殺菌劑防治結縷草大斑病效果及生理響應

傅 強，徐彥花，張巨明，劉天增

（華南農業大學林學與風景園林學院/ 廣東省草業工程技術研究中心，廣東廣州 510642）

隨著經濟、社會的發展，草坪已廣泛融入人類生活，成為現代社會不可分割的一部分[1]。結縷草(Zoysia japonica)是一種優良暖季型草坪草，具有抗旱、耐寒、耐貧瘠、耐踐踏等優良特性，被廣泛應用于高爾夫球場、運動場、綠化及水土保持等領域[2-4]。蘭引Ⅲ號結縷草是目前在我國南方地區運動場上廣泛應用的結縷草品種，于1994 年正式通過全國牧草品種審定委員會審定登記。該品種具有擴展性強、生長迅速、成坪快、耐高溫、耐修剪、耐踐踏、抗寒、青綠期長、觀賞性好、管理成本低等優良特性[5-10]，被廣泛應用于熱帶、亞熱帶地區的運動場草坪建植。但由于我國南方地區氣候濕熱，病害頻發，防治難度大，嚴重影響了運動場草地的功能使用性和景觀觀賞性[11]。因此，病害防治成為結縷草草坪養護管理過程中一個急需解決的問題[12-13]。

結縷草大斑病是夏季暖季型草坪質量下降的一個重要因素，主要由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)引發[14]。研究發現，大斑病是鈍葉草(Stenotaphrum helferi)、海濱雀稗(Seashore paspalum)和結縷草上發生的最嚴重的病害之一[15]。立枯絲核菌引起的大斑病能使與葉莖相連的葉鞘產生腐爛，造成宿主莖、葉和根死亡，形成大的圓形病斑，嚴重時甚至病斑直徑可達數米[16-17]。

近年來，國內外對立枯絲核菌的研究尤其以防治措施的研究為熱點[18-19]。雖然草坪病害有多種防治方法，如化學防治、生物防治、農業防治等[20-21]，但在生產實踐中仍然以化學防治為主，其他防治方法難以奏效[22]。草坪草大斑病的防治通常需要噴施殺菌劑進行預防，以防止其造成持久性損害[15]。在化學防治過程中長期使用單一殺菌劑，會導致病原菌出現抗藥性，防治效率下降，用藥量增加，草坪病害防治成本上升。目前殺菌劑種類繁多，需要篩選出低毒、高效的殺菌劑，有針對性地解決草坪養護中急需解決的問題。

鑒于此，利用菌絲生長速率法判定殺菌劑對病原菌菌株的抑制效果，篩選對供試菌株抑制效果較好的殺菌劑，通過噴施殺菌劑對結縷草病害的影響，并結合在接菌后經殺菌劑處理的結縷草植株的一系列生理響應，以期探索出合理的化學防治方法，為結縷草大斑病的防治提供指導，為提高草坪觀賞價值和使用功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 立枯絲核菌對殺菌劑的敏感性測定

1.1.1 供試材料

供試菌株：立枯絲核菌R. solaniZS-1由本團隊成員從感染大斑病的蘭引Ⅲ號結縷草上分離獲得，保存在華南農業大學草坪實驗室。立枯絲核菌R. solaniZW54是從海南省感染大斑病的細葉結縷草(Z. tenuifolia)上分離獲得，由嶺南師范學院提供。

供試藥劑：3種內吸式殺菌劑‘扮綠’(156 g·L?1丙環唑)、‘繪綠’(50%嘧菌酯)、‘賽達’(0.31%嘧菌酯+0.75%丙環唑)以及一種觸殺式殺菌劑‘卉樂’(12%咯菌腈)均由先正達生物科技有限公司提供。

1.1.2 室內毒力測定

將儲存于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養基的立枯絲核菌R. solaniZS-1和ZW54移至PDA 平板培養基上培養，再進行帶毒培養基的制備。將供試藥劑用無菌水和培養基稀釋至所需濃度，殺菌劑‘繪綠’的 濃度 梯度 為0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50 mg·L?1，殺菌劑‘扮綠’、‘卉樂’、‘賽達’的濃度梯度為0.5、1、5、10、20、50 mg·L?1。將菌餅分別接種到各個不同濃度的帶毒培養基上，每個培養基上接種1個菌餅，在30℃、光周期為12 h 的智能人工氣候箱中培養2 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，求出抑菌率，并以藥劑濃度梯度的對數值為橫坐標，以抑菌率的機率值為縱坐標，求出各藥劑對兩種病原菌的毒力回歸方程，再根據毒力回歸方程計算每種藥劑的抑制中濃度EC50值。

