國際FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證結果與分析

秦婧 王琳帆 魏思宇 陳奕杉 陳鴻劍 鄭玉紅

摘 要：目的：國際FAPAS能力驗證旨在評估實驗室對于金黃色葡萄球菌的檢測能力，加強實驗室質量管理。方法：依據FAPAS作業指導書及GB 4789.10—2016第二法（平板計數法）對乳粉中金黃色葡萄球菌進行定量檢測，并用兩種國產配套試劑進行比對。結果：采用北京陸橋配套試劑檢測樣品的菌落總數上報結果為1.0×105 CFU/g，且兩種國產配套試劑檢測結果均在能力驗證結果范圍內。結論：國際FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證結果評價為滿意，Z值為0，上報結果是此次能力驗證的指定值。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌;能力驗證;定量檢測;FAPAS

能力驗證是利用實驗室間比對，按照預先制定的準則評價參加者的能力的外部質量活動，尋求并參加能力驗證是合格評定機構的責任和義務[1]。英國FAPAS分析實驗室能力驗證（Food Analysis Performance Assessment Scheme）是專門從事食品檢測分析方面的能力評估體系，通過實驗室間測試結果的比對來判定實驗室能力的合格評定活動。FAPAS為世界約3 000家實驗室專門提供醫學、食品檢測方面的能力驗證活動;FAPAS建立了一套完整的能力驗證提供者的評價體系。該體系在全世界各國的食品分析實驗室迅速普及，它已是食品分析領域全球第一的國際評價體系[2]。FAPAS在2007年已與CNAS（中國合格評定國家認可委員會）達成互認。為提高檢驗檢測能力和水平，本實驗室參加FAPAS于2021年4月的乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證，希望通過此次FAPAS能力驗證來評估實驗室檢驗人員的能力，維持實驗室檢驗檢測水平。依據的方法是GB 4789.10—2016第二法（平板計數法），并對北京陸橋、廣州環凱兩個廠家生產的檢測配套培養基進行了比對。

1 材料與方法

1.1 試劑

氯化鈉（分析純）來自天津天力化學試劑有限公司;Baird-Parker瓊脂平板、血瓊脂平板、胰蛋白胨大豆瓊脂平板（tryptic soy agar，TSA）、革蘭氏染色液、腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth，BHI）和凍干血漿，均分別來自北京陸橋技術股份有限責任公司和廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器設備

均質器（寧波新芝生物科股份有限公司 SCIENTZ-11）;生化培養箱（上海悅豐儀器儀表有限公司SPX-150B-Ⅱ）;生物顯微鏡（奧林巴斯廣州工業有限公司 CX23）;可調式混勻儀（大龍興創實驗儀器北京股份有限公司 MX-S）;生物安全柜（上海博訊實業有限公司醫療設備廠 BSC-1300ⅡA2）。

1.3 方法

1.3.1 能力驗證樣品的接收和確認

實驗室收到FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌能力驗證樣品1份，樣品編碼是M263E14，樣品為10 g乳粉，塑料瓶包裝，并確認樣品完整性。

1.3.2 能力驗證樣品的前處理和水化

根據FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌（M263E14）能力驗證作業指導書的說明，開啟樣品前應先將樣品放置在室溫下30 min。在二級生物安全柜中以無菌操作開啟樣品，將樣品置于提前準備好的無菌均質袋中，用少量無菌生理鹽水充分沖洗樣品容器并將其吸入到放有樣品的均質袋中，最終使水化的生理鹽水總量為90 mL，用均質器充分混勻，即為10-1樣品勻液。后續依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）第二法（平板計數法）進行檢測分析。

1.3.3 樣品的稀釋

該步驟在生物安全柜中以無菌操作進行。用1 mL無菌吸管吸取10-1樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL生理鹽水的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液面），充分振搖試管，制成10-2的樣品勻液。按以上操作程序，依次制備10-3、10-4樣品勻液。后續操作分別使用北京陸橋和廣州環凱生產的配套試劑進行檢測分析。

1.3.4 樣品的接種和培養

在3個B-P平板上分別加入0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL樣液進行涂布。由于GB 4789.10—2016第二法（平板計數法）存在涂布不均勻和B-P平板接種量較大不易吸收的情況，故同時在5個B-P平板上各加入0.2 mL樣液進行涂布。注意B-P平板應提前一天配制并放于冰箱冷藏，因為新鮮配制的B-P平板表面易有水珠。涂布后，將平板靜置10 min，如樣液不易吸收，可將平板放在培養箱（36±1） ℃培養1 h，等樣品勻液吸收后翻轉平板，倒置放于（36±1） ℃培養24～48 h。

