關于微生物法測定米粉中維生素B6含量不確定度評估

戴明男

摘 要：為確定微生物法測定米粉中維生素B6含量的不確定度，本文利用SHP-250型生化培養箱，依據GB 5009.154—2016第二法操作指導，進行了米粉中維生素B6的測定。并從樣品稱量、樣品稀釋定容、樣品測量等方面，分析了微生物測定米粉中維生素B6含量不確定度來源。樣品稱量、樣品稀釋定容、樣品測量均可以引入維生素B6含量測定不確定度，需要測定操作者從儀器、操作、環境等多個方面嚴格控制，減小含量測定偏差。

關鍵詞：微生物法;米粉;維生素B6;含量;不確定度

維生素B6又可稱之為吡哆素，包括吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺等多個成分，可溶于水，參與人體多種代謝反應。維生素B6是米粉中重要營養組成之一，但因含量處于較低的水平，測定難度較大。《食品安全國家標準 食品中維生素B6的測定》（GB 5009.154—2016）規定了食品中維生素B6的含量測定方法，微生物法為標準第二法，適用于不同類別食品中維生素B6的測定。本文評估了利用GB 5009.154—2016第二法測定米粉中維生素B6含量的不確定度。

1 材料與方法

1.1 材料

SHP-250型生化培養箱、Thermo酶標檢測儀、多管式旋渦混合器、水浴鍋、0.2 μm無菌濾膜[1]。市售嬰幼兒配方米粉、維生素B6標準品（≥99.0%），檸檬酸鹽緩沖液（pH為4.5）、馬鈴薯酸性磷酸酶、無菌水。

1.2 實驗方法

1.2.1 操作步驟

在250 mL錐形瓶內，放入2.5 g米粉樣品，利用單標線吸量管加入0.05 L檸檬酸鹽緩沖液后、0.025 L馬鈴薯酸性磷酸酶，在多管式旋渦混合器內混合均勻。進而放置在無光照直射的37.0 ℃室溫環境中，孵育60 min，間隔手動振蕩[2]。孵育完畢后，加入0.1 L滅菌水逐級稀釋，在95.0 ℃水浴鍋內振蕩，在短時間內冷卻至室內溫度后過濾、無菌離心取上清液[3]。進而依據GB 5009.154—2016第二法，配制0 mg/100 g、0.002 mg/100 g、0.004 mg/100 g、0.006 mg/100 g、0.008 mg/100 g的標準品溶液。取微孔板條，在30.0 ℃無光照直射條件下孵育。孵育后，在Thermo酶標檢測儀中，選擇630 nm波長，進行吸光度讀取[4]。

1.2.2 測定計算

GB 5009.154—2016第二法規定米粉中維生素B6含量需要依據下式進行計算：

式（1）中：X為維生素B6含量，C為樣品在標準曲線下讀取的濃度，n為稀釋倍數，m為樣品量[5]。其中維生素B6含量的相對標準不確定度為：

式（2）中：Urel（X）為維生素B6含量的相對標準不確定度，Urel（C）為樣品在標準曲線下讀取的濃度的標準不確定度，Urel（n）為稀釋倍數的標準不確定度，Urel（m）為樣品量的標準不確定度。

2 結果與分析

2.1 樣品稱量引入的不確定度

用電子天平精準稱量樣品2.500 1 g，天平精確度為0.1 mg。

由天平鑒定證書可知天平最大重復性誤差為0.15 mg，在稱取量大于0 g但小于50 g時，指示數值誤差為0.1 mg。利用矩陣分布包含因子為k（）的B類不確定性標定，得出標準不確定度為0.1/=0.057 1，合成標準不確定式。則樣品稱量時的相對不確定度為0.080 75/2.500 1≈0.032 30。

2.2 樣品稀釋定容引入的不確定度

上述操作用儀器均為玻璃材質，玻璃材質校準、溫度干擾均對液體體積具有影響，進而引發維生素B6測定偏差。根據最大允許誤差，依據包含因子k為的均勻分布處理方法進行不確定度分量計算，可得出5 mL單標線吸量管最大允許誤差為±0.015，不確定度為0.008 66，相對不確定度為0.001 68;而250 mL單標線容量瓶最大允許誤差為±0.15，不確定度為0.086 6，相對不確定度為0.000 339，合成剝離器具校準引入的不確定度分量為。

考慮到微生物測定區域溫度變化幅度在5.0 ℃左右，水膨脹系數為0.000 21 ℃，依據包含因子k為的矩形分布計算可知，因室溫變化而引起的相對標準不確定度為

0.000 21×5/。合成溫度變化引起的操作用儀器相對不確定度分量可得出結果為0.000 857 0，則樣品稀釋形容引入的不確定度就為。

2.3 樣品測量中引入的不確定度

樣品測量不確定性主要源于測量重復性。對定值樣品中的維生素B6含量進行平行測定，測定次數為8，得出結果分別結果如表1所示。根據貝塞爾公式，計算得出標準不確定度，相對標準不確定度約等于0.000 363。則微生物法測定米粉中維生素B6的總不確定度為：0.032 30+0.087 034 2+0.000 363=0.119 697 2。

3 結論

微生物法測定米粉中維生素B6含量不確定度主要來源于樣品稱量、樣品稀釋定容、樣品測量等幾個環節，涉及了標準品純度、天平自身精密度、移液器與容量瓶容差、樣品測定重復性、試驗環節溫度變化等幾個方面。測定人員應嚴格依據GB 5009.154—2016的要求，進行微生物法操作，為米粉安全監管提供充足支持。

參考文獻

[1]羅彤，付文雯，黃坤，等.微生物法測定嬰幼兒乳粉中維生素B12含量的不確定度評定[J].食品安全質量檢測學報，2021（1）：94-100.

[2]宋玉霞，田妮娜.微生物檢定法測定乙酰螺旋霉素片含量的不確定度評定[J].中國醫藥指南，2017（34）：17-18.

[3]郭芯岐，張敏.微生物檢定法測定注射用乳糖酸紅霉素含量的不確定度評價[J].海峽藥學，2017（4）：65-68.

[4]李芳，范孝英，賴夢書，等.微生物法測定雞樅菌中葉酸含量不確定度評估[J].中國口岸科9學技術，2021（3）：16-20.

[5]商迎輝，章麗娜，李夢潔，等.微生物法測定嬰幼兒配方食品中生物素的不確定度評估[J].中國食品學報，2019（10）：221-226.