響應(yīng)面法優(yōu)化黑果枸杞多酚超聲波輔助提取工藝

代沛珊，李淑玲，楊生輝，朱培龍，劉 帆

（1.河西學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅張掖 734000；2.河西學(xué)院，甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅張掖 734000）

黑果枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）是茄科枸杞屬植物，廣泛分布于中國西北鹽堿荒漠區(qū)，是一種獨特的藥食兩用植物。黑果枸杞在藏藥中被稱為“旁瑪”，其味甘、性平、清心熱，西藏醫(yī)藥名著《晶珠本草》將其列為傳統(tǒng)珍貴名藥[1-2]。黑果枸杞蛋白質(zhì)含量為10.61%；氨基酸種類較豐富；脂肪含量為6.66%，主要脂肪酸為亞油酸、油酸和棕櫚酸；礦質(zhì)元素含量較高，其中鈣、鐵、鎂、銅、鋅含量高于紅枸杞[3]。黑果枸杞具有抗氧化、抗自由基、保護(hù)心腦血管、抗輻射等作用[4]，可直接食用或用作工業(yè)原料，還可用于治療心臟病、高血壓、月經(jīng)不調(diào)、更年期紊亂、尿道結(jié)合、牙齦出血等[2]。

黑果枸杞富含花色苷等多酚，多酚常采用溶劑提取和超臨界萃取等方法，但存在提取時間長、得率低等缺陷[5-6]。超聲波提取法依據(jù)超聲空化效應(yīng)、機(jī)械傳質(zhì)效應(yīng)和熱效應(yīng)，提高了細(xì)胞含量的穿透和傳遞能力，增大了材料分子的運動頻率和速度，提高了有效成分的浸出率。相比于傳統(tǒng)提取方法，超聲波提取法具有效率高、提取時間短和生物活性不受影響等優(yōu)點[7]。本研究利用超聲波輔助法從黑果枸杞中提取多酚，采用福林酚法測定黑果枸杞中多酚的得率，并通過單因素試驗分析了乙醇濃度、固液比、超聲時間、超聲溫度對黑果枸杞中多酚得率的影響，通過響應(yīng)面試驗對提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳提取條件，為黑果枸杞生物活性物質(zhì)的研究和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黑果枸杞：采購自張掖新樂超市，用植物粉碎機(jī)粉碎，貯藏于密封袋中，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

無水乙醇、碳酸鈉、福林酚、硫酸銨購自上海源葉生物科技有限公司，以上均為分析純。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%），上海雅吉生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

722 型可見光分光光度計，上海光譜儀器有限公司；DKB-501 型數(shù)顯超級恒溫水浴鍋，揚州市三發(fā)電子有限公司；DL-820E 型智能超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵，鞏義市京華儀器有限公司；F2102 型植物試樣粉碎機(jī)，湖北省驊市中興儀器有限公司；PL-203 型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；DD5M型立式大容量離心機(jī)，鹽城市凱特實驗儀器有限公司。

1.2 試驗方法

準(zhǔn)確稱取0.5 g 黑果枸杞粉末，按照一定固液比加入一定濃度的乙醇溶液，在超聲功率為100 W，一定超聲溫度下，超聲一段時間，提取液在4 000 r/min 離心10 min，量取上清液體積，定容至100 mL，得到樣品溶液。

1.3 多酚的測定

采用福林酚比色法測定黑果枸杞多酚含量[8]。取樣品溶液0.5 mL，加蒸餾水0.5 mL，加福林酚0.2 mL，反應(yīng)3～8 min，再加入1 mL 飽和Na2CO3溶液，補(bǔ)水2.8 mL 至總體積5 mL，混勻，黑暗放置60 min，于760 nm 處測定吸光值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取10 mg 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品加蒸餾水定容至100 mL，得0.1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于10 mL 試管中，按照以上福林酚法測定，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=1.933 8x+0.039 1（R2=0.999 2）。根據(jù)該方程可得出提取液中黑果枸杞多酚質(zhì)量濃度，再根據(jù)公式（1）即可求出黑果枸杞多酚的得率。

