真菌毒素多重檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

陳瑞鵬，孫云鳳，霍冰洋，秦英凱，李 雙，梁 俊，周煥英,*，高志賢,*

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050；2.天津科技大學(xué) 省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

真菌毒素是真菌在適宜條件下產(chǎn)生的一類小分子次級(jí)代謝產(chǎn)物，目前已知的真菌毒素約有400多種[1]。研究表明，大多數(shù)真菌毒素可抑制動(dòng)物體內(nèi)蛋白的合成，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[2]，進(jìn)而影響動(dòng)物體肝臟[3]、腎臟[4]、神經(jīng)[5]、造血等組織器官的正常運(yùn)作[6]，具有強(qiáng)烈的致癌、致畸、致突變作用，對(duì)人和動(dòng)物的生命與健康造成重大威脅[7]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有四分之一的食物受到真菌毒素污染，其中2%的農(nóng)產(chǎn)品因污染嚴(yán)重直接失去營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[8]。常見(jiàn)的真菌毒素有黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）B1、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮毒素（zearalenone，ZEN）、T-2毒素、伏馬毒素B1（fumonisin 1，F(xiàn)B1）、嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）和桔青霉素（citrinin，CIT）等[9-11]。

由于農(nóng)產(chǎn)品作物生長(zhǎng)、收獲、貯藏及運(yùn)輸中都易受到產(chǎn)毒真菌的侵染，且所產(chǎn)生的真菌毒素在加工處理過(guò)程中不易被清除，因此，真菌毒素污染被認(rèn)為是不可避免的污染問(wèn)題[12]。更為重要的是，多重產(chǎn)毒真菌可能侵染同一農(nóng)產(chǎn)品[13]，同時(shí)侵染的產(chǎn)毒真菌往往可以同時(shí)產(chǎn)生多種真菌毒素，因此在農(nóng)產(chǎn)品中多種真菌毒素的共存成為一種不可忽視的必然現(xiàn)象，這就需要建立真菌毒素的多重檢測(cè)技術(shù)。本文綜述了近5 年真菌毒素多重檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展，主要包括高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法、免疫層析法、化學(xué)比色法、電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、熒光法等，分析了這些方法在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用與亟待解決的問(wèn)題，并對(duì)其未來(lái)的發(fā)展應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

HPLC-MS/MS法集中了色譜的分離性能與質(zhì)譜的分子確證優(yōu)勢(shì)[14]，其在檢測(cè)器階段利用質(zhì)量分析器對(duì)待測(cè)物進(jìn)行二次選擇，將離子豐度轉(zhuǎn)換為可定量計(jì)算的峰，同時(shí)提供被測(cè)物的質(zhì)量數(shù)與分子結(jié)構(gòu)信息，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、專一性強(qiáng)、再現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為分析檢測(cè)多組分真菌毒素的主要方法[15]。

樣品前處理是指對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行提取、富集和凈化的步驟，以減少雜質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度。目前常采用的樣品前處理方法有一步提取法和分散固相萃取QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）法。Zhao Hongxia等[16]利用HPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)植物油中的16 種真菌毒素，首先采用一步提取法對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行提取：使樣品經(jīng)體積分?jǐn)?shù)85%乙腈溶劑提取和C18吸附劑處理，隨后將目標(biāo)物在多反應(yīng)檢測(cè)模式下的保留時(shí)間和離子對(duì)信息進(jìn)行定量分析，該方法對(duì)16 種真菌毒素的加標(biāo)回收率為72.8%～105.8%，檢出限為0.04～2.9 ng/mL。Bi Bo等[17]利用HPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)人參樣品中11 種真菌毒素（AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、CIT、FB1、FB2、HT-2毒素、T-2毒素、ZEN和OTA）。采用甲醇-水溶劑的一步提取法從人參中提取真菌毒素后直接分析測(cè)定，用基質(zhì)匹配外標(biāo)法對(duì)人參中的11 種真菌毒素進(jìn)行定量，整個(gè)分析過(guò)程可在12 min內(nèi)完成。該方法對(duì)11 種真菌毒素的檢測(cè)限和定量限分別為0.25～50 ng/mL和0.1～25 ng/mL。一步提取法可以有效簡(jiǎn)化樣品前處理過(guò)程、減少目標(biāo)成分的損失，但還同時(shí)存在一定的局限性。人參等復(fù)雜基質(zhì)經(jīng)一步提取后，基質(zhì)中的其他復(fù)雜成分可能同時(shí)被共提取，會(huì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)樣口造成污染，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。Zhang Kai等[18]開發(fā)了穩(wěn)定同位素稀釋-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）同時(shí)檢測(cè)5 種食用油（菜籽油、玉米油、橄欖油、花生油和大豆油）中的12 種真菌毒素的方法。首先根據(jù)QuEChERS法將食用油中加入同位素內(nèi)標(biāo)，經(jīng)乙腈-水（1∶1，V/V）超聲提取并離心去除油脂，所得溶液經(jīng)濾膜過(guò)濾后用HPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式檢測(cè)。該方法對(duì)12 種真菌毒素的加標(biāo)回收率在80%～120%之間，檢測(cè)限在0.1～6.4 ng/mL之間。穩(wěn)定同位素稀釋校正了前處理過(guò)程的損失和基質(zhì)效應(yīng)等因素對(duì)分析準(zhǔn)確度的影響，但是它只能應(yīng)用于不少于兩個(gè)穩(wěn)定同位素的元素測(cè)定，使得測(cè)量元素的范圍受到限制，同時(shí)同位素稀釋劑的制備成本較高，試劑獲取困難，需要研發(fā)各種新型的同位素稀釋劑使得穩(wěn)定同位素稀釋-LC-MS/MS在真菌毒素檢測(cè)領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。表1總結(jié)了近5 年LC-MS/MS法在不同食品中多重真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用。

