“秦氏疼痛方”外敷治療后肢急性軟組織損傷大鼠模型的實驗研究

馮宇 王莉 張妹妹 董宇啟 何荻 李鶴

下肢創傷骨折后伴發的急性軟組織腫脹嚴重影響骨折的后續治療，而目前臨床上的常規方法效果欠佳。炎癥反應已被證實是創傷后軟組織腫脹等早期并發癥的重要病理生理基礎。本研究選取的外用中藥經驗方“秦氏疼痛方”(以下簡稱“疼痛方”)，由全國著名中醫秦亮甫教授提供處方，由上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院中醫科研制，擬通過研究其抗炎作用和機制，為“疼痛方”治療急性軟組織損傷提供更有力的基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要藥物、試劑及儀器

“疼痛方”(粉劑)：方中豨薟草、馬齒莧、防己3種藥共為君藥，黃柏、黃連、生石膏為臣藥，大黃、芒硝、延胡索為佐藥；生理鹽水(浙江天瑞藥業有限公司，批號為113021103)；扶他林乳劑(北京諾華制藥有限公司，批準文號為國藥準字H19990291)。

SPF級健康、雄性、2月齡SD大鼠40只(上海斯萊克實驗動物有限公司)，體質量(251.91±11.08)g，飼養于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，使用許可證號為SYXK(滬)2013-0058。

大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒(SIEMENS，德國)；BCA蛋白定量試劑盒(THERMO，美國)；抗大鼠IκBα抗體及NF-κB p65抗體(CST，美國)。

組織研缽(上海艾雙商貿公司)；恒溫水浴箱(上海方瑞醫療器械廠)；低溫高速離心機(EPPENDORF，德國)；Cobas e601自動生化分析儀(Roche，德國)；BNII特定蛋白分析儀(SIEMENS，德國)；PCR儀(Perkin Elmer，美國)；Western-blot電泳設備(BIO-RAD，美國)；超純水儀(Thermo Fisher，美國)；標準規格酶標儀(ThermoFisher，美國)；超聲清洗器(Cole-Parmer，美國)；酶聯免疫檢測儀(BioTek，美國)；臺式水平離心機(EPPENDORF，美國)；臺式離心機(Coie-Parmer，美國)；渦旋振蕩儀(IKA MS2，德國)；實時定量PCR儀(Roche，美國)；多頭磁力加熱攪拌器(鄭州盛達儀器有限公司)；紫外/可見光光度計(NanoDrop，美國)；ELISA檢測試劑盒(R&D，美國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

成年雄性SD大鼠共40只，隨機分組，正常對照組(正常組)10只，另外30只制作急性軟組織壓榨傷大鼠模型后隨機分為模型對照組(模型組)10只、扶他林乳劑對照組(扶他林組)10只以及“疼痛方”治療組(疼痛方組)10只。

1.2.2 實驗動物麻醉與造模

硫化鈉(8%)麻醉成功后，使用自制軟組織損傷擊打器建立SD大鼠急性軟組織壓榨傷模型，軟組織壓榨傷模型制備參照文獻[1]的方法。造模后，肉眼觀察并查體。擊打后左后肢出現腫脹、青紫、瘀血，但無皮膚破損，單側左后肢跛行，無其他異常情況發生，確認造模成功。

1.2.3 實驗藥物的用藥途徑、方法

造模后6 h開始給藥。正常組、模型組給予常溫生理鹽水紗布濕敷，環繞覆蓋整個左后肢，每次濕敷2 h，間隔10 h后重復1次，共2～4次；扶他林組給予扶他林乳劑外涂于整個左后肢，厚度約3 mm，每次2 h，后用生理鹽水洗凈，間隔10 h重復1次，共2～4次；疼痛方組給予中藥“疼痛方”粉劑，用適量生理鹽水調成糊狀外敷于整個左后肢，厚度約3 mm，每次2 h，后用生理鹽水洗凈，間隔10 h重復1次，共2～4次。

1.2.4 取材與標本制備

本實驗分別于造模后24、48 h，各組取5只SD大鼠進行斷頸處死，在造模局部用手術尖刀快速輕柔割取少量肌肉組織(注意需要沿肌肉纖維走行方向割取，避免對組織標本過度擠壓、夾提、揉攪等)，置于液氮保存。

