A型禽流感病毒H7N9株NS1基因的克隆和真核表達

黃海巖，劉新宇，蔡葵蒸

（西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

禽流感（Avian Influenza，AI）是一種由禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）引起的易感染禽類（雞、鴨、鵝）以及哺乳動物和人的人畜共患病。該病主要以呼吸道飛沫傳播為主，因而傳播速度快，嚴重危害著養禽業的發展。人的感染主要是接觸患病的禽類及其排泄物，糞口傳播亦能引起感染，雖未見人和人的傳播，但對公共衛生及人類健康造成的威脅不可小覷。國際獸疫局將禽流感定為A類傳染病，我國也將其列為一類動物傳染病。禽流感病毒在分類上屬于正黏病毒科，根據病毒的核蛋白和膜蛋白等特性的差異，又分為A、B、C三型[1]，A型最易引起傳染，宿主多樣，能夠感染禽、豬、馬和人類，每次流行時感染范圍大，常導致世界性的大流行[2]。

流感病毒有2種表面抗原，分別為血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA），依次將該病毒分為若干亞型。根據報道，已知有H亞型16個（H1～H16），N亞型10個（N1～N10）[3]。據研究，世界各地的海鳥和水禽都是流感的天然貯存宿主[4,5]。

由于流感病毒的變異，人感染流感是由于禽類貯存宿主流感病毒的遺傳物質重現所引起[6]。AIV最早感染人的亞型是H7N7，是從人的眼分泌物中分離得到，1997年我國香港發生H5N1型AIV感染人并導致死亡的病例，突破了只有H1、H2、H3亞型AIV感染人及哺乳動物的界限[7]。本研究中涉及H7N9亞型AIV，曾經有一段時間認為并不感染人，但自從2013年首次發現人類感染以來，病例不斷增多且有蔓延趨勢，至2017年累計感染人1 344例，其中511人死亡，致死率高達38%[8]，應引起公共衛生界的高度關注。

AIV基因組是由8條單股的RNA片段構成，這些片段編碼10種病毒蛋白，其中2個較小的RNA片段編碼了2種非結構蛋白（Nonstructural proteins，NS）[9]，分別為NS1和NS2，它們由2個讀碼框翻譯，NS1蛋白分子量為22～28 KD，是一個易活性的轉錄活性劑[10]。NS2的閱讀框不連續分子量為12 KD。NS1蛋白是唯一的轉錄后調控子，具有N端RNA結合R和C端效應區兩個功能域[11]。NS1蛋白是一個參與禽流感病毒致病力的主要蛋白質，在感染早期與宿主蛋白發生相互作用后就大量表達，主要聚集于宿主細胞核內，能誘導宿主產生早期感染的抗體。據此可以區分野毒感染和人工免疫抗體，作為禽流感早期診斷指標[12]，NS1還可抑制宿主蛋白的表達與轉運[13]，可能扮演著損害被病毒感染宿主細胞的重要角色，在病毒致病性中發揮著重要作用。因此，NS1在禽流感免疫學研究及病毒早期診斷中有較大的應用價值。

王晶鈺等[14]對H9N2亞型禽流感病毒NS1基因進行了原核表達和真核表達研究。本研究的目的是擴增H7N9亞型禽流感病毒分離株NS1基因，構建真核表達載體，同時利用293T細胞進行表達，為日后進一步研究NS1蛋白的功能及H7N9亞型禽流感的診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 H7N9亞型禽流感病毒株系中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供和保存。病毒接種于10日齡SPF雞胚尿囊腔，無菌收集死亡后雞胚的尿囊液，置-20℃冰箱保存備用。

1.1.2 細胞系和菌株 DH5a感受態細胞及293T細胞，保存于中國農業科學院蘭州獸醫研究所畜禽疾病重點實驗室。

1.1.3 主要試劑設備 本研究中主要試劑及儀器見黃海巖等[15]關于A型禽流感病毒H7N9株M1基因的克隆和表達。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物 用引物設計軟件（Primer 5.0）設計特異性引物，其序列如下：5’-GATGTCG ACCATGGATTCCAATACTGTGTC-3’為上游引物，5’-CTGGCGGCCGCCTACTTTGTAGAGAG TGG-3’為下游引物，引物由華大基因公司合成，擴增產物大小預期為654 bp。