表1 LC-MS/MS法在多重真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用Table 1 Applications of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the detection of multiple mycotoxins

近5 年來(lái)在真菌毒素多重檢測(cè)方面LC-MS/MS法極大程度降低了基體的干擾，檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度得到了極大的改善，但檢測(cè)成本仍然較高。開發(fā)快速、低成本、操作檢測(cè)的檢測(cè)技術(shù)，并實(shí)現(xiàn)應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)多重真菌毒素的方法，是未來(lái)LC-MS/MS法的研究熱點(diǎn)。

2 免疫層析法

免疫層析法是指將識(shí)別元件（抗原）和采用交體金[25]、磁珠[26]、熒光微球[27]等標(biāo)記的捕獲元件（抗體）固定在硝酸纖維素膜上，標(biāo)記物作為信號(hào)指示物的檢測(cè)方法。在分析時(shí)，待測(cè)液溶解標(biāo)記的抗體在毛細(xì)管作用下沿著試紙條遷移，結(jié)合區(qū)域產(chǎn)生顏色、熒光等信號(hào)變化定性或定量分析多組分真菌毒素。免疫層析法根據(jù)目標(biāo)物的大小分為雙抗夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法，其中真菌毒素是單一抗原表位的小分子物質(zhì)，適用于競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法[28]。

量子點(diǎn)是元素周期表中IIB族和VIA族元素組成的一類半導(dǎo)體材料（如CdTe、CdSe、ZnS等）或元素周期表IIIA族和VA族元素組成的一類半導(dǎo)體材料（如InAs、InP、InGaAs等）組成的納米顆粒，具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄且重疊小等優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)單一光源激發(fā)時(shí)，不同量子點(diǎn)所發(fā)出的熒光不同，因此可以應(yīng)用于真菌毒素的多重檢測(cè)。Shao Yanna等[29]建立了基于量子點(diǎn)熒光微球（quantum dot beads，QBs）同時(shí)檢測(cè)AFB1、FB1和OTA的免疫層析試紙條法。利用生物素和鏈霉親和素（biotinstreptavidin，biotin-SA）之間的高親和力以及多級(jí)信號(hào)放大效應(yīng)，顯著提高免疫層析法的靈敏度。該方法以牛血清白蛋白偶聯(lián)生物素為控制線，以QBs-SA作為控制線探針的獨(dú)立控制線信號(hào)體系，并與常規(guī)羊抗鼠IgG抗體的控制線體系進(jìn)行了性能對(duì)比。以biotin-SA作為多目標(biāo)物定量檢測(cè)的對(duì)照信號(hào)，不受目標(biāo)物真菌毒素的干擾，優(yōu)于羊抗鼠IgG抗體，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。對(duì)AFB1、FB1、OTA的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為46.94、10.31、0.44 pg/mL。

納米金粒子因其制備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在真菌毒素的多重檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。Huang Xinyu等[30]采用花狀納米金粒子作為免疫標(biāo)記探針，研發(fā)了可同時(shí)檢測(cè)中藥中DON和FB1的免疫層析試紙條。花狀納米金比表面積大有利于提高試紙條的檢測(cè)靈敏度，該方法對(duì)DON和FB1的檢測(cè)限均為5 ng/mL且檢測(cè)時(shí)間僅需5 min，與球型納米金作為免疫標(biāo)記物的試紙條相比，靈敏度提高了4 倍。