式中，c-黑果枸杞多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V-上清液體積，mL；N-稀釋倍數(shù)；m-黑果枸杞質(zhì)量，g。

1.4 單因素試驗

分別考察乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%）、固液比（1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、超聲時間（5、10、15、20、30 min）、超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）對黑果枸杞多酚得率的影響。

1.5 響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計原理，選擇乙醇濃度（A）、固液比（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面試驗，并以-1、0、1 分別表示自變量的高、中、低水平，多酚得率為響應(yīng)值，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 黑果枸杞多酚提取Box-Behnken 試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken extraction from Lycium ruthenicum polyphenols

1.6 超聲波輔助法與傳統(tǒng)溶劑提取法的比較

超聲波輔助法：采用優(yōu)化后的超聲提取條件提取黑果枸杞多酚。

傳統(tǒng)溶劑提取法：準(zhǔn)確稱取0.5 g 黑果枸杞，按固液比1∶63（g/mL）加入54%乙醇溶液，25 ℃水浴浸提2.5 h。然后，提取液在4 000 r/min 離心10 min，量取上清液體積，定容至100 mL，測量黑果枸杞中的多酚得率。

1.7 乙醇/硫酸銨雙水相體系回收黑果枸杞多酚

取2 mL 優(yōu)化后的提取液考察(NH4)2SO4加入量對多酚回收率的影響：取優(yōu)化后提取液各2 mL 于10 mL 刻度試管中，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g(NH4)2SO4混勻，在水浴鍋中靜置1 h，分層后得到上下兩相，讀取上相體積，并測定黑枸杞多酚在上相的吸光度，再根據(jù)公式（2）即可求出黑果枸杞多酚回收率[9]。

式中，V上-上相體積，mL；c上-上相多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V-優(yōu)化的提取液體積，2 mL；c-優(yōu)化的多酚質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗平行測定3 次，采用Origin 2019b、Design expert 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對多酚得率的影響

固定固液比1∶40，超聲功率100 W，超聲時間5 min，超聲溫度30 ℃的條件下，依次加入濃度為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，超聲波輔助提取黑果枸杞多酚，結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可以看出，當(dāng)乙醇濃度從30%增加到50%時，多酚得率隨乙醇濃度的增加而增大；當(dāng)乙醇濃度為50%時，達(dá)到最大值，為210 mg/g；隨后，隨乙醇濃度的增加，多酚得率明顯降低，這是因為植物體內(nèi)的水溶性多酚分布在細(xì)胞的大液泡中，而非水溶性多酚類物質(zhì)存在于細(xì)胞壁上，且與蛋白質(zhì)或多糖類物質(zhì)以氫鍵結(jié)合[10]。低濃度的乙醇溶液可以進(jìn)入細(xì)胞，高濃度的乙醇導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，阻止了多酚類物質(zhì)的傳質(zhì)過程，從而降低了多酚得率。因而初步確定提取黑果枸杞多酚類物質(zhì)的最佳乙醇濃度為50%。

2.1.2 固液比對多酚得率的影響

固定乙醇濃度50%，超聲功率100 W，超聲時間5 min，超聲溫度30 ℃的條件下，分別按1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）的固液比進(jìn)行超聲波輔助提取黑果枸杞多酚，結(jié)果如圖2 所示（見下頁）。

由圖2 可以看出，隨著固液比的增加，多酚得率隨之增加；當(dāng)料液比為1∶60（g/mL）時，多酚得率達(dá)到最高，再增加料液比多酚得率反而降低，這可能是因為溶劑過多，不僅增加成本，還會增加雜質(zhì)的含量。因此，固液比選擇1∶60（g/mL）用于進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.3 超聲時間對多酚得率的影響

固定乙醇濃度為50%，固液比為1∶60（g/mL），超聲功率為100 W，超聲溫度為30 ℃，在超聲時間分別為5、10、15、20、30 min 的條件下輔助提取黑果枸杞多酚，結(jié)果如圖3 所示。

從圖3 可以看出，隨超聲時間的增加，多酚得率逐漸增加，且在超聲時間為15 min 時，提取液中多酚得率達(dá)到最大值228 mg/g，當(dāng)超聲時間超過15 min 以后，多酚得率開始下降，這是因為長時間的浸提會引起一系列的化學(xué)反應(yīng)[11]，從而引起多酚類物質(zhì)氧化分解。因此，初步確定最佳超聲時間為15 min。

