載絞股藍皂苷納米結構脂質載體對DF大鼠創面愈合及ET-CGRP平衡的影響

李偉 劉濤 李霞 王巧云 白小崗 李哲璽

糖尿病會導致心血管疾病、腎病、視網膜病變、神經病變和下肢糖尿病性潰瘍等并發癥[1]。流行病學調查顯示，糖尿病患者呈增長趨勢。根據世衛組織的報告[2]，糖尿病影響全球4.22億成年人，預計到2045年將達到6.93億[3]，1/4的糖尿病患者會發展為糖尿病足(Diabetic foot，DF)。DF是糖尿病患者致死、致殘的主要原因[4]。

傷口愈合過程需要細胞活化來激活，涉及表皮干細胞(Epidermal stem cells，ESCs)、角質形成細胞、內皮細胞、成纖維細胞，血小板和巨噬細胞等[5]。與健康人群相比，由于血糖水平升高，糖尿病患者創傷的愈合過程變慢。研究表明，糖尿病患者的ESCs沒有接收到對于傷口定位至關重要的信號，導致創面血管生成的減緩，使創面愈合困難甚至遷延不愈[6]。

絞股藍(Gynostemma pentaphyllum)作為一種中草藥，其藥用價值主要在于可調節心腦血管、調血脂、降血糖、抗腫瘤、增強免疫力等[7]。絞股藍的主要活性成分絞股藍皂苷XLⅨ(Gypenosides XLⅨ)可促進組織的損傷修復和創面愈合。與其他皂苷類成分一樣，XLⅨ的性質不穩定，可被腸內菌代謝成多種代謝產物，也能在胃液中被降解[8]，其生物利用度低。納米結構脂質載體(Nanostructured lipid carriers，NLCs)不僅載藥能力高而且生物穩定性好，緩釋效果顯著[9]。本文采用高壓均質法制備載絞股藍皂苷納米結構脂質載體(XLⅨ-NLCs)，并評估XLⅨ-NLCs對ESCs細胞活性的影響，及其對DF創面愈合的修復、血漿內皮素(Endothelin，ET)和降鈣素基因相關肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

100只清潔級成年SD雄性大鼠(延安大學實驗動物中心)，7～8周齡，體質量230～286 g。ESCs(上海欽誠生物有限公司)；單硬脂酸甘油酯(國藥集團藥業股份有限公司)、Maisine35-1和LabrafilM1944 CS(佳法賽公司，法國)；大豆磷脂購自江蘇海泰納米材料有限公司；ET、CGRP的放免藥盒(北京市福瑞生物工程公司)。

YP11-2型磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；Essentia LC-15C高效液相色譜儀(島津公司，日本)；AX205十萬分之一電子天平(Mettler Toledo公司，瑞士)；微納顆粒激光粒徑測定儀(濟南微納顆粒儀器股份有限公司)；透射電鏡HD-2700購于日本日立高新技術有限公司。

1.2 XLⅨ-NLCs的制備

制備XLⅨ-NLCs：將XLⅨ加入到2 mL大豆磷脂中，得到100 μg/mL的XLⅨ，以10 mL去離子水溶解，構成水相，在74 ℃的水浴中持續磁力攪拌。將50 mg的Maisine35-1和20 mg的LabrafilM1944 CS溶解于3 mL體積的三乙胺以獲得油相。將油相滴入到水相中。待體系澄清時，降低轉速，繼續攪拌至總體積的1/3，冰水浴2 h。最后經0.22 μm孔徑濾膜濾過，得到XLⅨ-NLCs。

采用電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)分析XLⅨ-NLCs材料的純度。用原子力顯微鏡(AFM)和透射電子顯微鏡(TEM)表征XLⅨ-NLCs顆粒的粒徑和形狀。廣角X射線衍射(XRD)對XLⅨ-NLCs顆粒的晶體結構進行分析。用動態光學粒度分析儀測定XLⅨ-NLCs的粒徑分布。

