石墨烯泡沫支架緩釋netrin-1促進糖尿病大鼠創面愈合的研究

廉潔 秦金保 祝聯

糖尿病患者創面難以愈合是臨床常見且較為棘手的問題。若得不到及時有效的治療，會出現進一步的創傷性感染、骨髓炎等[1]。糖尿病血管病變是其主要原因，發病機制復雜，包括高血糖導致糖基化終產物的形成、氧化應激反應等。

研究表明，再生支架是促進皮膚損傷修復的可行方法。明膠-甲基丙烯胺(GelMA)結合了天然和合成水凝膠的特點，已被證實是一種很有前途的三維組織構建支架材料[2]。然而，由于GelMA的生物力學性能和抗菌性能較差，其在創面修復領域的應用受到限制。石墨烯具有優異的力學性能、熱學性能、導電性和生物相容性，以石墨烯為基質的支架可以調節多種細胞的生長、相互作用和細胞遷移，如人胚胎干細胞和間充質干細胞等[3]。我們的前期研究發現，石墨烯泡沫能夠促進神經細胞的遷移、增殖和分化[4]。研究表明，石墨烯在體內通過中性粒細胞髓過氧化物酶溶解，經腎臟排泄清除，具有良好的生物降解性[5]。

血管再生是糖尿病創面修復的關鍵。神經軸突導向生長因子-1(netrin-1)被認為是一種有前途的促血管再生的細胞因子。研究顯示，netrin-1 通過下游分子通路增加NO的生成，減少氧自由基的產生，防止內皮功能受損，并能夠促進血管內皮祖細胞的遷移，促進血管生成[6]。

我們之前利用化學氣相沉積(CVD)法制備石墨烯泡沫支架并填充水凝膠GelMA，利用藻酸鹽對水凝膠進行滲透，并通過雙網絡結構改善凝膠的力學性能，同時負載netrin-1，使其滲透到雜化水凝膠中達到緩釋目的[4]。本研究中，我們對搭載netrin-1的石墨烯泡沫水凝膠支架在糖尿病大鼠創面中的療效進行研究，具體報道如下。

1 材料與方法

實驗動物：30只6～8周齡GK大鼠，體質量約200 g，雌雄不限；10只雄性BALB/c裸鼠，6周齡(南京君科生物工程有限公司)。

實驗材料：人臍靜脈內皮細胞系，內皮細胞完全培養基(上海中喬新舟生物科技有限公司)；兔抗細胞角蛋白(CK19)多克隆抗體(Santa Cruz，美國)；磷酸緩沖液，Matrigel凝膠，Gelatin(Sigma，美國)；鎳網(常州康威醫療器械有限公司)；CCK8試劑(Abcam，英國)。

1.2 人臍靜脈內皮細胞系(hUVECs)的復蘇和傳代

快速在37 ℃水浴槽中解凍hUVEC細胞，轉移至生物安全柜。在15 mL離心管中添加9 mL內皮細胞培養基，逐滴加入hUVEC細胞，輕柔混勻，1 500 r/min離心5 min。棄上清，用培養基重懸細胞后，接種至培養瓶中，在37 ℃、5%CO2和95%濕度條件下培養細胞，次日更換培養基。當細胞融合至80%左右時，進行傳代。

1.3 皮膚支架的制備及生物相容性檢測

制備方法參考文獻[4]。首先合成石墨烯/鎳網片，接著合成GelMA和雜化水凝膠前體溶液，最后通過紫外照射和離子化促進水凝膠支架的快速固化。4 ℃時，將合成的石墨烯泡沫水凝膠皮膚支架置于含100 ng/mL netrin-1的PBS溶液中15 min，使水凝膠成分充分吸收netrin-1，形成具有緩釋功能的netrin-1+石墨烯泡沫水凝膠皮膚支架。

