茶葉中吡咯里西啶生物堿檢測技術、污染水平及健康風險研究進展

韓浩蕾，姜長嶺，王 晨，劉 新，魯成銀，陳紅平,*

（1.中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081；3.農業農村部茶葉產品質量安全風險評估實驗室，浙江 杭州 310008）

茶是世界上最受歡迎的無酒精飲料之一，茶葉具有田間生長周期長、加工過程復雜、貯存時間長等特點，易受到農業投入品、生物毒素、環境污染物、重金屬等有毒物質的污染[1]，這些有害物質已成為茶葉質量安全潛在危害因子。茶葉中有害物質污染途徑主要來源于種植與加工階段（圖1）。其中種植階段產地環境產生的污染物可經大氣沉降、土壤吸收以及隨水傳播等途徑，造成茶葉（葉片、根系）被有害物質如高氯酸鹽、多環芳烴等環境污染物[1-2]污染，產地和周邊環境中的農藥殘留（甲胺磷、乙酰甲胺磷等）[3]以及工業排放、金屬礦山開采等活動形成的重金屬，均會在大氣、土壤、水和植物之間相互擴散后，隨著空氣沉降、土壤吸收以及污水灌溉造成茶葉污染[4-5]。近些年環境中的植物毒素、真菌毒素等污染物及其污染茶葉途徑也廣受關注[6]。

圖1 茶葉種植加工階段有害物質污染途徑Fig.1 Pathways of harmful substance pollution in tea planting and processing

吡咯里西啶生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是植物的次級代謝產物，主要分布于遠緣相關的被子植物科，涉及菊科、紫草科和豆科等13 個科，通常集中在植物的種子和開花部位，其葉、莖和根中的含量較低。不同植物種類中PAs的質量分數相差較大，從痕量到高達19%（以干質量計）[7-8]。PAs具有化學防衛的功能，在一定程度上可抵御草食動物、昆蟲和植物病原對植物的侵害。一些含PAs的植物常被用作地被植物、土壤改良劑（豆科）、觀賞植物和動物飼料。目前已經在超過6 000 種植物（可能占所有開花植物的3%～5%）中鑒定出660多種PAs及其氮氧化物（pyrrolizidine alkaloidN-oxides，PANOs）[9-10]。

PAs是一類植物毒素，茶葉本不含有PAs，因茶園存在含PAs的植物（如一點紅、千里光等），其種植階段可能通過土壤、水等間接污染茶葉。前期研究證明茶園中的雜草——千里光屬植物根部PAs會污染土壤，博士茶根系會吸收PAs而受到污染[6,11]；茶葉采摘和加工階段可能混入含PAs的植物而形成污染。目前，在奧地利、德國、比利時等許多歐洲國家已經對茶葉中PAs或PANOs的污染起源與途徑進行了大量的研究，建立了較為完善的茶葉檢測與監督體系[7]，同時將茶葉PAs含量列為出口到其他歐盟國家的重點關注參數，PAs成為近年來我國茶葉出口受陰的主要污染物之一。然而，我國目前針對茶葉中PAs的研究相對較少，缺乏茶葉中PAs污染水平基礎數據，無法獲得茶葉中PAs污染來源，導致我國對茶葉PAs管控處于極度被動狀態。

1 PAs的化學結構與毒性

PAs化學結構一般由千里光次堿和千里光次酸兩個基本部分組成（圖2）。千里光次堿的吡咯環結構為PAs的母核，由兩個稠合的含氮五元環狀結構組成，該部分可被雜酸酯化形成單酯、開鏈雙酯或大環雙酯，當C2、C6或C7上帶有一個或兩個羥基時，可導致其形成立體異構體[9]。當千里光次堿中N被氧化時，可形成相應PANOs，與PAs同時存在于植物體內[8,12]。PAs在植物體內合成的相關研究有限，到目前為止，僅一種與PAs生物合成有關的酶被表征，即高精胺合酶，其參與催化PAs生物合成的第一步[13]，隨后經過氧化、環化、還原、酰化等一系列反應，先生成初級產物PANOs，繼而合成相應PAs。圖3為千里光寧堿的生物合成過程[8,13]。

圖2 不同PAs及吡咯代謝物化學結構Fig.2 Chemical structures of PAs and pyrrole metabolites

圖3 PAs合成途徑[8]Fig.3 PAs synthesis pathway[8]