時(shí)間分辨免疫層析技術(shù)（time-resolved fluorescent immunochromatographic assay，TRICA）結(jié)合時(shí)間分辨熒光免疫分析和層析技術(shù)，借助高靈敏的標(biāo)記示蹤物，用于微量檢測(cè)毒素[31]。示蹤物多由兩種不同的鑭系元素離子（分別作為光吸收子和發(fā)射子）及陶瓷顆粒（作為主基質(zhì)）摻雜構(gòu)成[32]，靈敏度高和穩(wěn)定性高，優(yōu)于常用的標(biāo)記物。Tang Xiaoqian等[33]研發(fā)了基于TRICA同時(shí)檢測(cè)AFB1和ZEN的新方法。首先合成了具有熒光增強(qiáng)效果的銪/鋱納米球作為示蹤物，并分別和抗獨(dú)特型納米抗體（anti-idiotypic nanobody，Aldnb）和單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）偶聯(lián)，構(gòu)建了兩種基于競(jìng)爭(zhēng)法的時(shí)間分辨熒光免疫試紙條（Aidnb-TRFICA和mAb-TRFICA）。Aidnb-TRFICA對(duì)AFB1和ZEN的IC50分別為0.46 ng/mL和0.86 ng/mL，比mAb-TRFICA對(duì)AFB1和ZEN的IC50分別提高了18.3、20.3 倍，Aidnb-TRFICA對(duì)AFB1和ZEN的檢測(cè)限分別為0.05、0.07 ng/mL。

近5 年免疫層析法的靈敏度和準(zhǔn)確度得到了改善，但其中熒光物質(zhì)的穩(wěn)定性差是該技術(shù)發(fā)展的瓶頸。一方面可以利用有機(jī)材料將數(shù)以萬(wàn)計(jì)的熒光物質(zhì)包裹成納米微球，增加熒光物質(zhì)的穩(wěn)定性，減少非特異性吸附，提高熒光信號(hào)強(qiáng)度；另一方面可以研發(fā)新材料，例如使用近紅外的熒光材料等，最大限度地避免背景熒光物質(zhì)的干擾。免疫層析法中的硝化纖維膜試紙條的組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，制備時(shí)易出現(xiàn)不均勻現(xiàn)象，同時(shí)可能會(huì)存在非特異性吸附反應(yīng)，會(huì)使溶液層析時(shí)液面不均勻，使檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生誤差。將免疫層析法構(gòu)建于微流控芯片平臺(tái)上，研究微流控芯片中表面的抗原抗體修飾以及固定技術(shù)，制成微流控免疫層析芯片，可以極大提高檢測(cè)的靈敏度和重復(fù)性，是免疫層析法在未來(lái)的研究熱點(diǎn)。

3 化學(xué)比色法

化學(xué)比色法是指利用待測(cè)物與化學(xué)試劑之間發(fā)生明顯的化學(xué)顯色反應(yīng)，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比較顏色或在一定波長(zhǎng)處比較吸光度，從而對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量檢測(cè)的方法[34]。化學(xué)比色法中的顯色反應(yīng)通常具有較高的靈敏度和選擇性，反應(yīng)生成的有色化合物性質(zhì)穩(wěn)定，顏色差異明顯[35]。具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于真菌毒素的多重快速檢測(cè)中。

Zhu Weiran等[36]構(gòu)建了氧化石墨烯同時(shí)比色檢測(cè)OTA和AFB1的磁控雙方法。該方法基于金納米顆粒的類酶活性，其在酸性條件下可催化3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺顯色以及pH值敏感的變色染料分子百里酚酞在堿性條件下顯色，通過(guò)DNA耦合以及DNA自組裝，磁分離固體在堿性條件下釋放百里酚酞分子實(shí)現(xiàn)AFB1的可視化檢測(cè)，上清液在酸性條件下催化TMB實(shí)現(xiàn)對(duì)OTA的可視化檢測(cè)。該方法對(duì)AFB1和OTA的檢測(cè)范圍分別為5～250 ng/mL和0.5～80 ng/mL。Sheini等[37]開發(fā)了基于金銀納米顆粒的聚集比色法用于同時(shí)檢測(cè)AFB1、OTA和ZEN。首先使用3 種不同的還原劑（多巴胺、咖啡酸和聚乙烯吡咯烷酮）合成3 種不同類型的金銀納米顆粒，然后將金銀納米顆粒注入疏水性基底的親水性圓形區(qū)域，加入真菌毒素后，金銀納米粒子發(fā)生聚集反應(yīng)，金銀納米粒子分別變化為紫色和棕色，根據(jù)金銀納米粒子顏色的變化對(duì)3 種真菌毒素進(jìn)行痕量分析。該方法對(duì)AFB1、OTA和ZEN的檢測(cè)限分別為2.7、3.3 ng/mL和7.0 ng/mL。

