吉富羅非魚肌肉中土臭素含量影響因素分析

東新旭，范立民，宋 超，鄭 堯，裘麗萍，孟順龍，陳家長,

(1.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇無錫 214081；2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，江蘇無錫 214081)

羅非魚又稱為“非洲鯽魚”，原產自非洲的內陸水域，具有適應范圍廣、生長繁殖速度快和抗逆性強等特性[1]，是聯合國糧農組織推薦的優良品種之一[2]。因其具有較好的生長優勢，在我國南方地區被大規模養殖，已成為我國重要的水產養殖品種[3]。但是在羅非魚的養殖過程中，養殖產品常常帶有土腥異味，尤其是在富營養化的淡水養殖池塘中。異味通常是土臭素(GSM)和二甲基異莰醇(2-MIB)[4]引起，在水中的嗅覺閾值濃度為1～10 ng/L，在魚肉中的嗅覺閾值為0.9 μg/L[5]。帶有土腥異味的羅非魚養殖產品，不僅嚴重影響了其食用價值，而且也降低了其商品價值，甚至帶有土腥異味的養殖產品對人體造成損害，食用的安全性受到質疑[6]。

已有研究表明，在水產養殖過程中，大多數的土腥異味問題是由藻類所造成的，特別是在富營養化的淡水養殖池塘中[7]。對于水體中GSM的藻類來源，多認為藍藻是異味源，報道的產土腥味的藍藻有微囊藻、束絲藻、顫藻、魚腥藻、鞘絲藻等屬的種類[8-9]，綠藻門中的柵藻[10]、金藻門中的黃群藻[11]也能產生土腥異味物質，還有淡水魚池中直連藻、小環藻也可能產生土腥異味物質[12]。主要是由于水體土腥異味物質的來源較為復雜多變，環境因子和藻株特異性會對土腥異味的產生造成影響[13]，因此存在著許多的爭議。而魚肉中GSM的產生多被認為是皮膚、鰓等器官通過滲透作用，從水中直接進入魚體內的。目前，水體GSM的來源研究取得了一定的進展，而對于魚類肌肉中GSM來源研究鮮有報道，本研究通過吉富羅非魚在養殖中設置不同餌料投喂率，探究在養殖生產時吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)肌肉中GSM含量的影響因素，以期為改善吉富羅非魚養殖品質提供重要參考。

1 實驗方法和材料

1.1 試驗用魚及飼養方法

實驗開始時間為2020年7月27號，在中國水產科學研究院淡水漁業研究中心開展，試驗周期為50 d。試驗設置5個組，每組各3個平行，每個組分別投喂魚體重的1%、2%、4%、6%、8%的天邦牌淡水魚膨化飼料。養殖前，每個容積為1 000 L圓形養殖PVC桶中均放入2 kg底泥(采自宜興吉富羅非魚養殖池塘)提供土著微生物源。養殖時，每個養殖桶放養30尾規格為(16±2) g的吉富羅非魚(采自宜興吉富羅非魚養殖基地)。整個養殖周期各組均不換水，全程使用增氧泵增氧，不用藥，每天的8:00和14:00各投喂一次。

1.2 養殖水體和吉富羅非魚肌肉中GSM測定方法

SPME-GC-MS固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用方法檢測水中GSM，建立標準曲線，相關系數r為0.998 2，平均回收率范圍為45.28%～49.92%。測定方法為10 mL容量瓶加入2 g NaCl，再加入水樣定容到10 mL，在加熱板上控制溫度60～70 ℃水浴固相萃取GSM，30 min后，取下固相萃取棒放入到GC-MS上測定GSM含量。分別在8月3日、8月17日、8月24日、9月2日、9月14日采集水樣測定水中GSM含量。

在養殖結束時(9月14日)，捕撈各個組的吉富羅非魚，規格見表1，取吉富羅非魚魚肉置于-20 ℃冰箱中冷凍保存。用微波加熱蒸餾的方法[14]提取GSM，準確稱取10 g吉富羅非魚魚肉，置于500 mL蒸餾瓶中，密封，放入微波蒸餾裝置，裝置參考韓萃等[15]所用裝置圖，反應瓶中通入流速70 mL/min的氮氣，微波功率調節為350 W，加熱時間6 min，通過冷凝裝置對餾分降溫，收集瓶置于冰水浴中收集餾分，收集完后密封置于4 ℃冰箱中保存。收集完的樣品檢測采用SPME-GC-MS測定方法,與水體中GSM檢測方法相同。