1.2.2 總RNA提取和PCR擴增 按照試劑盒的操作說明書，直接從雞胚尿囊液中抽提所需試驗病毒株的基因組RNA，根據反轉錄試劑盒的接種說明書合成cDNA。擴增目的基因的PCR體系為50 μl；模板cDNA 0.05 μl（50 mg），NS1上下引物各2.5 μl，5*PCR buffer 10 μl，dNTP 1 μl，DNA聚合酶1 μl，補去離子水至50 μl，按照黃海巖等[15]報道的方法設計PCR擴增反應參數，獲得PCR擴增產物后于4℃保存。

1.2.3 NS1基因真核表達載體的構建 參照王晶鈺等[14]的方法，將上述PCR產物與真核表達載體PRK-FLAG雙酶切后，在T4連接酶的作用下鏈接，獲得真核表達質粒PRK-FLAG-NS1，連接產物轉化至DH5a感受態細胞，再經Sa1 I和Not I內切酶，PCR鑒定，菌液送華大基因公司測序鑒定。

1.2.4 重組NS1基因在293T細胞中的表達 取培養在10%胎牛血清中的傳三代293T細胞，參照杜江龍等和王晶鈺等的方法，重組NS1質粒轉染于293T細胞，在37℃、5% CO2條件下，培養轉染細胞。

1.2.5 表達產物的Western blot分析 參照王晶鈺等[14]的方法收集培養48 h后的細胞，用0.5%胰酶消化細胞，離心等處理后作為蛋白電泳的樣品。部分樣品進行SDS-PAGE電泳分析，考馬斯亮藍染色；部分樣品置于轉膜中進行Western blot分析。

2 結果

2.1 NS1基因RT-PCR擴增

以A型流感病毒H7N9株的總RNA為模板完成RT-PCR擴增后，產物經瓊脂糖凝膠電泳，得大小約650 bp左右條帶（見圖1）。查閱相關資料，與預期和NS1基因實際大小相符合。

圖1 A型流感病毒H7N9株NS1基因RTPCR產物凝膠結果

2.2 NS1基因的酶切鑒定

經雙酶切獲得NS1基因條帶，NS1基因大小為654 bp（見圖2），證明NS1基因真核重組質粒構建成功。由圖2可知，左側和右側分別為15 000 bp、2 000 bp 的marker，NS1基因的條帶位于500～750 bp。

圖2 A型流感病毒H7N9株NS1基因的重組質粒酶切鑒定

2.3 Western Blot蛋白鑒定

轉染pRK-FLAG-NS1后的293T細胞表達的重組蛋白可以被FLAG抗體識別，且重組蛋白實際大小與預期大小相同，空載體沒有陽性結果，說明NS1基因在293T細胞中成功表達（見圖3）。此外，蛋白印記表明，H7N9-NS1的蛋白大小為23.9 KD，與基因大小相符。

圖3 A型流感病毒H7N9株FLAG-NS1的蛋白印記表達

3 討論

本研究利用RT-PCR克隆出禽流感H7N9亞型分離株NS1基因，基因大小與引物設計片段一致，經陰性克隆、酶切鑒定，構建了NS1基因真核重現質粒，瞬時轉染293T細胞，通過轉染的培養細胞裂解后進行Western Blot分析，獲及的蛋白大小為23.9 KD，與預期結果相符，從而在轉染細胞中成功表達了NS1蛋白。

目前世界上高度重視有關禽流感的研究。流感病毒的傳統檢測方法包括血清學試驗和免疫熒光技術等，雞卵培養多是診斷流感不同亞型的確切依據，但病毒培養由于耗時費力、工作量大，難以在實際生產中實施。分子生物學診斷技術發展迅猛，如RT-PCR（逆轉錄-聚合酶鏈反應）、RRT-PCR（實時RT-PCR）、RT-LAMP（逆轉錄-環介導等溫擴增技術）和基因芯片技術，這些技術檢測禽流感需要的樣品量少，具有特異性好、敏感性強、最為有效等特點。

研究表明，NS1蛋白作為ELISA檢測抗體，能成功區分野毒感染馬和人工免疫馬[16]。Tumpey等研究證明[17]，NS1蛋白作為檢測抗體可以區分野毒感染雞群和滅活疫苗接種雞群[18]，顯示出其未來在疫苗免疫和野毒感染的鑒別診斷方向有著廣闊的應用前景。