在近5 年內(nèi)，化學(xué)比色法基于金納米粒子獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)開發(fā)的多重檢測(cè)真菌毒素在選擇性、靈敏度、快速性和便攜性等方面有了顯著改善，但還存在一些需要解決的問(wèn)題：由于對(duì)待測(cè)物自身的化學(xué)性質(zhì)依賴性較強(qiáng)，在檢測(cè)過(guò)程中易受到外部環(huán)境的干擾，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。該問(wèn)題可以通過(guò)提高金納米粒子的穩(wěn)定性，基于其表面等離子體對(duì)應(yīng)光譜偏移的顏色變化進(jìn)行檢測(cè)，增加檢測(cè)方法準(zhǔn)確性；使金納米粒子信號(hào)可控放大，對(duì)真菌毒素進(jìn)行更準(zhǔn)確的定量分析。

4 電化學(xué)法

電化學(xué)法是根據(jù)電解質(zhì)溶液中物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)及其變化規(guī)律，建立在電學(xué)量（電流、電位、電陰或電量）與待測(cè)目標(biāo)物之間的計(jì)量關(guān)系的基礎(chǔ)上，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性或定量分析的方法。具有靈敏度高、選擇性好、分析速度快、易于自動(dòng)化、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在真菌毒素的多重檢測(cè)中有著廣泛的應(yīng)用。

Aori Qileng等[38]開發(fā)了基于光電化學(xué)（photoelectrochemistry，PEC）和方波伏安（square wave voltammetry，SWV）法的比率雙信號(hào)傳感器同時(shí)檢測(cè)OTA、OTB和OTC的方法。首先在導(dǎo)電玻璃表面修飾二硫化鉬（MoS2）納米片，然后用化學(xué)沉積法在電極上固定CdS，加入抗原孵育，隨后加入OTA與mAb進(jìn)行免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入ZnS/Ag2S＠Aldnb，形成免疫復(fù)合物MoS2NFs/CdS-Ag-mAb-ZnS/Ag2S＠Aldnb，在免疫識(shí)別過(guò)程中，ZnS/Ag2S標(biāo)記的沉積會(huì)影響MoS2NFs/CdS的PEC電流與ZnS溶解Zn2+的SWV電流，以ZnS/Ag2S納米籠為標(biāo)記，產(chǎn)生PEC響應(yīng)和SWV響應(yīng)的比值信號(hào)。該傳感器對(duì)OTA、OTB和OTC的檢測(cè)限分別為0.1、0.5、0.5 ng/mL。Han Zheng等[39]構(gòu)建了以還原性MoS2-Au為基底材料，核酸適配體為電化學(xué)分子識(shí)別元件，選用硫堇和二茂鐵基己硫醇作為電化學(xué)信號(hào)指示劑用于同時(shí)檢測(cè)玉米中的ZEN和FB1。其中以還原性MoS2-Au作為基底材料，不僅可以放大信號(hào)，促進(jìn)電子的傳遞速率，更有利于核酸適配體的固定。該方法對(duì)ZEN和FB1的檢測(cè)范圍分別為1 pg/mL～100 ng/mL和1 pg/mL～10 ng/mL，檢測(cè)限均為0.5 pg/mL。Wang Chengquan等[40]將兩種金屬元素的量子點(diǎn)包覆在SiO2微球表面，以金殼包覆的磁性納米粒子為載體，基于核酸適配體與互補(bǔ)鏈組裝納米復(fù)合材料作為生物探針，以核酸適配體為識(shí)別元件同時(shí)檢測(cè)OTA和FB1的電化學(xué)磁控適配體傳感器，該方法對(duì)OTA和FB1的檢測(cè)限分別為5 pg/mL和20 pg/mL。

近5 年電化學(xué)法在多重檢測(cè)真菌毒素的靈敏度和特異性方面得到了極大的提高。但是目前仍然存在一些急需解決的問(wèn)題：1）樣品前處理的過(guò)程比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要進(jìn)一步簡(jiǎn)化樣品的前處理流程；2）電化學(xué)傳感器的分子識(shí)別元件的穩(wěn)定性、使用壽命以及非特異性結(jié)合能力有待進(jìn)一步提高；3）電化學(xué)信號(hào)指示劑的種類有限，需要研發(fā)更多的電化學(xué)信號(hào)指示劑。

5 化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光是指由化學(xué)反應(yīng)引起的發(fā)光現(xiàn)象。化學(xué)發(fā)光法是指利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，對(duì)化學(xué)發(fā)光物質(zhì)由激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時(shí)發(fā)出的光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析的方法[41]。該方法在檢測(cè)過(guò)程中不需要外加光源，可以避免其他光源產(chǎn)生的干擾以及帶來(lái)的其他誤差，具有操作簡(jiǎn)便、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和分析速度快等分析檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛運(yùn)用于真菌毒素的多重檢測(cè)分析中。