表1 養殖吉富羅非魚系統不同餌料投喂率吉富羅非魚的生長規格

1.3 水質指標測定、浮游植物計數及相關性研究

水樣采集后的總氮、總磷、氨氮、亞硝酸鹽、硝酸鹽等水質指標按照文獻[16]所提供的方法進行測定。

在與1.2描述的相同時間段，采集水面以下30 cm處的浮游植物樣品，浮游植物樣品采集方法參照文獻[11]。浮游植物鑒定方法參照文獻[17-18]。

水質指標、氮磷比與浮游植物的RDA分析通過Canoco5，水體中GSM和肌肉中的相關性，水質指標、氮磷比、浮游植物與水體中GSM含量相關性，浮游藻類與肌肉中的相關性通過GraphPad Prism 8中的Results-New Analysis-Multiple variable analyses-Correlation matrix進行分析，P>0.05，差異不顯著，P<0.05，差異顯著。

1.4 數據統計和分析

采用Excel 2019和SPSS 22軟件進行數據處理，Canoco5、GraphPad Prism 8進行繪圖。

2 結果

2.1 養殖吉富羅非魚肌肉與水中GSM含量

2.1.1 吉富羅非魚養殖水中GSM含量

如圖1所示，養殖期間，水中平均GSM含量在17.79～42.47 ng/L范圍內，隨著餌料投喂率的逐漸增加，1%～6%水體中GSM呈現逐漸升高的趨勢，6%餌料投喂率水體中GSM含量顯著高于1%餌料投喂率。

圖1 養殖吉富羅非魚養殖系統水體中GSM含量變化分析

2.1.2 養殖吉富羅非魚肌肉中GSM含量

從圖2中可以看出，經過SPSS分析雖然不同餌料投喂率養殖的吉富羅非魚肌肉中GSM含量差異不顯著，但是2%～6%餌料投喂率的吉富羅非魚肌肉中GSM含量相比于其他組含量較低，而8%餌料投喂率的吉富羅非魚肌肉中GSM含量較高，平均GSM可達到1 062.72 ng/kg，吉富羅非魚肌肉中GSM平均含量最低的組為6%餌料投喂率，平均GSM含量為409.77 ng/kg，1%餌料投喂率的吉富羅非魚肌肉中GSM含量較高，平均GSM可達到813.93 ng/kg,。各餌料投喂率組吉富羅非魚肌肉中平均GSM含量由大到小排序為：8%餌料投喂率>1%餌料投喂率>4%餌料投喂率>2%餌料投喂率>6%餌料投喂率。

圖2 不同餌料投喂率吉富羅非魚魚肉中GSM含量的變化

2.1.3 養殖吉富羅非魚系統水體中GSM含量與肌肉中GSM含量相關性分析

經過相關性分析發現，吉富羅非魚養殖系統水體中GSM含量與肌肉中GSM含量相關性不大(r=-0.330，P=0.229)。

2.2 養殖吉富羅非魚系統水質指標含量和浮游植物豐度變化

2.2.1 水質指標變化

如圖3所示，水質指標氨氮含量、硝酸鹽含量和亞硝酸鹽含量隨著餌料投喂率的增加都呈現一個逐漸增加的趨勢，氨氮含量6%和8%餌料投喂率顯著高于1%和2%餌料投喂率，與4%餌料投喂率差異不顯著；硝酸鹽氮含量8%餌料投喂率顯著高于其他各組；亞硝酸鹽含量6%和8%餌料投喂率顯著高于1%和2%餌料投喂率；4%餌料投喂率氮磷比最高，平均氮磷比可達8.03，并且顯著高于1%和2%餌料投喂率氮磷比，6%和8%餌料投喂率平均氮磷比分別達到7.53、7.83，與4%餌料投喂率氮磷比差異不顯著。不同餌料投喂率對吉富羅非魚養殖系統水質因子會產生明顯的影響。