抑菌率=(對照菌落直徑?處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

1.2 盆栽防效測定

1.2.1 供試植株培養

將河沙、泥炭土(德國Hawita)和采自華南農業大學增城教學科研基地草坪草地的田間土壤以體積比1?1?1充分混勻，置于121℃高溫滅菌2 h 后分裝于8 cm×8 cm 的塑料花盆中，將采自華南農業大學增城教學科研基地的蘭引Ⅲ號結縷草的健康植株草莖移栽其中，將植物材料置于溫度30 ℃晝/25℃夜、光周期12 h、空氣濕度50%、光照強度320 μmol·(m2·s)?1的溫室中。每天澆無菌水50 mL以確保土壤濕潤，定期進行施肥，每周修剪一次，保留植株高度約5 cm。

1.2.2 接種物培養

將20 g 小麥(Triticumaestivum)種子置于裝有無菌水的燒杯中浸泡24 h，取出浸泡后的小麥種子于121℃高溫高壓滅菌鍋中滅菌2 h，再置于超凈工作臺上晾干。再將小麥種子分別平鋪于已培養3 d 的立枯絲核菌菌株ZS-1和ZW54平板培養基上，置于智能人工氣候箱30℃培養7 d 后取出，置于研缽中研磨，得到病原菌接種物[23]。

1.2.3 接種與殺菌劑處理

根據室內毒力測定的結果，選取抑菌效果較好的殺菌劑‘繪綠’和‘扮綠’進行結縷草葉面噴施處理，每個處理4次重復，噴施等量無菌水作為對照。殺菌劑噴施濃度均為0.5 mg·L?1，處理2 d 后分別接種立枯絲核菌菌株ZS-1 和ZW54，先噴灑無菌水使葉片濕潤，再將病原菌接種物均勻灑在結縷草葉片表面，每盆0.2 g 病原菌接種物，套袋保濕繼續置于智能人工氣候箱30℃培養。分別在接菌后4、8、12 d取樣測定各項指標。

接菌后12 d，每盆隨機取50個葉片，統計各殺菌劑處理后結縷草發病葉片數，參照公式計算發病率，發病率= 病葉數/50×100%。每個處理的發病率為4個重復的平均值。再根據公式計算各藥劑相對防效，防效=(對照發病率?處理發病率)/對照發病率×100%。

1.2.4 測定指標及方法

葉片相對含水量、葉綠素含量、脯氨酸含量的測定參考王學奎[24]的測定方法；丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法[25]進行測定；苯丙氨酸解氨酶活性的測定參考陳轉成[26]、褚洪龍[27]以及歐陽路平[28]的方法；幾丁質酶活性及β-1,3-葡聚糖酶活性的測定參考蘇州科銘生物試劑盒說明書進行。

1.3 數據分析

采用Excel 2016軟件進行數據的基本處理，使用SPSS 17.0進行毒力測定，求各殺菌劑對兩種病原菌的毒力回歸方程，并在置信區間為95%的條件下對盆栽試驗的葉片相對含水量、葉綠素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、苯丙氨酸解氨酶活性、幾丁質酶活性、β-1,3-葡聚糖酶活性、發病率進行單因素方差分析，對防治效果進行獨立樣本t檢驗。

2 結果與分析

2.1 室內藥效試驗

測試結果表明，4種殺菌劑對立枯絲核菌ZS-1和ZW54的菌落生長均有抑制作用。‘繪綠’對菌株ZS-1菌絲生長的抑制效果最好，‘繪綠’和‘扮綠’對菌株ZW54菌絲生長的抑制效果較好，其EC50值均小于1 mg·L?1，因此殺菌劑‘繪綠’和‘扮綠’是下一步盆栽和田間藥效試驗的首選藥劑(表1)。其次，4種供試殺菌劑對菌株ZS-1的EC50值大于菌株ZW54的EC50值，說明菌株ZS-1對殺菌劑的耐受性強于菌株ZW54，在施用藥劑防治病害的過程中要注意病原菌的抗藥性問題。

表1 殺菌劑對立枯絲核菌菌株的毒力測定Table 1 Toxicity test of different fungicideson mycelial growth of Rhizoctonia solani