1.3 細胞培養

將ESCs培養于37 ℃、5%CO2培養箱中，DMEM培養基中含有10%BSA、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素，pH7.2～7.4。將ESCs細胞分為對照組、NLCs組、XLⅨ組、XLⅨ-NLCs組。對照組，為正常培養無處理的ESCs；NLCs組，正常培養的ESCs使用40 μg/mL NLCs處理12 h；XLⅨ組，正常培養的ESCs使用40 μg/mL的XLⅨ處理12 h；XLⅨ-NLCs組，正常培養的ESCs使用40 μg/mL的XLⅨ-NLCs處理12 h。

1.4 MTT法檢測細胞活力

收集處于對數生長期的ESCs細胞，調整細胞濃度至5×104個/mL，接種于96孔板(100 μL/孔)，37 ℃下培養12 h。以MTT法檢測細胞活力，在24、48和72 h時檢測570 nm處的光密度值(OD)。細胞活性的百分比用作納米脂質顆粒對細胞活力影響的評價指標。

1.5 DF創傷大鼠模型構建

2%的鏈脲佐菌素50 mg/Kg腹腔注射，72 h后尾靜脈取血，測血糖值，血糖≥16.8 mmol/L提示DF大鼠制備成功。大鼠麻醉后在足背部剪開1 cm半徑的圓形皮膚創口，暴露韌帶，手術全程保持自然暴露。

1.6 動物分組與給藥

將100只SD大鼠隨機分為5組：正常組(n=20)、DF組(n=20)、DF+NLCs組(n=20)、DF+XLⅨ組(n=20)、DF+XLⅨ-NLCs組(n=20)。DF組、DF+NLCs組、DF+XLⅨ組、DF+XLⅨ-NLCs組均進行DF造模處理，正常組不制備DF模型，僅給予創傷處理。造模第2天給藥，正常組和DF組不進行藥物干預。DF+NLCs組、DF+XLⅨ組、DF+XLⅨ-NLCs組均進行灌胃給藥，分別給予100 μL的NLCs、XLⅨ和XLⅨ-NLCs，每日1次，連續7 d。

1.7 指標檢測

記錄創傷后7 d的創傷面積，分析各組創傷愈合情況。第8 d，處死大鼠，沿窗口取邊緣約1.0 cm×1.0 cm的皮膚組織，浸泡在40.0%甲醛溶液固定，常規石蠟切片，HE染色，鏡下觀察。取材前獲取大鼠靜脈血3 mL，置于含10% EDTA 30 mL和400 IU抑肽酶的試管中，混勻，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離血漿，-30 ℃冰凍保存。采用放射免疫法測定，并嚴格按照操作說明進行操作。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 XLⅨ-NLCs的物理性質和表征

采用高壓均質法制備XLⅨ-NLCs，粒徑參數通過DLS法測定。結果顯示，XLⅨ-NLCs的直徑為(207.92±21.75)nm(圖1A)。包封率為73.61%±4.55%，載藥量為5.23%±0.58%。透射電鏡觀察，XLⅨ-NLCs形狀為近似球體，納米顆粒分布均勻(圖1B)。

A：動態光散射檢測粒徑大小；B：透射電子顯微鏡觀察NLCs、XLⅨ-NLCs形態(標尺= 100 nm)。A: Dynamic light scattering measurement of particle size; B: Morphological observation of NLCs and XLⅨ-NLCs by TEM (scale=100 nm).圖1 XLⅨ-NLCs的理化性質Fig.1 Physicochemical properties of XLⅨ-NLCs

2.2 XLIX-NLCs對ESCs的細胞毒性

觀察對照組(Ctrl)、XLⅨ組、NLCs組、XLⅨ-NLCs組ESCs細胞的活性(圖2)。與對照組相比，NLCs組與XLⅨ組中ESCs細胞活性均無顯著差異(P>0.05)，而XLⅨ-NLCs組中ESCs細胞活性高于對照組、XLⅨ組和NLCs組(P<0.05)。

*： 與對照組比，P<0.05； #： 與XLⅨ組相比，P<0.05；&：與NLCs組相比，P<0.05。*: Compared with control group, P<0.05; #: Compared with XLⅨ group, P<0.05; &: compared with NLCs, P<0.05.圖2 采用MTT法檢測各組細胞毒性Fig.2 MTT assay was used to detect the cell cytotoxicity in each group