圖3 不同餌料投喂率水體中平均硝酸鹽、氨氮、亞硝酸鹽含量和氮磷比的變化

2.2.2 養殖水體中浮游植物平均豐度的變化

養殖吉富羅非魚系統水樣共進行了5次采集，共檢出綠藻、硅藻、藍藻、甲藻、隱藻、裸藻6門36屬，其中綠藻門種類最多，共22屬，占浮游植物總量的61.11%；其次是硅藻門和藍藻門，均為5屬，共占浮游植物總量的27.78%；之后依次為甲藻門、隱藻門、裸藻門，為2、1、1屬，占浮游植物總量的5.56%、2.78%、2.78%。柵藻、藍藻、硅藻、甲藻占有優勢。養殖吉富羅非魚系統中不同餌料投喂率水體中浮游植物的各個門優勢屬組成見表2，浮游植物優勢屬共20個，1%、6%、8%組中最多，4%組中最少，柵藻屬占浮游植物總豐度的24.37%,微囊藻屬占浮游植物總豐度的6.78%。

表2 養殖吉富羅非魚系統中浮游植物各個門優勢屬平均豐度

2.3 水質指標、浮游植物和水中GSM及浮游植物與肌肉中GSM相關性研究

2.3.1 水質指標、氮磷比、浮游植物與水體中GSM含量相關性分析

表3相關性分析表明水體中GSM含量主要與氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮和氮磷比呈現相關性，但相關性不顯著。

表3 水質指標、氮磷比與水體中GSM含量相關性分析

通過對養殖吉富羅非魚系統水質指標與優勢浮游植物冗余(RDA)分析(圖4)可知，氨氮、硝態氮、亞硝態氮、氮磷比對微囊藻屬、柵藻屬、小環藻屬都呈現正相關作用。

圖4 養殖吉富羅非魚系統水質指標與優勢浮游植物RDA分析

采用Pearson相關分析法對水體中平均GSM含量與浮游植物群落平均豐度進行相關性分析(見表4)，養殖吉富羅非魚系統中GSM含量與柵藻屬、小環藻屬和微囊藻屬具有顯著的正相關，與舟形藻屬呈顯著負相關。

表4 養殖吉富羅非魚系統中浮游植物與水中GSM含量Pearson相關性分析

2.3.2 浮游植物與肌肉中GSM含量相關性分析

通過養殖吉富羅非魚系統中浮游植物群落與肌肉中GSM含量Pearson相關性分析(見表5)，可以看出養殖吉富羅非魚肌肉中GSM含量與硅藻門中直鏈藻屬(顆粒直鏈藻)呈顯著正相關，與藍藻門中顫藻屬、綠藻門中盤星藻屬呈現較強的相關性，但是不顯著，除此之外，與其他藻屬的相關性較差。

表5 養殖吉富羅非魚系統浮游植物平均豐度與肌肉中GSM含量Pearson相關性

3 討論

3.1 吉富羅非魚養殖系統水中GSM含量及影響因素分析

作為淡水養殖池塘中主要的土腥異味物質之一[13]，GSM廣泛存在于包括斑點叉尾養殖池塘[20]和本文研究的吉富羅非魚養殖池塘在內的淡水養殖池塘環境中。在斑點叉尾養殖池塘中的濃度大于0.3 ng/L[19]，遠低于本實驗各組水體中GSM的含量(17.79～42.47 ng/L)。因此，不同養殖品種淡水養殖環境水體中GSM的含量具有較大的差異性。

已有研究表明，水質狀況會影響水環境中異味物質的產生及分布[20-21]。本試驗研究也表明，吉富羅非魚養殖系統中水體氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、氮磷比等指標與水中的GSM含量具有一定相關性。我們知道，水中氮、磷等物質會為水中藻類生長提供營養，而藍藻是產生GSM的主要生物類別之一，這可能是水質狀況與水中GSM有相關性的根本原因。就本研究中所重點提及的藻類、尤其是藍藻來講，水體中氮、磷營養鹽是微藻繁殖所需的生物學基礎，也是浮游藻類繁殖的限制性因素[22]，藍藻的豐度與環境中的氮磷比具有相關性，當氮磷比<29時，環境中的優勢藻類更傾向于藍藻[23]。在本研究中的氮磷比的范圍為4.19～9.64之間，養殖水環境有利于藍藻的生長。RDA分析結果表明氨氮、硝態氮、亞硝態氮、氮磷比對藍藻門中的微囊藻屬的相對豐度呈現正相關作用，而相關分析也表明微囊藻屬的相對豐度也與水中GSM呈顯著正相關關系。因此，水質狀況與水中GSM有關的根本原因可能是水質狀況對水中能夠產生GSM的生物種類、例如藍藻的生長產生了影響。除此以外，本研究還表明，吉富羅非魚養殖系統中水體GSM含量還與硅藻門中的小環藻屬以及和綠藻門中的柵藻屬呈現顯著的正相關關系，關于這樣的結果，先前的研究也有報道，包括綠藻門中柵藻以及硅藻門中的小環藻也可能產生土腥異味物質[13]。綜合分析來看，本實驗中，通過不同的餌料投喂率向養殖吉富羅非魚系統中輸入不同量的營養鹽，改變了水體中的水質狀況，干擾了養殖水體中浮游植物群落結構，影響了水中可能產GSM浮游植物藻類微囊藻、柵藻、小環藻等藻類的豐度，進而對水體中GSM的含量產生作用。