根據千里光次堿在1、2位碳原子之間形成的鍵是否飽和，可將PAs分為飽和PAs和不飽和PAs兩大類，飽和PAs一般無毒或毒性弱，而不飽和型PAs因其毒性和致病性成為關注熱點[9-11]。不飽和PAs被CYP 3A氧化成烯丙醇酯結構的吡咯代謝物（圖4）后會引起肝毒害作用[8,14]。20世紀30年代，PAs引發人類肝中毒的暴發性案例導致PAs的肝毒性受到世界各地的廣泛關注。PAs除具有肝毒性外，還有研究表明部分PAs具有肺毒性、致癌性、遺傳毒性及致畸胎作用等多種毒性[15-17]。除此之外，最新研究表明PANOs亦可產生毒性[18]。人體主要通過攝入含PAs的食品而引起健康風險[19]。因此，研究食品中的PAs類物質的污染水平及來源，并對其進行合理監測以及風險評估對于保障食品安全具有極其重要的作用。

圖4 PAs的代謝活化[14]Fig.4 Metabolic activation of PAs[14]

2 茶葉中的PAs檢測技術

復雜基質中的PAs檢測技術從常量定性分析向痕量殘留定量分析的方向發展，植物源樣品中PAs檢測經歷了分光光度法[20]、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）法[21]、免疫學方法[22]等定性定量分析方法，逐漸發展到高靈敏色譜法和色譜-質譜聯用（包括液相色譜串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）與氣相色譜串聯質譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS））精準分析技術[10]。分光光度法中的比色檢測僅能針對PAs進行總量分析，無法量化單一PA，且對復雜基質中PAs的痕量分析缺乏敏感性和選擇性[9-10,23]。NMR法主要用于PAs的結構鑒定，具有快速、精密度好的特點，但NMR靈敏度較差，難以進行痕量分析[10,21]。免疫學檢測過程中，PAs通過共價結合與蛋白質快速反應，形成吡咯-蛋白質加合物，可以快速、靈敏地檢測復雜基質中的分析物，更多用于PAs毒理方面的研究[22]，但其缺點是僅對與千里次光堿結構密切相關的PAs（如十二元大環酯，但沒有烯酮、開鏈酯或十一元或十三元大環PAs）敏感，難以適用于所有PAs檢測，且容易受到復雜基質干擾[7,10]。目前，色譜與質譜聯用技術在PAs分析中選擇性好、靈敏度高，且適用于同時檢測多種PAs，因而廣泛用于農產品或食品中PAs的定性定量分析[7,9]。表1總結了近年來色譜-質譜檢測技術在茶葉中PAs檢測的應用，可以看出，在分析手段方面，相較于GC-MS/MS，LC-MS/MS依舊是目前PAs檢測方法中最主流的檢測手段；在前處理技術上，固相萃取（solid phase extraction，SPE）是最常用的凈化處理方式。

表1 茶葉PAs檢測前處理方法及檢測技術Table 1 Pretreatment methods and analytical techniques for the detection of PAs in tea samples

2.1 前處理技術

PAs是含有特征性堿性氮的還原性生物堿，通常使用半極性或極性有機溶劑或在酸化水條件下萃取PA，其氧化形式（PANOs）屬于極性分子，容易被極性溶劑（例如甲醇）或稀酸溶液萃取[30]。茶葉中PA前處理技術主要包括液液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE）、SPE以及SLE（表1），也可開發常用前處理方法如QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe）法以及新型前處理方法如分散液-液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）法等對茶葉進行提取及凈化。

2.1.1 液液萃取

LLE是一種傳統分離PAs的方法，其基于相似相溶原理，根據目標分析物在液相之間的溶解度差異進行分離[31]。PAs分離過程首先將提取液酸化，生物堿將以離子的形式存在于水相中，為除去葉綠素和其他弱極性物質，用乙醚、氯仿等有機溶劑萃取，再將水層堿化，釋放生物堿，再用相同或相似的有機溶劑（氯仿、二氯甲烷）萃取達到分離純化的目的[23]。但LLE操作過程繁瑣，不能同時分離純化PAs及PANOs，且因極易出現乳化現象，PAs損失較多，不符合對PAs進行痕量分析的要求。該方法目前已經使用極少，逐漸被SPE所取代[23,32]。

2.1.2 固相萃取

SPE是被廣泛用于提取包括農藥化合物在內的污染物的前處理方法。SPE基于吸附劑與分析物之間的相互作用將分析物吸附到固體吸附劑上，在去除雜質的同時，實現樣品的富集凈化，具有溶劑用量少、高效、快速的特點，是目前使用最廣泛的純化PAs的方法。其純化步驟通常為首先活化SPE柱，上樣后分別采用甲醇和去離子水淋洗，最后利用堿性溶液（如含有氨水的甲醇溶液）進行洗脫。常用的SPE柱有C8柱、C18柱、陽離子交換色譜柱（solid phase extraction column，SCX），其中SCX-SPE柱的使用可以有效去除弱極性與離子型極性干擾物質，同時滿足PAs和PANOs回收率要求[7,32]。Kaltner等[24]利用SPE技術建立了一種定性定量茶葉中4 種PAs/PANOs的方法，比較了6 種不同型號SPE柱（Bekolut SCX、Discovery DSC-18、Chromabond SA、Strata-X-C、Bond Elut SCX、Bond Elut Plexa PCX）的凈化效果，結果發現Bond Elut Plexa PCX柱效果最佳，對茶葉中36 種PAs的回收率達到60%～120%。