Xu Jie等[42]建立了基于水凝交光子晶體微球的化學(xué)發(fā)光法同時(shí)檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中的FB1、AFB1和OTA。首先利用3 種水凝交微球分別包被3 種真菌毒素對(duì)應(yīng)的抗原，然后將3 種水凝交光子晶體微球同時(shí)加入3 種真菌毒素，使其發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，用光纖光譜儀對(duì)水凝交光子晶體微球進(jìn)行解碼，最后分別檢測(cè)3 種水凝交光子晶體微球的魯米諾-H2O2化學(xué)發(fā)光體系的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)3 種真菌毒素的多重檢測(cè)。該方法對(duì)FB1、AFB1和OTA的檢測(cè)限分別為2.1、1.7 pg/mL和0.4 pg/mL。Jiang Fan等[43]開發(fā)了基于表面等離子體耦合同時(shí)檢測(cè)CIT、AFB1和OTA的化學(xué)發(fā)光法。首先將銀納米顆粒和真菌毒素對(duì)應(yīng)的抗原依次固定在氨基化的玻璃芯片上，其中銀納米顆粒的局域表面等離子體激元共振效應(yīng)能增強(qiáng)芯片上的化學(xué)發(fā)光，通過(guò)抗原、抗體和真菌毒素小分子的競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)真菌毒素的多重檢測(cè)。該方法對(duì)CIT、AFB1和OTA的檢測(cè)限分別為0.39、0.44 pg/mL和0.83 pg/mL。Li Li等[44]開發(fā)了基于96 孔板的同時(shí)檢測(cè)大麥中的DON、ZEN、T-2毒素和FB1化學(xué)發(fā)光免疫法。首先采用紫外光引發(fā)聚合反應(yīng)的方法，用紫外光光源激發(fā)光引發(fā)劑光解產(chǎn)生自由基引發(fā)丙烯酸酯類單體聚合制備單孔陣列，然后將4 種真菌毒素對(duì)應(yīng)的抗體固定在96 孔板上形成區(qū)域陣列，基于化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)大麥中的4 種真菌毒素。該方法對(duì)DON、ZEN、T-2毒素和FB1的檢測(cè)限分別為3.6、4.8、3.9、1.7 pg/mL。

目前在實(shí)際應(yīng)用中化學(xué)發(fā)光法仍然存在幾個(gè)問(wèn)題：1）化學(xué)發(fā)光劑和增強(qiáng)劑種類較少，急需研發(fā)更多的化學(xué)發(fā)光劑和增強(qiáng)劑來(lái)拓展化學(xué)發(fā)光法的應(yīng)用范圍；2）發(fā)展化學(xué)發(fā)光法和傳感技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)等聯(lián)用，擴(kuò)大化學(xué)發(fā)光法在真菌毒素檢測(cè)分析中的應(yīng)用；3）研發(fā)化學(xué)發(fā)光法儀器設(shè)備的小型、便攜式、自動(dòng)化和一體化，有助于推進(jìn)化學(xué)發(fā)光儀器的商業(yè)化。

6 熒光法

熒光法是利用待檢測(cè)物經(jīng)外加頻率的紫外線照射后，激發(fā)出能夠反映其特性的熒光，通過(guò)微孔板熒光儀[45]、熒光顯微鏡[46]、激光共聚焦顯微鏡[47]和熒光分光光度計(jì)[48]等儀器檢測(cè)熒光強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢測(cè)的定量分析。熒光分子可以在很短的時(shí)間內(nèi)被大量反復(fù)的激發(fā)和監(jiān)測(cè)，量子產(chǎn)率較高，具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)和定量精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于真菌毒素多重檢測(cè)中。