1.3 試驗指標檢測與方法

1.3.1 大鼠損傷部位組織勻漿的制備與相關炎癥因子表達評估

用電子分析天平稱取已割取的軟組織損傷局部肌肉組織標本，剪碎后勻漿，用低溫高速離心機離心，收集上清液，采用雙抗體夾心ELISA法定量測定IL-1β、IL-6、TNF-α。用酶標儀在450 nm波長下測定光密度(OD)值，通過標準曲線計算樣品濃度。

1.3.2 大鼠損傷部位組織RNA、蛋白的提取以及損傷修復相關基因、蛋白的表達評估

組織勻漿后采用Trizol法提取RNA，用分光光度計檢測總RNA濃度和OD值，定量PCR在ABI 7500實時定量PCR儀中檢測，以聚合酶SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行。PCR循環條件如下：94 ℃變性10 s→60 ℃退火20 s→72 ℃復性延伸30 s，40個循環。重復3次，取均值。采用2-ΔΔCT計算方法計算目的基因相對表達量。引物序列：IL-1β，TAGCAGCTTTCGACAGTGAGG(F)、CTCCAC GGGCAAGACATAGG(R)；IL-6，CCCACCAGGAACG AAAGTCA(F)、TGCCATTGCACAACTCTTTTC(R)；TNF-α，GTAGCCCACGTCGTAGCAAA(F)、AAATGGC AAATCGGCTGACG(R)；NF-κB p65，GCACCCCACC ATCAAGATCAAT(F)、TCTGGATGCGCTGGCTAATG(R)。

用RIPA裂解液提取組織蛋白，以BCA法測定蛋白濃度。蛋白通過SDS-PAGE分離，轉移到PVDF膜，一抗(抗大鼠IκBα抗體及NF-κB p65抗體)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后，二抗室溫震蕩1 h，再次洗滌后，在Odyssey雙色紅外激光成像系統中掃描。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 損傷組織局部IL-1β表達水平

正常SD大鼠肌肉組織中IL-1β含量24 h和48 h檢測值分別為(2.13±0.11) pg/mL和(2.08±0.13) pg/mL。造模成功后，模型組SD大鼠肌肉組織中IL-1β含量24 h和48 h檢測值分別為(4.42±0.42) pg/mL和(3.91±0.26) pg/mL，顯著高于正常組大鼠(P<0.05)，且組內比較顯示，48 h時IL-1β的含量較24 h有所降低，提示組織損傷的自我修復作用，炎癥水平有所控制。扶他林組大鼠肌肉組織中IL-1β含量24 h和48 h檢測值分別為(3.26±0.41) pg/mL和(3.1±0.11) pg/mL，顯著低于模型組(P<0.05)，提示扶他林能顯著緩解軟組織損傷，減少肌肉等局部炎癥因子的釋放。疼痛方組大鼠肌肉組織中IL-1β含量24 h和48 h檢測值分別為(2.97±0.26) pg/mL和(2.36±0.17) pg/mL，顯著低于模型組(P<0.05)，提示“疼痛方”能顯著緩解軟組織損傷，減少肌肉等局部炎癥因子的釋放；同時也低于扶他林組IL-1β水平，提示“疼痛方”在控制炎癥因子釋放、對軟組織損傷的緩解作用方面一定程度上優于扶他林(圖1)。

#：與模型組相比，P<0.05#: Compared with model group, P<0.05圖1 組織IL-1β水平的比較Fig.1 Comparison of IL-1β levels in tissue

2.2 損傷組織局部IL-6表達水平

正常SD大鼠肌肉組織中IL-6含量24 h和48 h檢測值分別為(3.11±0.46) pg/mL和(3.03±0.58) pg/mL。造模成功后，模型組SD大鼠肌肉組織中IL-6含量24 h和48 h檢測值分別為(49.63±4.37) pg/mL和(53.87±4.23) pg/mL，顯著高于正常組大鼠(P<0.05)，且組內比較顯示，48 h時IL-6的含量較24 h有所升高。扶他林組大鼠肌肉組織中IL-6含量24 h和48 h檢測值分別為(32.62±4.12) pg/mL和(38.21±4.20) pg/mL，顯著低于模型組(P<0.05)，提示扶他林能顯著緩解軟組織損傷，減少肌肉等局部炎癥因子的釋放。疼痛方組大鼠肌肉組織中IL-6含量24 h和48 h檢測值分別為(29.67±3.16) pg/mL和(31.56±4.09) pg/mL，顯著低于模型組(P<0.05)，提示“疼痛方”能顯著緩解軟組織損傷，減少肌肉等局部炎癥因子的釋放；同時也低于扶他林組IL-6水平，提示“疼痛方”在控制炎癥因子釋放、對軟組織損傷的緩解作用方面一定程度上優于扶他林(圖2)。