Chung等[27]對食品（包括谷類食品、乳制品、肉、蛋、蜂蜜、茶浸液和香料）中的15 種PAs和13 種PANOs進行檢測。前處理方法采用C18柱SPE凈化、水/乙腈淋洗去除復雜基質后，用甲醇洗脫大部分PAs/PANOs，奧索千里光裂堿型PAs因需要在堿性介質中才能完全洗脫，用體積分數2.5%氫氧化銨-甲醇溶液洗脫，最后混合洗脫液提取全部目標PAs/PANOs。所有食品PAs和PANOs的回收率為50%～120%，茶浸提液中回收率達77%～116%。該方法成功地將SPE技術應用于復雜基質中的多種PAs痕量檢測，為建立食品中多種PAs痕量分析方法提供了重要支撐。

SPE方法作為使用最普遍的前處理技術，可在其基礎上進一步優化凈化過程中影響清潔效果的參數，如溶劑組成、吸附劑、流量等，或是以串聯SPE柱的方式來提高凈化效果。

2.1.3 QuEChERS法

QuEChERS法是2003年美國Anastassiades等[33]提出的一種農產品農殘檢測的前處理方法，發展迅速，已成為目前色譜及色譜質譜分析前處理應用最廣的前處理技術之一。QuEChERS法將提取與純化同步進行，其核心是采用分散固相吸附劑去除干擾物質，具有操作簡單、快速、環境友好、兼容性強的優點，且適用于高通量檢測與樣品前處理，因而在對植物源農產品農藥殘留、PAs等痕量分析中得到廣泛應用[31]。

Martinello等[34]采用QuEChERS方法建立了一種簡便快速定量檢測蜂蜜中PAs的方法。該QuEChERS方法采用10 mL乙腈和QuEChERS EN方法（檸檬酸鈉1 g、檸檬酸氫二鈉倍半水合物0.5 g、硫酸鎂4 g和氯化鈉1 g）進行提取凈化，再結合適量的N-丙基乙二胺鍵合硅交（primary secondary amine，PSA）、硫酸鎂和碳進行吸附凈化，離心過濾后結合UPLC-MS/MS檢測，結果的檢出限為0.21～1.39 mg/kg，回收率為73%～109%。Kaczyński等[35]采用一種超聲輔助QuEChERS方法提取和純化草藥中PAs，該研究表明使用PSA、C18、石墨化炭黑和MgSO4吸附劑會降低PAs回收率，可能是吸附了具有弱酸性的PAs所致，而將石墨烯用作吸附劑時，可以獲得好的凈化效果，且不會影響其回收率。

茶葉作為復雜的基質，目前鮮見其相關的QuEChERS前處理方法，但QuEChERS作為使用廣泛的前處理技術，靈活性高、適用性強，可通過對不同吸附劑的組合、提取溶劑的選擇等進行優化[31,36]，形成高效的改進QuEChERS方法，以對茶葉中PAs進行檢測。

2.1.4 其他方法

基于LLE和SPE的新型技術如DLLME、SLE被應用到PAs分析前處理中。DLLME是一種功能強大的預濃縮技術，具有操作簡單、成本低、萃取時間短、富集因子高、有機溶劑消耗適中等眾多優點[37]。Celano等[38]利用DLLME結合UPLC-MS/MS檢測蜂蜜中PAs，相比于應用SPE和QuEChERS，提高了PAs的富集效果；再與UPLC-MS/MS結合，得到了更低的檢出限（0.01～0.02 μg/kg），回收率為71%～102%。DLLME具有綠色環保的優點，且可通過結合其他技術進一步提高方法的準確度。因此，該技術可被逐漸應用到茶葉、草藥等復雜基質多種PAs痕量分析中。

SLE是對目標物質進行固相表面支撐的LLE，相對于SPE，有不需要進行調節、平衡或者沖洗SPE柱等優勢，可縮短處理時間。Mathon等[25]使用SLE結合HPLC-MS/MS檢測茶葉和草藥茶中的PAs和PANOs，得到的定量限為0.1～0.5 μg/kg，回收率為91%～114%。該方法雖然成功應用于茶葉和草藥茶中PAs和PANOs的檢測，但這種方法不可直接用于不可電離的PAs如千里光寧堿氮氧化物，因此對于同時檢測多種PAs方法的建立具有一定局限性。