Liu Rui等[49]開發(fā)了基于TiO2多孔硅（porous silicon，Psi）表面適配體同時(shí)檢測(cè)OTA、AFB1和FB1的微陣列熒光法。Psi表面的TiO2納米層比熱氧化Psi的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了14 倍，通過(guò)分別用熒光染料和淬滅劑標(biāo)記真菌毒素適配體和抗適配體的雜交雙鏈體DNA對(duì)TiO2-Psi表面進(jìn)行適配體熒光信號(hào)恢復(fù)的原理，達(dá)到同時(shí)檢測(cè)真菌毒素的目的。該方法對(duì)OTA、AFB1和FB1的檢測(cè)限分別為15.4、1.48 pg/mL和0.21 pg/mL。Zhang Dagan等[50]開發(fā)了基于硫黃素T（thioflavin T，ThT）/G四鏈體超分子結(jié)構(gòu)為光學(xué)標(biāo)簽的交體晶體條形碼同時(shí)檢測(cè)AFB1、FB1和OTA的方法。首先將探針通過(guò)共價(jià)鍵偶聯(lián)在光子晶體（photonic crytal，phC）顆粒上，形成一個(gè)分子信標(biāo)（molecular beacon，MB）結(jié)構(gòu)，其中包含真菌毒素適配體和G-四鏈體序列。當(dāng)沒(méi)有靶標(biāo)物時(shí)，G-四鏈體形成序列被鎖定在MB的發(fā)卡結(jié)構(gòu)中，因此沒(méi)有熒光信號(hào)。將靶標(biāo)物加入MB修飾的phC顆粒中，MB的發(fā)卡結(jié)構(gòu)基于靶標(biāo)物和適配體的特異性識(shí)別而打開，導(dǎo)致G-四鏈體區(qū)域暴露，大量的ThT結(jié)合在phC顆粒表面的G-四鏈體結(jié)構(gòu)上，從而導(dǎo)致強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，靶標(biāo)物濃度與phC條形碼的熒光強(qiáng)度成正比。該方法對(duì)3 種真菌毒素的檢測(cè)范圍為1.0 pg/mL～100 ng/mL，檢測(cè)限為0.7 pg/mL。Zhang Jing等[51]研發(fā)了一種基于DNA支架銀納米簇（silver nanocluster，AgNCs）和Zn2+離子信號(hào)增強(qiáng)的熒光適配體傳感器同時(shí)檢測(cè)OTA和AFB1的方法。首先將OTA適配體（aptamer，Ap）1和AFB1Ap2通過(guò)生物素-鏈霉親和素固定在磁珠表面，單鏈（signal probe，Sp）1和Sp2分別與OTA和AFB1的適配體雜交形成Ap1-Sp1、Ap2-Sp2復(fù)合物。當(dāng)存在靶標(biāo)物OTA和AFB1時(shí)，靶標(biāo)與各自對(duì)應(yīng)的適配體結(jié)合形成OTA-Ap1、AFB1-Ap2復(fù)合物，Sp1和Sp2被釋放至溶液中，經(jīng)磁分離，Sp1和Sp2分布在上清液中作為合成DNA/AgNCs的支架，上清液中Sp1/AgNCs、Sp2/AgNCs的熒光信號(hào)強(qiáng)度分別與OTA和AFB1的濃度呈正相關(guān)。其中Zn2+離子的引入可以使熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。該方法對(duì)OTA和AFB1的檢測(cè)限分別為0.2 pg/mL和0.3 pg/mL。

近5 年熒光法多重真菌毒素的檢測(cè)時(shí)間縮短且靈敏度得到極大改善，但是大多數(shù)常用的熒光團(tuán)的熒光壽命以秒為單位，并且需要特定的儲(chǔ)存條件來(lái)穩(wěn)定其熒光響應(yīng)，目前熒光法還未應(yīng)用于多重真菌毒素的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)分析中。目前熒光分析法主要呈現(xiàn)以下幾個(gè)趨勢(shì)：1）針對(duì)自身無(wú)熒光物質(zhì)，研發(fā)反應(yīng)活性高、量子產(chǎn)量大的熒光探針，從而拓寬檢測(cè)的領(lǐng)域；2）針對(duì)不同基質(zhì)及目標(biāo)化合物，探索最佳提取方式以及凈化手段，實(shí)現(xiàn)最佳回收率及特異性；3）將熒光分析技術(shù)與光學(xué)、電化學(xué)等多方面技術(shù)結(jié)合，構(gòu)造成集成便攜式的綜合檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)同步獲得檢測(cè)和分析的信息。

7 拉曼光譜法

拉曼光譜是光穿過(guò)透明介質(zhì)時(shí)由于分子的非彈性散射使光頻率發(fā)生變化而產(chǎn)生的一種散射光譜。拉曼效應(yīng)是光子與光學(xué)及聲子相互作用的結(jié)果，拉曼散射光譜可以獲取分子振動(dòng)能級(jí)與轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)躍遷的特征信息，具有強(qiáng)大的分子識(shí)別能力，是分子信息快速獲取的理想手段。但常規(guī)拉曼散射強(qiáng)度比較弱，靈敏度不高。表面增強(qiáng)拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）極大地克服了常規(guī)拉曼光譜靈敏度不高的不足同時(shí)又保留了拉曼光譜的實(shí)時(shí)、快速的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于真菌毒素多重檢測(cè)中。