2 結果與分析

2.1 菌落計數及鑒定

樣品培養48 h后，北京陸橋和廣州環凱的B-P平板上均僅有一種菌落，且菌落呈黑色、有光澤、表面光滑、凸起、濕潤、有淺色的邊緣，周圍繞以不透明圈，其外有一清晰帶，依據GB 4789.10—2016第二法確定其為典型菌落。將10-3稀釋度的菌落依據GB 4789.10—2016進行血平板劃線、染色鏡檢、血漿凝固酶試驗。結果如表1、表2所示。

2.2 討論

3個B-P平板上分別加入接種量為0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的樣液，采用北京陸橋配套試劑檢測樣品的菌落總數結果為1.0×105 CFU/g，采用廣州環凱配套試劑檢測樣品的菌落總數結果為9.3×104 CFU/g;5個B-P平板上各加入接種量為0.2 mL的樣液，采用北京陸橋配套試劑檢測樣品的菌落總數結果為1.1×105 CFU/g，采用廣州環凱配套試劑檢測樣品的菌落總數結果為9.8×104 CFU/g。樣液接種量為0.2 mL的方法，采用北京陸橋和廣州環凱試劑的樣品菌落總數檢測結果均要大于樣液接種量分別為0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的方法，因為GB 4789.10—2016第二法（平板計數法）本身存在接種量較大和涂布不均勻的情況，沒有接種量為0.2 mL的方法有利于菌落生長，這一點與已有陸其聰等人[3]與王洪亮等人[4]的相關研究一致。因為本次FAPAS能力驗證采用方法為GB 4789.10—2016第二法（平板計數法），日常樣品檢測采用北京陸橋配套試劑，故上報結果為1.0×105 CFU/g。此次國際FAPAS乳粉中金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證結果評價為滿意，且Z值為0，說明上報結果是為此次能力驗證指定值，由此可見該實驗室具備金黃色葡萄球菌定量檢測分析能力。

3 注意事項

對于新取得檢驗檢測資質的微生物實驗室來說，承接能力驗證前需要進行大量的準備工作，現就準備工作做一個總結，以期為新實驗室或新進檢測人員提供參考。

①準備工作。得知要參加能力驗證后應提前準備相關試劑、器具和設備，如提前驗證商品化培養基，提前準備所用三角瓶和試管，且不與日常檢測相混淆，提前確定使用的培養箱是否潔凈、是否在計量有效期內等。②作業指導書。收到樣品后，應首先確認樣品的完整性并記錄收樣日期，不要急于準備相關試劑，應先制定作業指導書和確定檢驗依據。③試劑配制。新鮮配制的B-P平板較軟、不好涂布，應提前1 d配制并在第2 d使用;使用前確認B-P平板干燥、無水珠，若有水珠可提前放置在培養箱中待水珠消失;9 mL生理鹽水應在使用時分裝，不可分裝好后再滅菌，因為滅菌過程中會使9 mL生理鹽水增加或減少，影響結果準確性。④試驗操作。樣品應提前從冰箱中取出并恢復至室溫，可安排兩人同步試驗，一人取樣并進行10-1倍稀釋，稀釋好后，兩人分別進行后續稀釋和加樣，進行人員比對;涂布時每個稀釋梯度使用一根涂布棒，不可每個B-P平板用一根涂布棒，會造成樣液損失，影響結果準確性;注意整個操作應在20 min內完成，因為細菌20～30 min繁殖一代[5];完成試驗后，若B-P平板上樣液不吸收，可將平板放在培養箱（36±1） ℃培養1 h，等樣品勻液吸收后翻轉平板，倒置培養。⑤計數。按照檢驗依據所描述的菌落形態進行典型和可疑菌落計數，并一定拍照保存，平板前后均要拍照，平板背面更方便觀察典型菌落透明圈，便于識別典型菌落，照片可作為科室學習資料保存。

參考文獻

[1]中國合格評定國家認可委員會.能力驗證規則：CNAS-RL02：2016[EB/OL].（2016-04-15）[2021-05-21].https：//www.docin.com/p-1699040362.html.

[2]陳萬勝，馬莉，亓瀟.國際FAPAS乳粉中沙門菌屬能力驗證的關鍵點[J].河南預防醫學雜志，2020，31（12）：900-903.

[3]陸其聰，鐘宇思，王立博，等.金黃色葡萄球菌定量檢測能力驗證結果與分析[J].食品研究與開發，2017，38（16）：153-156.

[4]王洪亮，程艷宇，王夢曉.食品中金黃色葡萄球菌定量檢測方法的研究[J].食品研究與開發，2016，37（9）：185-187.

[5]雷蘭蘭.食品微生物能力驗證的重要因素[J].現代食品，2018（16）：4-6.