2.3 XLⅨ-NLCs對DF大鼠創面愈合的影響

如圖3所示，傷后7 d時，DF組、DF+XLⅨ組、DF+NLCs組、DF+XLⅨ-NLCs各組的創傷面積均顯著大于對照組(P<0.05)；DF+XLⅨ組、DF+NLCs組、DF+XLⅨ-NLCs組的創傷面積均顯著小于DF組(P<0.05)；DF+XLⅨ-NLCs組的創傷面積均明顯小于DF+XLⅨ組和DF+NLCs組(P<0.05)。

A：各組大鼠足部創傷愈合效果觀察；B：各組大鼠足部創傷面積大小比較($： 與Ctrl組比，P<0.05；*：與DF組比，P<0.05；#： 與DF+XLⅨ組相比，P<0.05；&：與DF+NLCs組相比，P<0.05)；C：各組大鼠足部創傷部位組織HE染色。A: Observation of foot wound healing in each group; B: Comparison of foot trauma area of each group ($: Compared with Ctrl group, P<0.05; *: Compared with DF group, P<0.05; #: compared with DF+XLⅨ group, P<0.05; &: Compared with DF+NLCs group, P<0.05); C: HE staining of the injured parts in each group.圖3 XLIX-NLCs對DF大鼠創面愈合的影響Fig.3 Effects of XLIX-NLCS on wound healing of DF rats

光鏡觀察結果顯示，DF組可見較多炎性細胞，少見成纖維細胞，罕見新生毛細血管；正常組的炎性細胞數量最少，成纖維細胞多，可見散在的新生毛細血管；與DF組相比，DF+NLCs組、DF+XLⅨ組可見少量的炎性細胞，成纖維細胞數量較多，大量新生毛細血管。DF+XLⅨ-NLCs組與DF+XLⅨ組、DF+NLCs組相比，炎性細胞量更少，成纖維細胞數量較多，新生毛細血管較多?？傮w而言，DF+XLⅨ-NLCs組毛細血管增生明顯，成纖維細胞較多且染色較深，炎性細胞少見；DF+NLCs組和DF+XLIX組居中；DF組最差，極少見血管增生，炎性細胞浸潤明顯(圖3C)。

2.4 XLIX-NLCs對DF大鼠ET-CGRP平衡的影響

圖4顯示，與Ctrl組比，DF組、DF+XLⅨ組、DF+NLCs組的ET水平均都顯著上調(P<0.05)，DF+XLⅨ-NLCs組變化不明顯(P>0.05)。與Ctrl組比，DF組、DF+XLⅨ組、DF+NLCs組的CGRP水平均顯著下調(P<0.05)，DF+XLⅨ-NLCs組變化不明顯(P>0.05)。DF+XLⅨ-NLCs組、DF+XLⅨ組、DF+NLCs組中的ET水平都顯著低于DF組，而DF+XLⅨ-NLCs組、DF+XLⅨ組、DF+NLCs組中的CGRP水平都顯著高于DF組(P<0.05)。DF+XLⅨ-NLCs組的ET水平顯著低于DF+XLⅨ組和DF+NLCs組，DF+XLⅨ-NLCs組的CGRP水平顯著高于DF+XLⅨ組和DF+NLCs組(P<0.05)。

A：血液中ET水平；B：血液中CGRP水平；$：與Ctrl組比，P<0.05；a：與DF組比，P<0.05；b：與DF+XLⅨ組相比，P<0.05；c：與DF+NLCs組相比，P<0.05。$: Compared with Ctrl group, P<0.05; a: Compared with DF group, P<0.05; b: Compared with DF+XLⅨ group, P<0.05; c: Compared with DF+NLCs group, P<0.05.圖4 各組大鼠血液ET-CGRP平衡的變化Fig.4 Changes of ET-CGRP balance of rat blood in each group