2.1.4 超聲溫度對多酚得率的影響

固定乙醇濃度為50%，固液比為1∶60（g/mL），超聲功率為100 W，超聲時間為15 min，在超聲溫度分別為30、40、50、60、70 ℃的條件下進(jìn)行超聲波輔助提取黑果枸杞多酚，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 超聲溫度對黑果枸杞多酚得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

從圖4 可以看出，當(dāng)超聲溫度低于50 ℃時，多酚得率隨溫度的升高而逐漸增加；當(dāng)超聲溫度達(dá)到50 ℃時，多酚得率達(dá)到最大值，這是因為較高的溫度可能會降低溶劑黏度，引起較大的分子運動[12]，從而增加溶解度。之后隨溫度的升高，多酚得率逐漸減少，原因是隨著溫度的升高，提取液中部分多酚物質(zhì)可能發(fā)生分解。由此確定最佳超聲溫度為50 ℃。

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗

根據(jù)表2 中的編碼與水平，進(jìn)行Box-Benhnken 試驗設(shè)計，以乙醇濃度（A）、固液比（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）4 個工藝條件為考察因素，黑果枸杞多酚得率（Y）為響應(yīng)值，并利用Design expert 8.0.6 軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見表2、3。

利用Design expert 8.0.6 軟件對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到黑果枸杞多酚得率（Y）與自變量乙醇濃度（A）、固液比（B）、超聲時間（C）、超聲溫度（D）的二次多項回歸模型方程如下：Y=230.41+22.66A+27.35B+3.10C+25.75D-2.3AB+5.92AC-2.00AD+6.54BC-8.02BD-8.66CD-29.45A2-32.79B2-25.03C2-20.07D2。

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and result of response surface method

方程中各項系數(shù)絕對值的大小可反映各因素對響應(yīng)值的影響水平，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。由于該方程的二次項系數(shù)均是負(fù)的，可推斷由該方程表示的拋物面是向下的，具有最大值并可以被優(yōu)化分析。觀察方程的一次項系數(shù)可知，影響黑果枸杞多酚得率因素的主次順序為超聲溫度（D）＞固液比（B）＞乙醇濃度（A）＞超聲時間（C）。對以上模型進(jìn)行方差分析的結(jié)果見表3。

由表3 可以看出，各因素中一次項A（乙醇濃度）、B（固液比）、D（超聲溫度）對Y（黑果枸杞多酚得率）影響極顯著，而C（超聲時間）影響不顯著；二次項（A2、B2、C2、D2）的P值均低于0.05，說明其對響應(yīng)值有顯著影響，而交互項（AB、AC、AD、BC、BD、CD）的P值均大于0.05，說明其對結(jié)果影響不顯著。

表3 響應(yīng)面二次回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for response quadratic regression equation

從整體分析，該回歸方程的F值為16.18，概率P＜0.000 1，表明模型顯著，失擬項F值為1.69，概率P=0.324 4＞0.05，失擬項不顯著，表明該回歸方程在整個回歸區(qū)域的擬合情況良好,可用該模型對試驗進(jìn)行分析和預(yù)測。R2=0.941 8，說明預(yù)測值和實測值之間具有高度的相關(guān)性；變異系數(shù)c.v.=6.85%，說明該回歸方程精密度良好，因此，可用此模型對黑果枸杞中多酚得率進(jìn)行分析預(yù)測。

2.2.2 單因素交互作用

響應(yīng)面反映的是乙醇濃度、固液比、超聲時間和超聲溫度四個所考察因素中任意兩個取零水平時，剩余兩個因素相互作用對黑果枸杞多酚得率的影響。從響應(yīng)面曲線的坡度和等高線的形狀可以得出影響黑果枸杞多酚得率的因素之間的相互作用（圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓表示兩因素之間的顯著交互作用）。黑果枸杞多酚得率與各工藝條件之間的響應(yīng)面和等高線圖如圖5～10 所示。