隨著前處理技術的不斷發展，目前一些新型前處理技術不斷應用于生物堿的檢測分析[32]，如固相微萃取[39]、分子印跡法[40]等。新型前處理技術具有去除干擾能力強、靈敏度高與環保等特點，有望應用于茶葉等復雜基質中PAs的分離純化，提高檢測方法的抗干擾能力和靈敏度，且新型的前處理技術未來將可能成為多種PAs痕量分析的主要趨勢。

2.2 PAs分析技術

2.2.1 氣相色譜和氣相色譜-質譜聯用

GC-MS分析PAs的方法最早于20世紀90年代開發并應用于天然來源物質（植物和昆蟲）的PAs檢測[41]。游離PAs通過GC進行分離，并使用不同的固定相根據相對保留時間進行鑒定，這種方法適用于除奧索千里光裂堿型以外的大多數PAs。由于PANOs在GC揮發溫度下不易揮發，不適合用此方法鑒定，因此可先通過化學轉化如使用Zn+/H+將PANOs還原為游離PAs進行檢測[9-10,30,42]。GC-MS通常用電子轟擊電離（electron ionization，EI），PAs經EI源轟擊后產生碎片離子，通過選擇離子監測（selected ion monitoring，SIM）和全掃描模式，定性定量分析復雜基質中的PAs[41]。由于多羥基PAs在GC條件下難揮發，不能直接采用GC和GC-MS進行分析，因此需采用衍生化的方法將多羥基PAs衍生產生揮發性產物，通過PAs與衍生物之間的量化關系定量分析PAs。多羥基PAs常用衍生試劑是鄰二醇的硼酸衍生物或三甲基硅醚或二者的組合[9,42-43]。

Kempf等[42]提出一種采用GC-MS法檢測蜂蜜基質大多數1,2-不飽和PAs的方法。該方法通過酸性液體萃取，用鋅粉將PANOs還原為游離PAs，經過SPE凈化后，使用LiAlH4將1,2-不飽和PAs還原以產生共同的骨架結構（千里次光堿結構），再用N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺（N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide，MSTFA）進行衍生化反應（圖5），最后通過GC-MS在SIM模式下分析所得的衍生物。這種方法通過還原和衍生化將所有不飽和PAs轉化為同一種類型化合物（倒千里光裂解型），結果用單一的總和參數表示，結果的定量限為0.01 mg/L。該方法后來也同樣適用于許多基質，如蜂蜜、花粉和植物等[10,44]。Kowalczyk等[45]基于上述前處理技術使用七氟丁酸酐作為衍生化試劑，結合GC-MS法檢測蜂蜜中1,2-不飽和PAs含量，結果回收率為73.1%～93.6%，定量限為1 μg/kg。

圖5 千里光裂堿還原及衍生化反應[42]Fig.5 Reduction and derivatization of senecionine[42]

衍生化過程用于GC-MS法分析PAs雖有提高靈敏度的優勢，但過程繁瑣、耗時長；且GC-MS法分析PAs存在穩定性差、檢出限高等缺陷，目前PAs分析較少使用GC及GC-MS，LC及LC-MS是PAs的主要分析手段（表1）。

2.2.2 液相色譜、液相色譜串聯質譜和液相色譜-高分辨質譜

LC與LC-MS方法不僅可以同時檢測PAs和PANOs，且具有靈敏度高、檢測限低、適用范圍廣、重復性好、操作方便、前處理簡單等優點，是目前使用最廣泛的方法[30,44]。游離堿PAs包括中等極性與極性化合物，而PANOs為極性化合物，因此LC柱固定相應選擇極性較小的鍵合固定相，如C18、C8反相色譜柱；流動相系統常選用甲醇/水系統和乙腈/水系統，并使用酸或堿作為水性洗脫液的改性劑來提高分離度[7,9]。PAs因存在多個立體異構體（如印美定/石松胺）導致色譜峰分離度較差，可選用分離度更高的色譜柱改善，如HPLC色譜柱、UPLC色譜柱[46]。

LC-MS/MS中電離源的電離方式通常采用ESI或大氣壓化學電離（atmospheric pressure chemical ion source，APCI）兩種技術[30]。其中ESI應用更為廣泛，PAs和PANOs在ESI作用下形成分子離子峰[M+H]+；APCI對游離PAs分析雖有良好的穩定性，但對PANOs的靈敏度低[7,10,30]。樣品經電噴霧電離后，進入MS檢測，離子阱或三重四極桿已廣泛應用到其MS的分析中，通過分析在離子源中形成的加合離子碰撞誘導解離片段來開發PAs特定的MS方法，例如選擇反應監測、多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）或前體離子掃描等[9,10,47]。