SERS具有靈敏度高和多分子無(wú)標(biāo)記等優(yōu)勢(shì)，雙金屬等離子的核和殼組成的拉曼編碼粒子表現(xiàn)出獨(dú)特的局部表面等離子體共振效應(yīng)，和其他納米粒子相比，銀離子具有最好的等離子增強(qiáng)效應(yīng)，而金離子良好的生物相容性可以作為銀殼的外部殼層以防止銀的氧化和毒性，同時(shí)可以提高納米粒子的整體穩(wěn)定性[52]。Zhao Yuan等[53]開發(fā)了基于拉曼信標(biāo)分子編碼銀＠金核殼納米粒子同時(shí)檢測(cè)OTA和AFB1。首先在拉曼信標(biāo)分子編碼的銀＠金納米粒子分別修飾靶標(biāo)物對(duì)應(yīng)的適配體，在磁性納米粒子上修飾靶標(biāo)物對(duì)應(yīng)適配體的互補(bǔ)鏈，通過(guò)適配體與互補(bǔ)鏈的雜交互補(bǔ)配對(duì)原則，拉曼信標(biāo)分子編碼銀＠金核殼納米粒子組裝在磁性納米粒子周圍，該結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出較強(qiáng)的拉曼信號(hào)。當(dāng)加入靶標(biāo)物后，靶標(biāo)物和適配體特異性識(shí)別，使得對(duì)應(yīng)的拉曼分子編碼銀＠金核殼納米粒子從磁性納米粒子表面脫落，經(jīng)過(guò)磁分離，組裝體的拉曼信號(hào)減弱，拉曼信號(hào)與靶標(biāo)物的濃度呈負(fù)相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)真菌毒素的同時(shí)定量檢測(cè)。該方法對(duì)OTA和AFB1的檢測(cè)限分別為6 pg/mL和30 pg/mL。Li Yu等[54]開發(fā)了一種基于SERS技術(shù)同時(shí)檢測(cè)AFB1、ZEN、OTA的免疫傳感器。首先在金納米顆粒上修飾拉曼信號(hào)分子5,5-二硫代雙(琥珀酰亞氨基-2-硝基苯甲酸)并與真菌毒素的抗體共價(jià)偶聯(lián)作為SERS的納米探針。而AFB1抗原、ZEN抗原、OTA抗原共價(jià)偶聯(lián)在微陣列金芯片表面作為捕獲探針。這種傳感器對(duì)AFB1的檢測(cè)范圍為0.061～0.066μg/kg，ZEN的檢測(cè)范圍為0.53～0.57 μg/kg，OTA的檢測(cè)范圍為0.26～0.29 μg/kg。

拉曼光譜作為一種新興技術(shù)近年來(lái)在多重真菌毒素檢測(cè)方面顯著降低了檢測(cè)成本、提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性，但目前SERS技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用仍存在許多問(wèn)題亟待解決：1）SERS信號(hào)的增強(qiáng)機(jī)理不清晰，相比實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用方面取得的進(jìn)展，理論研究相對(duì)滯后；需要科研人員加強(qiáng)SERS在增強(qiáng)機(jī)理方面的研究；2）性能較好的SERS基底材料均為貴金屬與其他材料的復(fù)合物，成本高；3）SERS基底的復(fù)現(xiàn)性差，檢測(cè)方法難以商業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化；4）SERS技術(shù)尚未建立多種真菌毒素的“拉曼光譜指紋”數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)于未建立指紋圖譜的真菌毒素較難檢測(cè)，需要進(jìn)一步完善“拉曼光譜指紋”數(shù)據(jù)庫(kù)。

8 其 他

目前也有一些其他技術(shù)廣泛應(yīng)用于真菌毒素的多重檢測(cè)中。已知傳統(tǒng)真菌毒素檢測(cè)方法與智能手機(jī)的結(jié)合是達(dá)到便攜化的一個(gè)良好手段，因此，基于智能手機(jī)圖像處理的平臺(tái)，尋找一種配套檢測(cè)與編碼的載體，使其編碼信號(hào)清晰、可變、容量高、檢測(cè)信號(hào)靈敏具有重要的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用意義。Ji Wanying等[55]開發(fā)了基于水凝交形狀編碼與圖像處理解碼的方法同時(shí)檢測(cè)OTA和AFB1。首先利用微流控平臺(tái)與停止流動(dòng)光刻技術(shù)制備偶聯(lián)真菌毒素適配體的水凝交微粒，依據(jù)編碼及圖像處理解碼技術(shù)對(duì)水凝交顆粒熒光圖像進(jìn)行獲取，通過(guò)智能手機(jī)上圖像識(shí)別程序?qū)晒鈭D像進(jìn)行分析。該方法對(duì)AFB1和OTA的檢測(cè)范圍分別為0.1～200 ng/mL和0.1～500 ng/mL，檢測(cè)限均為0.1 ng/mL。Yang Minye等[56]研發(fā)基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒和熒光圖像處理的智能手機(jī)相結(jié)合用于真菌毒素的多重檢測(cè)。首先合成直徑為2～8 μm的上轉(zhuǎn)換磁性編碼微球，通過(guò)980 nm的近紅外光照射，不同上轉(zhuǎn)換粒子編碼微球可發(fā)出不同顏色的可見(jiàn)光，每種顏色代表一種待測(cè)物，通過(guò)智能手機(jī)自編的應(yīng)用程序?qū)幋a微球的圖像進(jìn)行分析，可在1 min之內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果，該方法對(duì)ZEN、OTA和AFB1的檢測(cè)限分別為0.05、0.1 ng/mL和0.1 ng/mL。