圖5 乙醇濃度和固液比對黑果枸杞多酚得率的交互影響Fig.5 Interaction of ethanol concentration and solid-liquid ratio on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

圖6 乙醇濃度和超聲時間對黑果枸杞多酚得率的交互影響Fig.6 Interaction of ethanol concentration and ultrasonic time on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

圖7 乙醇濃度和超聲溫度對黑果枸杞多酚得率的交互影響Fig.7 Interaction of ethanol concentration and ultrasonic temperature on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

圖8 固液比和超聲時間對黑果枸杞多酚得率的交互影響Fig.8 Interaction of solid-liquid ratio and ultrasonic time on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

圖9 固液比和超聲溫度對黑果枸杞多酚得率的交互影響Fig.9 Interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic temperature on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

圖10 超聲時間和超聲溫度對黑果枸杞多酚得率的交互影響Fig.10 Interaction between ultrasonic time and ultrasonic temperature on polyphenol yield of Lycium ruthenicum

由圖5～10 可以看出，固液比和超聲溫度相互作用的響應(yīng)面曲線最陡，等高線最扁，說明固液比和超聲溫度對黑果枸杞多酚得率的交互作用最為顯著；同理可得，超聲時間和超聲溫度對黑果枸杞多酚得率的交互作用最不顯著。

2.2.3 預(yù)測值的驗證

通過回歸模型的預(yù)測，超聲波輔助提取黑果枸杞中多酚類物質(zhì)的最佳工藝條件為乙醇濃度53.6%、固液比1∶63.4（g/mL）、超聲時間15.3 min、超聲溫度55.4 ℃，在此條件下，多酚的最大得率為246.238 mg/g。為檢驗該方法的可靠性，結(jié)合操作的便利性，將各工藝條件調(diào)整為乙醇濃度54%、固液比1∶63（g/mL）、超聲時間15 min、超聲溫度55 ℃，對修正后的工藝進(jìn)行三次平行驗證性試驗，得到黑果枸杞多酚得率的平均值為244.86 mg/g，與模型預(yù)測值246.238 mg/g 相比，其相對誤差為0.56%，說明該模型有效、可靠。

2.3 超聲波輔助提取法與傳統(tǒng)溶劑提取法的比較

傳統(tǒng)溶劑提取法得到的黑果枸杞中的多酚得率為213.82 mg/g，與超聲波輔助法比較，多酚得率下降了14.51%。這是因為超聲波的高速、強(qiáng)空化和攪拌作用，促使植物組織細(xì)胞破裂或變形，加速了溶劑對樣品的滲透，并在溶劑中迅速溶解多酚。

2.4 硫酸銨加入量對多酚回收率的影響

(NH4)2SO4加入量對黑果枸杞多酚得率的影響如圖11 所示。當(dāng)(NH4)2SO4加入量為0.3 g 時，黑果枸杞多酚的回收率達(dá)到最高，為80.27%。(NH4)2SO4用量的增加導(dǎo)致析相作用增強(qiáng)，乙醇相中乙醇的相對濃度增大，以及酚類物質(zhì)在乙醇相中溶解度的增加；當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量濃度過高時，反而會導(dǎo)致無機(jī)鹽相增大而有機(jī)相減小，從而降低黑果枸杞多酚的回收率。

圖11 (NH4)2SO4 加入量對黑果枸杞多酚回收率的影響Fig.11 Effect of ammonium sulfate addition on polyphenol recovery of Lycium ruthenicum

3 結(jié)論

通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗得到超聲波輔助提取黑果枸杞多酚的最佳工藝條件：乙醇濃度54%、固液比1∶63（g/mL）、超聲時間15 min、超聲溫度55 ℃，對修正后的工藝進(jìn)行三次平行驗證性試驗，得到黑果枸杞多酚得率的平均值為244.86 mg/g，與模型預(yù)測值246.238 mg/g 相比，其相對誤差為0.56%，說明該模型可預(yù)測理論得率并用于黑果枸杞多酚提取條件的優(yōu)化。相比于傳統(tǒng)方法，超聲波輔助提取黑果枸杞多酚得率提高了14.51%，可顯著縮短提取時間，提高效率，提取效果好。