2.2 殺菌劑處理對結縷草葉片相對含水量的影響

結縷草接種立枯絲核菌ZS-1和ZW54后，隨著接種時間的延長，發病率增加，葉片相對含水量呈現逐漸下降的趨勢(圖1)。在接種病原菌后的第4天、第8天和第12天，經殺菌劑處理的結縷草葉片相對含水量顯著高于未使用殺菌劑的對照(P<0.05)。殺菌劑處理后的葉片相對含水量下降緩慢，而對照的葉片相對含水量下降更快。殺菌劑‘繪綠’和‘扮綠’對立枯絲核菌均有較好的抑制效果，葉片相對含水量在二者處理間無顯著差異(P> 0.05)。

圖1 殺菌劑處理對結縷草葉片相對含水量的影響Figure 1 Effect of fungicides on the relative water content of zoysiagrass

2.3 殺菌劑處理對結縷草葉綠素含量的影響

結縷草接種立枯絲核菌ZS-1和ZW54后，隨著接種時間的延長，發病率增加，葉綠素含量呈現逐漸下降的趨勢(圖2)。在接種病原菌后的第4天、第8天和第12天，經殺菌劑處理的結縷草葉綠素含量顯著高于未使用殺菌劑的對照(P<0.05)。殺菌劑處理的葉綠素含量下降緩慢，而對照的葉綠素含量下降更快。殺菌劑‘繪綠’和‘扮綠’對立枯絲核菌均有較好的抑制效果，在接種病原菌ZS-1后的第4 天、第8天和第12天葉綠素含量在二者處理間無顯著差異(P>0.05)，在接種病原菌ZW54后的第4天、第8天葉綠素含量在二者處理間無顯著差異，在第12天經殺菌劑‘繪綠’處理的結縷草葉綠素含量顯著高于‘扮綠’殺菌劑處理和對照。

圖2 殺菌劑處理對結縷草葉綠素含量的影響Figure2 Effect of fungicideson the chlorophyll content of zoysiagrass

2.4 殺菌劑處理對結縷草脯氨酸含量的影響

結縷草接種立枯絲核菌ZS-1和ZW54后，隨著接種時間的延長，發病率增加，脯氨酸含量呈現逐漸上升的趨勢(圖3)。在接種病原菌后的第4天、第8天和第12天，經殺菌劑處理的結縷草脯氨酸含量顯著低于未使用殺菌劑的對照(P<0.05)。殺菌劑處理的脯氨酸含量上升緩慢，而對照的脯氨酸含量上升更快。殺菌劑‘繪綠’和‘扮綠’對立枯絲核菌均有較好的抑制效果，脯氨酸含量在二者處理間無顯著差異(P>0.05)。

圖3 殺菌劑處理對結縷草脯氨酸含量的影響Figure 3 Effect of fungicides on the proline content of zoysiagrass

2.5 殺菌劑處理對結縷草丙二醛含量的影響

結縷草接種立枯絲核菌ZS-1和ZW54后，隨著接種時間的延長，發病率增加，對照的丙二醛含量呈現逐漸上升的趨勢，而殺菌劑處理的丙二醛含量呈現先上升后下降的趨勢(圖4)。在接種病原菌后的第4天、第8天和第12天，經殺菌劑處理的結縷草丙二醛含量顯著低于未使用殺菌劑的對照(P<0.05)。殺菌劑‘繪綠’和‘扮綠’對立枯絲核菌均有較好的抑制效果，二者間無顯著差異(P> 0.05)。

圖4 殺菌劑處理對結縷草丙二醛含量的影響Figure4 Effect of fungicideson themalondialdehyde content of zoysiagrass

2.6 殺菌劑處理對結縷草苯丙氨酸解氨酶活性的影響

結縷草接種立枯絲核菌ZS-1和ZW54后，隨著接種時間的延長，發病率增加，對照的苯丙氨酸解氨酶活性呈現逐漸下降的趨勢，而殺菌劑處理的苯丙氨酸解氨酶活性呈現先上升后下降的趨勢(圖5)。在接種病原菌后的第4天、第8天和第12天，經殺菌劑處理的結縷草苯丙氨酸解氨酶活性顯著高于未使用殺菌劑的對照(P<0.05)。殺菌劑‘繪綠’和‘扮綠’對立枯絲核菌均有較好的抑制效果，經殺菌劑‘繪綠’處理的結縷草苯丙氨酸解氨酶活性顯著高于殺菌劑‘扮綠’處理(P< 0.05)。