9 結(jié) 語(yǔ)

本文重點(diǎn)介紹了近5 年真菌毒素多重檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展，主要檢測(cè)方法有HPLC-MS/MS法、免疫層析法、化學(xué)比色法、電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、熒光法等，分析比較了這些方法在真菌毒素多重檢測(cè)中的優(yōu)缺點(diǎn)。

當(dāng)前多重真菌毒素檢測(cè)的研究多是通過(guò)樣品前處理將毒素分子從待測(cè)物質(zhì)中提取凈化，合成或利用新的納米材料，如金納米粒子、量子點(diǎn)、修飾抗體等免疫標(biāo)記示蹤物的納米微粒等，利用其在不同檢測(cè)方法中優(yōu)良的光學(xué)特性，構(gòu)建可與待測(cè)物特異性識(shí)別的檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)樣品中毒素分子的定量檢測(cè)。目前多重真菌毒素檢測(cè)的研究重點(diǎn)主要集中在以下幾個(gè)方面。1）樣品提取。樣品前處理多采用一步提取法或QuEChERS法，隨著提取方法的不斷使用、改良和驗(yàn)證，現(xiàn)已建立起針對(duì)不同樣品良好的凈化體系，為之后待測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)提供了良好的檢測(cè)環(huán)境。2）納米材料。隨著科研人員長(zhǎng)期不懈努力，納米材料領(lǐng)域不斷延伸發(fā)展，目前有越來(lái)越多的新型材料被應(yīng)用于多重真菌毒素檢測(cè)，其光學(xué)性能穩(wěn)定可靠，研究人員可根據(jù)自身需要及客觀環(huán)境選擇合適的納米材料構(gòu)建檢測(cè)體系，利用化學(xué)比色法、化學(xué)發(fā)光法、熒光法等實(shí)現(xiàn)對(duì)毒素的多重準(zhǔn)確檢測(cè)。研究出更多化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、易于合成、體積均一、成本低廉的納米材料依然是今后研究的重點(diǎn)。3）識(shí)別原件。對(duì)待測(cè)物質(zhì)的靈敏識(shí)別是制約檢測(cè)體系靈敏度、準(zhǔn)確性與特異性的關(guān)鍵。當(dāng)前研究多是通過(guò)識(shí)別原件與真菌毒素分子之間基于分子結(jié)構(gòu)或抗原抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)特性對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行識(shí)別。檢測(cè)體系中出現(xiàn)的識(shí)別原件的非特異性吸附、分子穩(wěn)定性差、識(shí)別物使用壽命短、不可重復(fù)使用等問(wèn)題嚴(yán)重制約了多重真菌毒素檢測(cè)的發(fā)展，解決信號(hào)分子與真菌毒素之間的特異性識(shí)別是該研究的難點(diǎn)。4）檢測(cè)方法。隨著各種新技術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)已出現(xiàn)了諸如與微流控技術(shù)結(jié)合、與智能手機(jī)相結(jié)合、拉曼光譜等各種新型檢測(cè)技術(shù)。與微流控技術(shù)結(jié)合，可極大提高檢測(cè)的靈敏度和重復(fù)性。與智能手機(jī)相結(jié)合可實(shí)現(xiàn)樣品的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)，同時(shí)可用于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)地檢測(cè)。拉曼光譜作為一種新興檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)對(duì)真菌毒素“指紋圖譜”進(jìn)行檢測(cè)，能夠顯著降低檢測(cè)成本，且儀器便攜，可實(shí)現(xiàn)毒素的實(shí)時(shí)精確定量。但作為新興檢測(cè)技術(shù)，以上方法仍存在各種不足，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)方法的快速、低廉、便攜、靈敏、精確檢測(cè)依然需要研究人員繼續(xù)探索，不斷完善。

面對(duì)不可避免的真菌毒素污染問(wèn)題，未來(lái)應(yīng)更加重視食品生產(chǎn)運(yùn)輸過(guò)程中真菌毒素污染累積的關(guān)鍵點(diǎn)，把握源頭和過(guò)程控制，建立環(huán)保、綠色、安全的真菌毒素全程管控技術(shù)規(guī)范。在真菌毒素多重檢測(cè)方面，要加強(qiáng)真菌毒素多重檢測(cè)的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)地應(yīng)用開發(fā)，研發(fā)快速檢測(cè)裝備和小型便攜式的商業(yè)設(shè)備是農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素多重檢測(cè)中的兩個(gè)熱點(diǎn)發(fā)展趨勢(shì)。