Yoon等[48]通過LC-ESI-MS/MS結合冷凍脂質沉淀和SCX-SPE測定高脂食品中的9 種有毒PAs。該研究基于PAs的[M+H]+的MS/MS碎片化路徑，在MRM模式下選擇PAs的質子化分子作為前體離子，裂解后豐度最高或第二高的離子作為產物離子，以對基質中的PAs進行定性和精確定量。圖6為部分PAs的[M+H]+離子的MS/MS碎裂途徑。此分析方法檢出限達0.06～0.60 ng/mL，分析物的平均回收率在低質量濃度（10 ng/mL）下為81.59%～104.92%，在高質量濃度（100 ng/mL）下為82.06%～105.41%。使用LC-MS/MS MRM模式對PAs進行定性及痕量分析，可以在復雜基質中顯著提高PAs的檢測靈敏度、精密度、選擇性及準確性。目前LC-MS應用廣泛，也是痕量分析茶葉中PAs最普遍的技術，具有廣闊的應用前景。

圖6 部分PAs [M＋H]＋離子MS/MS裂解途徑[48]Fig.6 Partial PAs [M + H]+ MS/MS fragmentation pathway[48]

LC和LC-MS/MS具有許多優點，但也有局限。研究中多數方法都使用目標MS/MS設置，會遺漏相關的PAs；市場上用于準確定量（認證的）且可以商購的參考標準品PAs大約只有50 種，可用的PANOs標準品數量甚至更少，同位素標記的化合物也無法商購，基于無相應的參考標準，研究中只能在大的不確定性下獲得定量結果。在此情況下，使用液相色譜與高分辨質譜的聯用技術（liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，LC-HRMS）對PAs相關物質進行結構篩選（“非目標”篩選）具有重大意義[7,9-10]。

在LC-MS聯用的快速發展中，HRMS已經應用到MS中形成新的檢測方法。如液相色譜-四極桿-軌道阱質譜（liquid chromatography-Q-Exactive Orbitrap mass spectrometry，LC-Q Exactive-MS）[49]、超高效液相色譜-電噴霧電離-四極桿飛行時間質譜（ultra high-performance liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry，UPLC-ESI-Q-TOF-MS）[50]、親水液相色譜-電噴霧電離-四極桿飛行時間質譜（hydrophilic interaction liquid chromatography quadrupole/time-of-flight mass spectrometry，HILIC/ESI-Q-TOF-MS）[51]、液相色譜多模式化-飛行時間質譜（liquid chromatographymulti mode ionization-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry，LC-MMI-TOF-MS）等[52]，這些工具都具有高分辨率、高精度、高質量準確度及極高的靈敏度的優勢，可以基于LC-HRMS的方法來分析沒有參考標準但已知結構的PAs[9]。Q-TOF-MS是目前使用普遍的高分辨質譜，可通過建立每種PAs的碎裂過程來表征痕量化合物[36]。Jeong等[50]開發并驗證了一種使用UPLC-ESI-QTOF-MS快速準確測定植物樣本中9 種PAs的方法，并證明UPLC-ESI-Q-TOF-MS可提供準確的前體和碎片離子質量信息并同時定量，檢出限達0.4～2.0 ng/mL，定量限為0.6～6.0 ng/mL，此外還表征了70 種PAs及PANOs的前體離子及其生成的特征性碎片離子。Martinello等[49]研究發現混合四極桿軌道阱高分辨質譜結合了四極桿質量分析器對前體離子選擇的高性能和靜電場軌道離子阱檢測的高分辨率，與Q-TOF-MS和TOF-MS相比可實現更高的分辨率。

HRMS的應用作為篩選方法有巨大優勢，與傳統的MS/MS相比，HRMS降低了對色譜分離的要求，可實現高通量分析[9]；LC與HRMS聯用可全面獲取樣品中PAs的精確分子質量和碎片離子信息，區分同分異構體，鑒定未知物[53]，是對多種PAs痕量分析的有效檢測手段[9,36]。

3 茶葉中PAs的污染水平

目前茶葉中的PAs檢測技術已經相對成熟，針對茶葉中PAs造成的食品安全質量問題與健康風險，許多國家對市場中的不同茶葉開展了PAs污染水平監測與風險評估研究，歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）調查結果表明，（草藥）茶等物質是人體暴露PAs/PANOs的重要來源之一[54]。表2列舉了近年來不同國家茶葉中PAs的污染水平。