雄性BALB/c裸鼠10只，隨機分為2組，實驗組將直徑1 cm的支架植入裸鼠背部，對照組小鼠注射相同體積的PBS溶液。術后2周切取支架及周圍皮膚進行組織學檢測觀察損傷及炎癥情況(圖1)。

圖1 石墨烯泡沫水凝膠支架大體觀察(左，標尺=500 μm)和裸鼠皮下植入術(右，標尺=500 μm)Fig.1 Gross observation of graphene foam gel scaffold (Left, scale bar=500 μm) and subcutaneous implantation of scaffold in nude mice (Right, scale bar=500 μm)

1.4 支架材料的細胞毒性檢測

將石墨烯泡沫水凝膠支架和荷載netrin-1的石墨烯泡沫水凝膠支架分別剪成直徑≤5 mm的片狀顆粒，4 ℃浸泡于DMEM溶液24 h，分別收集提取兩種浸出液，以DMEM為對照組，分別與100 μL的hUVECs共孵育于96孔板中。24 h、48 h和72 h后采用CCK-8試劑盒檢測各組細胞光密度值。

1.5 大鼠皮膚缺損修復實驗

選用30只GK大鼠，建立糖尿病大鼠皮膚缺損模型后分為3組：空白對照組(n=10)、支架組(n=10)和支架+netrin-1組(n=10)。支架+netrin-1組：大鼠背部手術，形成直徑10 mm全層皮膚缺損，將負載netrin-1的支架材料移植覆蓋于創面，材料上覆蓋硅膠膜，并縫合固定于創面周圍皮膚，避免移位；支架組：將單獨的支架材料移植覆蓋于創面；空白對照組：不給予創面特殊處理。術后第3、7、14天觀察各組動物的創面愈合情況。術后第7、14天每組分別取材5只大鼠，HE染色觀察組織學變化，Masson染色觀察膠原合成情況，CK19免疫組化染色觀察上皮細胞生成情況。

1.6 統計方法

2 結果

2.1 石墨烯水凝膠皮膚支架具有良好的生物相容性和低生物毒性

HE染色顯示支架材料周圍組織在細胞密度、支架降解以及膠原形成和排列方面與對照組無明顯差異。植入支架的小鼠皮膚未見明顯的組織損傷和炎癥改變，說明該支架具有良好的生物相容性。CCK-8實驗發現，24 h時3組細胞增殖無明顯差異；48 h時支架組和支架+netrin-1組的細胞增殖明顯優于對照組(P<0.05)，且這2組間未見明顯差異；72 h時支架+netrin-1組細胞增殖明顯優于其他兩組(P<0.05)，而支架組和對照組之間無明顯差異。說明支架具有較低的生物毒性(圖2、3)。

A：對照組；B：實驗組A: Control group; B: Experimental group圖2 支架材料植入裸鼠皮膚2周后HE染色(標尺=200 μm)Fig.2 HE staining was performed 2 weeks after the scaffold was implanted into the skin of nude mice (scale bar=200 μm)

圖3 石墨烯泡沫水凝膠支架材料的生物毒性檢測(**： P<0.01)Fig.3 Toxicity test of graphene foam hydrogel scaffold (**: P<0.01)

2.2 Netirn-1/石墨烯水凝膠支架通過增加血管生成，促進細胞外基質沉積，促進創面的愈合

術后第3天時，各組之間創面大小無明顯差異，表面覆蓋分泌物，其中支架+netrin-1組的創面較其他組基底更紅潤，表面分泌物較少。術后第7天時，所有創面均已結痂，支架組和支架+netrin-1組出現部分上皮化，其中支架+netrin-1組上皮化程度明顯優于支架組。術后第14天時，支架組和支架+netrin-1組的水凝膠脫落，支架+netrin-1組創面面積最小，皮膚縫隙關閉較其他組更好，空白對照組仍殘余部分痂皮未脫落(圖4)。

圖4 各組創面第3、7、14天時的大體觀察(標尺=50 μm)Fig.4 Gross observation of wound in each group 3, 7 and 14 days after implantation (scale bar=50 μm)