#：與模型組相比，P<0.05#: Compared with model group, P<0.05圖2 組織IL-6表達水平的比較Fig.2 Comparison of IL-6 levels in tissue

2.3 損傷組織局部TNF-α表達水平

正常SD大鼠肌肉組織中TNF-α含量24 h和48 h檢測值分別為(23.38±1.17) pg/mL和(22.73±1.16) pg/mL，造模成功后，模型組SD大鼠肌肉組織中TNF-α含量24 h和48 h檢測值分別為(59.84±5.98) pg/mL和(63.18±5.79) pg/mL，顯著高于正常組大鼠(P<0.05)，且組內比較顯示，48 h時IL-6的含量較24 h有所升高。扶他林組大鼠肌肉組織中TNF-α的含量24 h和48 h檢測值分別為(31.57±1.59) pg/mL和(36.41±3.24) pg/mL，顯著低于模型組(P<0.05)，提示扶他林能顯著緩解軟組織損傷，減少肌肉等局部炎癥因子的釋放。疼痛方組大鼠肌肉組織中TNF-α含量24 h和48 h檢測值分別為(28.35±1.66) pg/mL和(27.96±1.25) pg/mL，顯著低于模型組(P<0.05)，提示“疼痛方”能顯著緩解軟組織損傷，減少肌肉等局部炎癥因子的釋放；同時也低于扶他林組TNF-α水平，提示疼痛方在控制炎癥因子釋放，對軟組織損傷的緩解作用方面一定程度上優于扶他林(圖3)。

#：與模型組相比，P<0.05#: Compared with model group, P<0.05圖3 大鼠組織局部TNF-α水平的比較Fig.3 Comparison of TNF-α levels in tissue

2.4 組織急性損傷期局部特異性基因及蛋白表達水平改變

本研究中，將48 h時的肌肉組織勻漿，提取組織中RNA，利用RT-PCR定量檢測軟組織中mRNA含量，以反映損傷軟組織的各炎癥因子的基因表達水平。48 h時模型組SD大鼠肌肉組織中IL-1β、IL-6、TNF-a和NF-κB p65定量檢測顯示mRNA水平均不同程度高于其他各組，且具有統計學意義(P<0.05)。疼痛方組48 h時大鼠肌肉組織中IL-1β、IL-6、TNF-a和NF-κB p65基因表達量均顯著低于模型組(P<0.05)；同時除了NF-κB p65之外，也在一定程度上低于扶他林組mRNA水平，提示疼痛方能夠在分子基因水平抑制炎癥因子的合成釋放，降低炎癥水平，減少組織損傷，并在一定程度上優于扶他林(圖4)。

#：與模型組相比，P<0.05#: Compared with model group, P<0.05圖4 組織急性損傷期局部特異性基因表達水平改變Fig.4 Changes in local specific gene expression levels during acute tissue injury

NF-κB是參與炎癥反應調控的關鍵性信號通路。其活性主要受上游IκBα磷酸化降解水平影響，被激活后釋放下游核蛋白亞基入核，結合特定DNA序列發揮促轉錄翻譯作用，其中以p65最為重要。本研究發現，模型組的IκBα蛋白水平顯著降低(P<0.05)，提示其磷酸化水平增高，降解增多。而扶他林組和疼痛方組的IκBα水平顯著高于模型組(P<0.05)，磷酸化進程被顯著抑制，提示“疼痛方”具有抑制IκBα磷酸化降解，進而抑制NF-κB活化的作用。此后，進一步觀察了NF-κB下游核蛋白p65的表達情況，發現扶他林乳劑和“疼痛方”確實能夠減少細胞核內p65的蛋白水平，提示p65釋放減少，轉錄入核水平降低。進一步證實了“疼痛方”與扶他林乳劑均具有抑制NF-κB信號通路的生物學作用(圖5)。