表2 不同國家茶葉中PAs水平Table 2 PAs contents in tea from different countries

3.1 不同國家茶葉PAs污染水平的差異

目前PAs污染茶葉已成為全球性問題[11]，歐美國家尤其是德國已重點監測了花草茶中PAs污染水平。與其他國家相比，德國近幾年市售花草茶中檢出PAs含量較低。Kaltner等[24]在德國檢測市售茶中44 種PAs/PANOs化合物的含量，分別檢查了3 個品牌6 種花草茶（薄荷茶、綠茶、紅茶、茴香茶、甘菊茶和博士茶）的PAs含量，18 個樣品中PAs的含量范圍為0.1～47.9 μg/kg。德國對食品中PAs有嚴格的風險評估與控制策略，自1992年以來，含PA的植物藥物已受到《聯邦制藥條例》的管制，近些年來為加強食品中PAs污染的控制，德國聯邦風險評估研究所（Bundesinstitut für Risikobewertung，BfR）已使用幾種消費情景對兒童和成人食用（草本）茶中的PAs進行了初步風險評估，發現長期食用某些類型的（草藥）茶浸液會增加健康風險，建議消費者對來自各種食品的PAs攝入量需保持低水平[58]。Mathon等[25]檢測瑞士市場花草茶PAs含量時，發現PAs整體含量相對較低，其中茴香茶、紅茶、綠茶中PAs含量低于方法檢出限，但據某些樣品檢測結果推測人類飲食后會超過BfR和英國毒性委員會建議的最大每日攝入量（0.007 μg/kg），長期飲用亦會造成健康風險。比利時、以色列、愛爾蘭等其他國家針對市售花草茶中的PAs污染水平監測中，（草藥）茶中含有類型廣泛的PAs/PANOs，且某些PAs含量較高，存在嚴重質量安全隱患。我國目前對農產品中PA污染與風險評估主要集中于含PAs的植物和蜂蜜，對其他農產品研究甚少，缺乏系統性風險排查以及風險評估研究，最大殘留限量等安全評價指標也因此處于缺失狀態。

3.2 茶葉中的PAs種類

茶葉中的PAs/PANOs主要包括千里光寧堿型、石松胺型、天芥菜堿型、野百合堿型以及奧索千里光裂堿型5 種類型，其中千里光寧堿型PAs是花草茶污染中最主要的化合物，占茶葉中PAs總含量77%以上；石松胺型、天芥菜堿型PAs分別約占總含量的14%和8%[10,29]。此外各類茶葉中普遍發現有千里光寧堿、千里光寧堿氮氧化物、倒千里光堿氮氧化物、印美定、印美定氮氧化物、石松胺、千里光菲靈堿、千里光菲靈堿氮氧化物8 種污染物[54]。Mulder等[57]研究表明千里光寧堿氮氧化物是茶葉中最主要PA，含量范圍約為60～200 μg/kg，約占茶葉中PA總含量的50%。

3.3 不同茶葉中的PAs種類及污染水平

不同茶葉類其PAs組成不同。EFSA科學報告評估表明，在茶浸出液樣本中，綠茶和紅茶均有4 種主要PAs且含量分布均勻，綠茶中主要PAs類型包括千里寧光堿氮氧化物（19%）、倒千里光堿氮氧化物（18%）、印美定（16%）和石松胺（16%）；紅茶中PAs主要由印美定氮氧化物（31%）、印美定（20%）、石松胺（20%）和倒千里光堿-氮氧化物（15%）組成；洋甘菊茶中千里光寧堿氮氧化物、印美定為主要檢出PAs，分別占28%和22%；博士茶中主要有3 類檢出PAs，其中千里光寧堿氮氧化物為最主要PAs，約占總PAs含量57%，倒千里光堿氮氧化物以及千里光寧堿分別占19%和16%[54]。

不同茶類PAs污染程度也不同。總體來看，博士茶中PAs污染最為嚴重，其次是花草茶和紅茶，綠茶以及其他茶葉中含量相對較低（表2）。Bodi等[59]分析了德國市場上6 個茶類總共274 種干茶樣品（包括紅茶、綠茶、博士茶、薄荷、甘菊和混合茶）中PAs含量，其中博士茶PAs污染最為嚴重，平均含量為1 856.4 μg/kg，最大含量高達5 647.2 μg/kg。博士茶污染源被鑒定為可能是茶園里的雜草PA植物千里光，van Wyk等[6]發現在無雜草場所收集的博士茶中均未檢出PAs，在富含雜草千里光的場所中博士茶受到嚴重污染且其含有與千里光相同類型和比例的Pas。研究證實了PAs主要通過污染土壤而間接污染博士茶[6,57]。歐洲花草茶污染水平監測發現，甘菊茶和蜂蜜茶中PAs含量較高且PA類型分布均勻[26,56]，愛爾蘭一項調查檢出甘菊蜂蜜茶中PAs總量平均值可達245 μg/kg[26]，以色列花草茶監測發現洋甘菊茶中PAs污染量高達564 μg/kg[56]，究其原因可能是一些花草茶配料、蜜源植物（如向日葵、紫云英、苜蓿、苕子）是典型的含PAs植物，則含有PAs植物和蜂蜜的花草茶易受到污染[12]。在各項監測中茴香茶、綠茶、紅茶中PAs檢出含量較低（表2），但紅茶中PAs含量普遍高于綠茶[25,56]，EFSA在2016年的監測中發現紅茶中PAs濃度為綠茶中的2 倍[60]；黃茶、烏龍茶、普洱茶等中的PAs含量低甚至不超過方法檢出限[26]，推測不同茶類間PAs種類及污染水平差異可能與其茶葉采摘、加工方式有關。