HE染色顯示，術后第3、7天時，支架+netrin-1組的上皮化程度和真皮再生的厚度均明顯優于其他組，炎癥反應和瘢痕殘留均較其他組減輕(圖5)。

圖5 各組創面第7、14天時的H&E染色(標尺=50 μm)Fig.5 HE staining of wound in each group 7 and 14 days after implantation (scale bar=50 μm)

Masson染色顯示，術后第7、14天時，支架+netrin-1組的真皮膠原沉積量明顯大于另外2組，提示netrin-1可能促進成纖維細胞的膠原合成和增加了細胞外基質沉積(圖6)。

圖6 各組創面第7、14天時的Masson染色(標尺=200 μm)Fig.6 Masson staining of wound in each group 7 and 14 days after implantation (scale bar=200 μm)

CK19指細胞角蛋白19片段，是上皮細胞的特征性蛋白組分，在多種正常上皮組織中存在。為了進一步驗證創面上皮化的程度，我們進行了CK19的免疫組織化學染色。結果顯示，支架+netrin-1組表皮厚度明顯大于其他2組，支架組的上皮厚度明顯大于對照組，提示石墨烯泡沫水凝膠支架或者netrin-1可能促進角質細胞的遷移和增殖，有利于創面愈合(圖7)。

圖7 各組創面第7、14天時CK19免疫組化染色(標尺=200 μm)Fig.7 CK19 immunohistochemical staining of wound in each group 7 and 14 days after implantation (scale bar=200 μm)

3 討論

目前已報道的用于糖尿病創面皮膚修復的支架材料，包括天然和人工合成支架，存在黏附性差、韌性不足及生物相容性不高等缺點，在臨床中通常不被推薦使用[7]。石墨烯的優異機械性能使其在蝕刻鎳后仍能保持其形狀，起到增強支架形態作用。石墨烯支架的韌性與皮膚相似，彌補了單純水凝膠支架力學性能較差的缺點，并且石墨烯水凝膠支架的緩釋特性適宜搭載促進愈合的生物因子應用于創面修復。有研究將氧化石墨烯與經過改性的膠原-殼聚糖復合膜結合制備復合生物膜，其上負載堿性FGF，用于修復創面。這種新型藥物傳送系統，可避免藥物在體外和體內應用時出現突釋，過早喪失生物活性，可明顯促進皮膚缺損修復[8]。

近年來，干細胞和血管營養因子被用于提高皮膚再生的效率。netrin-1是一種神經軸突導向生長因子，其結構高度保守，目前已知的家庭成員有netrin-1～4，其受體主要有結腸癌缺失蛋白(DCC)和不協調蛋白5(UNC5)。在糖尿病相關研究中，netrin-1的功能比較突出，可通過DCC-ERK1/2通路增加NO的生成，減少氧自由基的產生，增強內皮細胞的功能；另外，由于內皮細胞成管與VEGF相關信號通路密切相關，不同濃度的netrin-1 可以激活或抑制VEGF信號通路。我們的前期研究發現，netrin-1的作用具有濃度依賴性，在100 ng/mL的緩釋濃度下，netrin-1可明顯促進內皮細胞成管和RSC96神經細胞的遷移[4]。

本研究以石墨烯水凝膠支架負載netrin-1修復糖尿病創面，石墨烯泡沫支架具有抗炎作用，水凝膠可以緩釋netrin-1促進血管形成，這兩者都是糖尿病創面修復的重要因素。研究結果顯示，石墨烯的生物相容性高且細胞毒性較低；進一步的動物實驗結果顯示，netirn-1/石墨烯泡沫水凝膠支架治療后，創面組織中血管密度和細胞外基質增加，上皮化程度高。因此，netirn-1/石墨烯水凝膠支架可通過血管再生和細胞外基質沉積，促進糖尿病創面的愈合。