3 討論

糖尿病患者皮膚損傷后極難愈合。研究表明，表皮干細胞分化和表皮細胞生長障礙、糖代謝紊亂、微血管病變、細胞生長因子受體及基質金屬蛋白酶的表達異常等多種因素，均與糖尿病創面難愈有密切關系。Zhang等[5]的研究顯示，ESCs可主動參與創面修復，并促進創面的再上皮化。ESCs在不同病期糖尿病大鼠皮膚中的分布規律，及其在糖尿病創面愈合過程中的動態變化，提示糖尿病創面表皮干細胞數量顯著減少、活性明顯降低，并存在局部特有的“干細胞庫干涸”現象[10]。皂甙類藥物具有多種藥理活性，對創面愈合具有明顯的改善作用[11]。XLⅨ是一種從中草藥絞股藍中提取出來的皂苷。研究發現，XLⅨ不僅可改善組織的損傷、調節機體炎癥平衡，特別是對神經損傷[12]和心肌損傷有明顯的改善作用[13]，且對腫瘤細胞的活性有抑制作用[14]。已有報道證實XLⅨ對糖尿病具有潛在的改善作用，例如改善糖尿病心肌病[15]和抗糖尿病[16]。然而，仍缺乏關于XLⅨ對糖尿病創傷修復的研究。本研究結果證實，XLⅨ修復DF大鼠創面效果明顯優于未使用XLⅨ的對照組，而該愈合過程可能與促進表皮干細胞的生長有關。

DF的另一個關鍵影響因素是機體的末梢血管病。末梢血管病變可導致下肢感染趨于嚴重，形成潰瘍并破壞深部組織。血管內皮損傷是DF血管病變的最初原因，血液中高水平的ET是血管內皮細胞損傷的關鍵標志之一；另外，CGRP是一種強的內源性血管舒張劑[17]。ET和CGRP的平衡是調節血管收縮與舒張功能關鍵，兩者的合成、分泌及效應失衡可致血管緊張度改變，直接影響血流動力學的穩定性[18]。本研究發現，DF大鼠的ET水平明顯升高、CGRP水平下降，符合已有的報道。本研究進一步發現，使用XLⅨ灌胃可明顯抑制血液中ET的水平并提高CGRP的水平，表明XLⅨ可通過改善血管病變并增加DF創傷修復效率。

納米材料對創傷愈合、抑制創口感染、組織再生等具有重要作用。固體脂質納米顆粒(SLNs)具有受控輸送系統的多種優勢，代表了親水和親脂活性化合物的良好選擇；沒有生物毒性，可改善藥物的生物利用度和靶向性；可通過生物屏障促進擴散；易制備獲取，其生產過程可以是無溶劑的。多項研究提出，這種載體可改善傷口愈合。Arana等[19]將金盞菊提取物摻入SLNs中，以改善游離提取物的傷口愈合活性。NLCs是繼固體脂質納米粒(SLNs)之后的二代脂質體系，解決了SLNs存在的各種缺點。NLCs由液體脂質和固體脂質的混合物組成，具有更高的負載能力和更大的穩定性[20]。穿心蓮內酯是一種天然的二萜內酯，具有抗炎和抗氧化作用，可改善傷口的愈合活性。然而，穿心蓮內酯的問題與其水溶性低有關。Sanad等[21]將穿心蓮內酯配制成脂質納米載體，然后將其包含在殼聚糖-透明質酸復合海綿支架中，效果良好。本研究中，由于XLⅨ同樣是一種低水溶性和低脂溶性藥物，因此想要發揮其更高的效價，將XLⅨ負載于NLCs中，可能會在藥物利用率上進一步提高。我們通過實驗對比也證實了這一假設。我們構建了載絞股藍皂苷的納米脂質載體XLⅨ-NLCs并鑒定了其理化性質，觀察到XLⅨ-NLCs對創傷修復的作用優于單獨使用NLCs或XLⅨ，并且提高了 CGRP的水平并降低了ET水平。

綜上所述，本研究探討了NLCs-XLⅨ對DF創面修復的改善作用及其潛在的作用機理。盡管NLCs-XLⅨ對DF創面愈合活性的確切機制有待進一步研究，但本研究結果表明NLCs-XLⅨ具有有效的創面愈合活性。因此，NLCs-XLⅨ是一種可用于糖尿病足皮膚創面愈合的新的潛在藥物。