3.4 茶葉與其他食品或農產品中PAs差異

目前，PAs在蜂蜜、茶葉、谷物、牛奶、雞蛋、肉類以及飼料等多種食品和農產品中均能檢出。蜂蜜及其衍生產品是研究最廣泛的食品，且其中PAs檢出含量高，主要原因是花粉PAs濃度與原始PAs植物組織相近[61-62]，PAs可通過花粉意外引入花蜜污染蜂蜜及其衍生產品[63-64]；含PA的草藥和被PA植物意外污染的草藥、谷物以及香料中PAs檢出含量也均較高[7,10]；在動物源性食品（肉類、雞蛋）中僅有痕量PAs在少數情況下可被檢測到[57]，其污染來源為動物覓食的牧場和田地中可能存在PA植物和含PAs的飼料產品（如苜蓿），這部分PAs可被轉移到動物衍生的食品中[10,54]，Mulder等[65]研究表明產蛋雞攝入含PAs的草藥可能將PAs轉移入雞蛋和雞肉中，導致其受到污染。

與其他食品和農產品相比，茶葉PAs污染范圍廣、污染程度較高且及濃度變化范圍大。Mulder等[57]對歐洲6 個國家動植物源性食品中PAs的污染水平進行調查，有92%的（草藥）茶均含有可檢出的PAs，且含量高，平均含量可達460 μg/kg（以干基質量計），其中大多數花草茶中檢出PAs含量高，而部分紅綠茶中檢出PAs含量低。

4 茶葉中PAs健康風險

4.1 PAs的急性毒性與慢性毒性

目前已有相關機構評估了受PA污染食品（包括茶葉）和基于PA植物生產的食品補充劑所造成的急性毒性及慢性健康風險[54,58-59]。PAs及其氮氧化物具有肝毒性、肺毒性、遺傳毒性、生殖毒性、致癌性、致突變等一系列毒性作用[66]。

PAs可引起急性肝毒性，其癥狀是出血性壞死、肝腫大、腹水和肝功能異常，最終可能導致死亡[66]。目前已有兩例發生在嬰兒當中的臨床病例可以提供可靠的短期暴露劑量效應關系信息[67-70]，6 個月大的女嬰每天攝入PAs大約0.8～1.7 mg/kgmb持續2 周，被診斷出肝靜脈閉塞性疾病（hepatic veno-occlusive disease，HVOD）。HVOD是由PAs中毒引起的肝臟損傷，能導致肝硬化和肝功能衰竭，被認為是PAs暴露的表現[66]。調查發現，一個2 個月大的男嬰每日服用PAs 3 mg/kgmb約4 d發生了致命的后果[69]。這些病例報告列出了短期（4～14 d）暴露PAs后中毒和死亡相關的最低劑量范圍，可得出結論：對于人類，短期暴露PAs后與肝臟不良反應相關的最低已知劑量為每天0.8～1.7 mg/kgmb[7,54,58]。EFSA食品鏈污染物小組根據病例得出每天攝入PAs 1～3 mg/kgmb持續4 d～2 周，可產生急性毒性，且考慮到PAs對人的潛在毒性及其影響的嚴重性尚不確定，與上述劑量范圍相比，暴露水平在100 倍以下亦有急性/短期影響的風險[54]。

臨床實驗中，PAs的毒性作用具有累積性[71]。亞急性或慢性低水平的PAs暴露可能導致肝損傷，如纖維化、結節性再生和肝硬化[66]。目前，茶葉是人體PAs暴露的主要因素之一，因此消費者因食用茶和涼茶等高消費量食品而頻繁或長期暴露于PAs，可能對人體健康造成危害。利用Riddelliine對大鼠的致癌性實驗得出：以10%響應的基準劑量可信下限（benchmark dose limit with a 10%，BMDL10）可作為評估長期暴露于PAs的風險參考點[60,66]。2017年EFSA重新采用暴露限值（margin of exposure，MOE）方法[54]結合基于Riddelliine在大鼠中的致癌性實驗[68]和之前的風險評估結果[73]得出：以BMDL10（每天食用237 μg/kgmb）作為PAs慢性風險評估的參考點。