圖5 殺菌劑處理對結縷草苯丙氨酸解氨酶活性的影響Figure 5 Effect of fungicides on the phenylalanine ammonia-lyase activity of zoysiagrass

2.7 殺菌劑處理對結縷草幾丁質酶活性的影響

結縷草接種立枯絲核菌ZS-1和ZW54后，隨著接種時間的延長，發病率增加，對照的幾丁質酶活性呈現逐漸下降的趨勢，而殺菌劑處理的幾丁質酶活性呈現先上升后下降的趨勢(圖6)。在接種病原菌后的第4天、第8天和第12天，經殺菌劑處理的結縷草幾丁質酶活性顯著高于未使用殺菌劑的對照(P<0.05)。殺菌劑‘繪綠’和‘扮綠’對立枯絲核菌均有較好的抑制效果，經殺菌劑‘繪綠’處理的結縷草幾丁質酶活性顯著高于殺菌劑‘扮綠’處理(P< 0.05)。

圖6 殺菌劑處理對結縷草幾丁質酶活性的影響Figure 6 Effect of fungicides on the chitinase activity of zoysiagrass

2.8 殺菌劑處理對結縷草β-1,3-葡聚糖酶活性的影響

結縷草接種立枯絲核菌ZS-1和ZW54后，隨著接種時間的延長，發病率增加，對照的β-1,3-葡聚糖酶活性呈現逐漸下降的趨勢，而殺菌劑處理的β-1, 3-葡聚糖酶活性呈現先上升后下降的趨勢(圖7)。在接種病原菌后的第4天、第8天和第12天，經殺菌劑處理的結縷草β-1,3-葡聚糖酶活性顯著高于未使用殺菌劑的對照(P<0.05)。殺菌劑‘繪綠’和‘扮綠’對立枯絲核菌均有較好的抑制效果，經殺菌劑‘繪綠’處理的結縷草β-1,3-葡聚糖酶活性顯著高于殺菌劑‘扮綠’處理(P< 0.05)。

圖7 殺菌劑處理對結縷草β-1, 3-葡聚糖酶活性的影響Figure 7 Effect of fungicides on the β-1, 3-glucanase activity of zoysiagrass

2.9 殺菌劑處理后結縷草大斑病的發病率

立枯絲核菌菌株ZS-1和ZW54對結縷草均具有較強的致病性(圖8)。在接菌后12 d，染病植株葉片和葉鞘上出現水漬狀或褐色斑點，然后整個葉片迅速變黃死亡。經殺菌劑處理的結縷草大斑病發病率顯著低于未使用殺菌劑的對照(P<0.05)。殺菌劑‘扮綠’處理的發病率較高，菌株ZS-1和ZW54的發病率分別為43.49%和41.18%。殺菌劑‘繪綠’處理的發病率顯著低于殺菌劑‘扮綠’處理(P<0.05)。在殺菌劑‘繪綠’、‘扮綠’處理下病原菌為ZS-1的病株發病率均高于病原菌為ZW54的病株的發病率。經殺菌劑處理的結縷草死亡率顯著低于未使用殺菌劑的對照(P< 0.05)，殺菌劑‘繪綠’處理的死亡率最低。

圖8 殺菌劑處理后結縷草大斑病的發病率Figure 8 Effect of fungicides on the incidence rate of large patch

2.1 0殺菌劑對結縷草大斑病的防治效果

殺菌劑‘繪綠’、‘扮綠’處理對立枯絲核菌菌株ZS-1和ZW54引發的結縷草大斑病均具有一定的防治效果(圖9)。殺菌劑‘繪綠’處理對結縷草大斑病的防效顯著高于殺菌劑‘扮綠’處理(P<0.05)。殺菌劑‘繪綠’防效最優，對菌株ZS-1和ZW54的防效分別為43.61%和49.58%。殺菌劑‘繪綠’、‘扮綠’處理對病原菌ZS-1的病株防效均低于對病原菌ZW54的病株的防效。

圖9 殺菌劑處理對結縷草大斑病的防效Figure 9 Effect of fungicides on control efficacy of large patch

