages

2.10 曲酸處理后娃娃菜各生理生化指標間相關性分析結果

由圖10可知，褐變指數與呼吸強度、MDA含量、類黃酮含量、PAL活力和CAT活力呈正相關，但相關性不顯著，與乙烯釋放速率、總酚含量呈顯著正相關（P＜0.05），與質量損失率、a*值、b*值、PPO活力和POD活力呈極顯著正相關（P＜0.01），與L*值呈極顯著負相關（P＜0.01），與感官評分呈極顯著負相關（P＜0.01）。

圖10 曲酸處理后娃娃菜各生理生化指標皮爾遜相關性矩陣Fig.10 Pearson correlation coefficient matrix among physiological and biochemical indicators of baby cabbages treated with kojic acid

3 討 論

娃娃菜味道清甜、口感脆嫩，且含有豐富的營養成分，能夠預防各種疾病。娃娃菜在采后修整加工過程中莖部受到機械損傷，導致娃娃菜莖部切口快速褐變，進一步導致娃娃菜的軟化和腐爛，最終失去其原有感官及商品價值，且其呼吸作用和蒸騰作用等生理活動加劇會引起水分和營養物質的流失。因此需要尋找一種安全有效的保鮮方法。

已有研究發現，2.5%曲酸處理可有效減少鮮切西藍花貯藏期間的水分流失，延緩可滴定酸、VC和葉綠素含量的下降，顯著提高鮮切西藍花的貯藏品質[37]。0.5%和1%曲酸通過在油菜表面形成保護膜起到抑制葉綠素降解的作用，同時可以減緩蒸騰失水，延緩葉綠素的降解，從而延緩油菜黃化[38]。

本研究發現，與對照相比，0.05 g/L曲酸溶液處理可以有效降低娃娃菜采后呼吸速率和乙烯釋放速率；且曲酸處理能有效抑制PPO和POD活力，延緩娃娃菜莖部切口褐變的發生。其主要原因可能是曲酸結構與酚類底物結構相似，可與PPO發揮活性所需的銅離子螯合，從而抑制黑色素的形成[39]。曲酸處理后娃娃菜總酚含量較高，可能是因為PPO對娃娃菜中所含的酚類物質不表現出活性，也可能是由于曲酸處理抑制了POD和PPO活力，延緩了酚類物質的氧化，減少了酚類向醌類物質的轉化。0.05 g/L曲酸溶液還能有效提高抗氧化酶PAL和CAT活力，使得細胞內大量活性氧被及時清除，防止膜過氧化、功能結構被破壞，維持細胞內部的動態平衡，使娃娃菜具有更好的貯藏品質，延長其貯藏時間。

綜上，使用0.05 g/L曲酸溶液處理娃娃菜莖部切口，可有效保持娃娃菜的感官品質，抑制莖部切口褐變，降低質量損失率、呼吸強度和乙烯釋放速率，并減少MDA含量，提高類黃酮及總酚含量；還能降低娃娃菜的POD、PPO活力，提高PAL、CAT活力。因此，0.05 g/L曲酸處理能夠有效抑制娃娃菜莖部褐變，增強娃娃菜的抗氧化能力，延長娃娃菜的貨架期。