鑒于食品中PAs對人體健康的潛在危害，已有多國制定了食品中PAs最大允許含量的相關標準或措施[10]。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）早在1989年建議PAs日攝入限制量為15 μg/kgmb[74]；BfR建議PAs每日最大攝入量為0.007 μg/kgmb[58]；歐洲藥物管理局建議PAs的成人日攝入量最高為0.35 μg/kgmb，兒童為0.007 μg/kgmb[75]；2020年，歐盟設置茶葉中21 種PAs含量限量為成人150 μg/kgmb、嬰幼兒75 μg/kgmb[76]，美國食品藥品管理局禁止含PAs的紫草科植物用于食品加工業。目前我國尚未對PAs攝入量做出明確規定與建議。

4.2 PAs理化性質及其在茶湯中的浸出特性

茶葉中的PAs主要通過茶湯被人體吸收從而造成健康風險，因此進行茶葉中PAs風險評估時應考慮其浸出特性[77]。Picron等[29]測定植物性食品（包括茶葉）中PAs在浸泡過程中的轉移率發現，根據化合物的不同，在浸泡過程中只有16%～28%的PAs/PANOs污染物從干物質轉移到了浸泡液中。PAs的結構特性和極性不同會導致浸出特性差異，PAs化合物極性越大，在水中浸出率越高，如PANO極性大，有更高的浸出率；PAs化合物浸出率與水溶解度也呈正相關；但因辛醇/水分配系數低的物質，親水性較高，推測PAs化合物辛醇/水分配系數與其浸出率呈負相關。此外，根據茶葉中污染物以及內含物質在沖泡過程中的浸出規律[76]推測茶葉沖泡方式（沖泡溫度、沖泡次數、沖泡時間等）也會影響內源污染物PAs實際浸出率。

4.3 茶葉中PAs對人體的暴露水平及健康風險

EFSA對歐洲人群中PAs的膳食暴露評估，茶和草藥的攝入是造成PA暴露總量的主要因素[60]。隨著茶葉消費量近年逐漸增長，茶葉中PAs對人體的暴露水平增加。年輕人（嬰幼兒、兒童）和成年人通過消耗茶和草藥（茶）而引起的長期慢性暴露量范圍分別為每天34.5～48.4 ng/kgmb和31.1～41.8 ng/kgmb，其估計值均高于其他食品，長期攝入會有慢性風險；高暴露人群因消費大量高暴露水平茶類（如博士茶）亦會有急性毒性風險[60]。

不同茶類健康風險不同，推測博士茶、薄荷茶、紅茶屬于健康風險較高的茶類，因為博士茶和薄荷茶在多項監測中PAs平均含量及暴露水平均較高[57,59-60]，而紅茶不僅PAs暴露水平較高，還含有毒性較大的石松胺類PAs和印美定類PAs[78]。結合Chen Lu等[79]進行的風險評估，博士茶、薄荷茶、紅茶3 種茶MOE普遍小于10 000，認為其均存在慢性風險。紅茶、博士茶因對成年人的暴露水平更高，推測其風險更大。除上述3 種茶類，根據茶葉中PAs的最大檢出含量與暴露水平推測，若大量食用綠茶、混合涼茶以及甘菊茶也會對人群造成健康風險。因此，茶葉中PAs的健康風險與茶葉PAs暴露水平、PAs分布以及人類的膳食結構均有關，建議人們應建立合理的飲食習慣，保持均衡和多元化，避免因偏食或過度飲食某類茶葉而攝入過量的PAs。

5 結 語

PAs是一類植物次級代謝產物，不飽和PAs及大部分PANOs具有多種毒性作用。茶葉基質復雜，茶葉中PAs檢測前處理技術主要包括改良QuEChERS和SPE法，LCMS/MS是檢測PAs的主要手段。茶葉普遍受到PAs的污染，其污染水平與茶葉產地、種類相關。茶葉中PAs主要包括千里光寧堿型、石松胺型、天芥菜堿型等，其中千里光寧堿氮氧化物污染最為嚴重，約占PAs總含量50%。茶葉中PAs主要通過茶湯被人體吸收，從而對人體健康產生危害。目前，根據科學風險評估歐盟等國家制定茶葉中PAs最大允許含量，并將PAs作為茶葉進口重點關注和檢測參數，對我國茶葉出口貿易產生嚴重影響。我國尚未制定茶葉中PAs檢測方法標準和最大允許含量相關標準，風險評估數據處于缺失狀態，亟待開展茶葉中PAs風險評估與管控研究，確保我國茶葉質量安全，降低PAs超標對我國茶葉出口造成的巨大經濟損失。