3 討論與結論

本研究通過4種殺菌劑分別對結縷草大斑病菌株ZW54和大斑病菌株ZS-1的抑制效果的測定，結果表明，供試的4種殺菌劑對菌株ZS-1和ZW54均有抑制作用，且各殺菌劑處理間抑制效果差異顯著；殺菌劑‘繪綠’(50%嘧菌酯)對供試的兩株結縷草病原菌菌株的抑制作用最強。兩株菌株對各殺菌劑的耐受性也有差異，4種供試殺菌劑對菌株ZS-1的抑制作用均比ZW54的抑制作用弱，即菌株ZS-1對4種殺菌劑的耐受性比菌株ZW54高。其原因之一可能是菌株的來源和生境不同導致，菌株ZS-1是從深圳大運中心體育場的蘭引Ⅲ號結縷草感病植株中分離出的，在日常的場地養護中經常施用多種殺菌劑，因此菌株ZS-1 對殺菌劑具有一定的耐藥性，敏感性有所降低；而菌株ZW54從野生細葉結縷草的感病植株中分離獲得，在此前的生境中處于自然發病狀態，并未接觸任何殺菌劑，所以對殺菌劑較為敏感。另一種造成耐藥性的原因可能是觸殺式殺菌劑‘卉樂’不能在植物體內傳導或移動性差，只對植物直接接觸殺菌劑的部位起作用，發揮作用比較快，表現直觀；3種內吸式殺菌劑‘扮綠’、‘繪綠’和‘賽達’可被植物根、莖、葉等部位吸收，并經輸導組織從吸收部位傳導到其他部位發揮作用，藥效較慢。

有研究發現植物在受到病害脅迫時，葉片相對含水量和葉綠素含量會有所降低，而下降速度越慢，說明植物的生長代謝越好，更有利于抵御病害[26,28]。本研究在結縷草葉片相對含水量和葉綠素含量的變化中發現殺菌劑處理后的結縷草對菌株ZS-1和菌株ZW54的抵抗性有所提高。在受到病原菌侵染時，植物自身會產生脯氨酸，用來分解活性氧自由基，從而抵抗病原菌對自身細胞的影響[27]，植物組織細胞發揮正常生理功能的基礎是細胞膜結構的完整性和流動性。植物組織受病害脅迫時，會使植物組織細胞膜受損，丙二醛含量積累[29-30]。也有研究表明丙二醛含量越高，說明植物細胞膜受到的危害越大[31-32]。本研究中，在接種菌株后經殺菌劑處理的植株中丙二醛含量顯著低于對照，與上述研究結果類似。說明殺菌劑對病原菌均有抑制作用。

苯丙氨酸解氨酶、幾丁質酶以及β-1,3-葡聚糖酶活性是研究植物抗病性的重要指標[26]。在苯丙烷代謝途徑中苯丙氨酸解氨酶起關鍵作用，參與了多種激發子誘導的抗性，有效提高了植物抵抗病原侵染的能力[33]。本研究中，殺菌劑‘繪綠’處理的植株苯丙氨酸解氨酶活性在所有處理中最低，這說明殺菌劑‘繪綠’處理后，菌株ZS-1和菌株ZW54對植株的侵染受到抑制，與上述研究結果一致。幾丁質酶通過降解侵染植株的真菌病原菌菌株的細胞壁，從而提高植物自身對病原的抗性[28]。殺菌劑處理的植株幾丁質酶活性在感病后期均有所降低，說明藥劑處理可以有效抑制病原菌菌株的侵染。在植物的抗病防御體系中，植物對病原菌的抑制作用主要是通過幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶等協同作用來完成[34]。在接種菌株后，殺菌劑‘繪綠’處理的植株β-1,3-葡聚糖酶活性隨接菌天數的增加而呈現下降趨勢。在感病初期殺菌劑‘繪綠’可能會提高植株的β-1,3-葡聚糖酶活性，從而減少菌株的侵害，在感病后期由于殺菌劑對病原菌的抑制和植物體內的β-1,3-葡聚糖酶活性的提高對于病原菌的防御作用共同降低了植株受病原菌的侵害，說明殺菌劑對2株病原菌引起的病害均有防治作用。

殺菌劑防治病害是一個極其復雜的生理生化過程，涉及到多種物質的相互作用[35]，所以僅從藥劑防治的效果不能非常全面地反映殺菌劑對病害的防治作用。本研究綜合相對含水量、葉綠素含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、苯丙氨酸解氨酶活性、幾丁質酶活性及β-1,3-葡聚糖酶活性各項生理指標，探究了不同殺菌劑對病害的綜合影響，篩選出對結縷草大斑病病原菌抑制效果較強的兩種殺菌劑‘繪綠’和‘扮綠’。而殺菌劑‘繪綠’對兩株病原菌ZS-1和ZW54的抑制作用均為最優，其防效分別為43.61%和49.58%。