#：與模型組相比，P<0.05#: Compared with model group, P<0.05圖5 組織急性損傷期局部特異性蛋白表達水平改變Fig.5 Changes in local specific protein expression levels during acute tissue injury

3 討論

軟組織損傷(Soft tissue injury)是臨床多發病，是指因急性外傷或慢性勞損或其他原因導致的皮膚、肌肉、肌腱、關節囊及神經等組織的病理損傷，但不包括骨骼病變[2]。急性軟組織損傷通常由于外部打擊(如撞擊、碾壓)等引起，出現局部腫脹、淤青、疼痛、功能障礙等癥狀。其主要病理變化為創傷性無菌性炎癥，其主要特征在于局部組織壞死、毛細血管擴張、炎癥細胞浸潤、局部水腫和出血等。

目前，藥物對急性軟組織損傷的抗炎作用評估，絕大多數是使用動物急性軟組織鈍擊損傷模型[1,3-4]，具有造模成功率高、方法簡單、造模時間短等優點[5]。盡管該模型的病因與臨床急性軟組織損傷的病因不同，但由于其病理學和臨床病理學表現相似，因此仍被認為是可靠的急性軟組織損傷模型。本研究中，我們使用自制軟組織損傷擊打器，建立成年雄性SD大鼠急性軟組織壓榨傷模型，以模擬臨床急性軟組織損傷的發生，并評估“疼痛方”對這種損傷的療效。另外，扶他林乳劑通常用于治療臨床上的急性和慢性軟組織損傷，因此我們使用扶他林乳劑作為陽性對照藥物來評估“疼痛方”治療急性軟組織損傷的療效。

急性軟組織損傷主要病理基礎為創傷性無菌性炎癥，其中炎癥細胞在其發病機制中起重要作用。創傷性損傷早期釋放自由基，其隨后破壞局部組織中的細胞。炎癥細胞釋放許多炎癥介質，包括IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、PGE2等，可進一步加劇炎癥細胞的黏附聚集以及炎癥因子的釋放，同時激活新的炎癥反應。在復雜的炎性反應中，IL-1β是整個炎癥持續進展中一直存在的炎性因子， TNF-α是眾多炎性因子中最先釋放分泌的促炎前因子，可導致多種生化作用，如刺激集落刺激因子、血小板生長因子等細胞因子的產生和使T細胞產生IL-2等，從而形成瀑布式炎癥級聯反應[6-9]。IL-6促進嗜中性粒細胞活化和聚集，其水平可反映組織損傷的強度[10-12]。

近年來的研究已經證明，NF-κB在炎癥反應中具有關鍵和核心的調控作用，是調控轉錄多種炎性因子的中心環節和共同通路[13]。NF-κB的活化可以誘導促炎因子(如TNF-α、IL-6和IL-1β)、趨化因子、黏附分子(如ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1)以及一些與炎癥級聯放大相關的酶(如iNOS和COX-2)的基因表達，控制它們的生物合成，進而趨化大量的中性粒細胞等炎性細胞浸潤、聚集到炎癥部位，最終導致炎癥反應[14-15]。活化的NF-κB是一個同源或者異源二聚體，均由NF-κB/Rel家族成員組成，具有與靶基因增強子的特定序列(5′-GGGACHTCC-3′)結合并促進轉錄的能力，而通常所說的NF-κB指的即是p65∶p50復合體。NF-κB激活的經典過程為其與抑制因子IκB家族成員結合，當上游信號導致IκB蛋白的磷酸化并降解時，NF-κB就被釋放出來并向核內遷移，激活靶基因的轉錄。已有研究證實，NF-κB信號通路參與了創傷后軟組織損傷的炎癥反應。炎性因子可激活多種細胞內信號分子，如NF-κB，從而觸發相關基因的表達。在急性軟組織損傷期間，炎癥細胞通過NF-κB途徑參與早期炎癥的各種促炎細胞因子和蛋白酶的分泌。在本項研究中，急性軟組織損傷模型組的NF-κB p65基因水平升高。而扶他林和“疼痛方”的治療均可降低NF-κB p65的基因表達水平，據此我們推測“疼痛方”可抑制組織的NF-κB信號通路，進一步的Western blot檢測結果同樣表明，“疼痛方”的作用可能與NF-κB信號通路的抑制有關。