3.2 池塘養殖吉富羅非魚肌肉中GSM含量及影響因素

本研究中，羅非魚肌肉中平均GSM含量范圍為409.77～1 062.72 ng/kg，而人類對食品中GSM的感官閥值為700 ng/kg，因此，本研究中的部分羅非魚肌肉樣品由于GSM含量較高造成的土腥味已經可以對產品口味造成影響。具體是1%和8%餌料投喂率造成了對應組別GSM影響了羅非魚產品的口感。以往的研究表明魚肉中GSM含量會受到飼料磷含量、魚體脂肪含量、魚規格大小的影響[24-26]。在本研究中，8%餌料投喂率組相比于其他組由于投喂的餌料較多，吉富羅非魚體重較重，規格也大，肌肉中GSM的含量較高，因此，8%餌料投喂率造成的羅非魚肌肉中GSM含量較高可能與羅非魚規格較大有關。而在8%餌料投喂率組水體中GSM含量卻不是很高，表明羅非魚肌肉中GSM含量和水中的含量沒有相關關系，即水中的GSM通過鰓部毛細血管及皮膚進入血液循環可能不是吉富羅非魚肌肉中GSM上升的主要原因。1%餌料投喂率吉富羅非魚肌肉中也表現出的GSM較高含量，而對應的水體中的GSM含量在各組中也較低，首先進一步說明水體中GSM和吉富羅非魚肌肉中GSM可能存在直接的相關關系。其次，1%餌料投喂率是較低的，吉富羅非魚基本上處于饑餓的狀態，對于水中包括藻類在內的有機顆粒的攝食強度可能會顯著高于較高的餌料投喂率組，因此含GSM藻類及微生物的大量代償性攝入，可能是造成1%餌料投喂率組吉富羅非魚肌肉中GSM較高的主要原因。

然而，對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的研究表明，虹鱒體內的GSM含量與鰓和皮膚對GSM的吸收有關[27]。眾所周知，虹鱒為肉食性魚類，這就決定了通過直接攝食水中的產GSM藻類和其他微生物的方式，基本不會成為其身體中GSM含量上升的主要原因。而本研究中的吉富羅非魚為雜食性魚類，其對水中產GSM藻類和其他微生物的直接攝入就會成為羅非魚肌肉中GSM上升的直接原因。綜上，本實驗研究中吉富羅非魚肌肉中的GSM含量可能是通過吉富羅非魚攝食包括顆粒直鏈藻在內的水中產GSM微藻及細菌造成的，進而被胃腸道的消化吸收富集于魚肉中。因此，在養殖能夠攝食藻類的雜食性魚類時，要求養殖水體中水體富營養化程度要低，否則容易導致藻類繁殖[28]，養殖魚類攝食可能含有GSM藻類后[29-30]，會影響產品品質。另外，餌料投喂率要合適，基本原則是不要使包括羅非魚在內的雜食性魚類餌料攝入不足而代償性提高水中微藻及微生物攝入強度，也不能使水體富營養化程度過高，使得水體微藻及微生物豐度顯著上升。目前對于養殖水產品中土腥異味物質的來源還沒有完全確認，進一步的研究可以借助C同位素標記的方法，追溯其產源。另外，本研究主要從藻類角度分析對土腥異味物質的影響，以前研究表明放線菌也可產生土腥異味物質[31]，本研究缺點和不足是沒有對產GSM微生物等菌群進行分析，但仍可說明一定的問題。

4 結論

養殖吉富羅非魚系統水體和吉富羅非魚肌肉中均檢測出GSM，大規格吉富羅非魚肌肉中GSM的含量較高；不同的餌料投喂率通過向養殖吉富羅非魚系統中輸入不同量的營養鹽，影響了養殖水體中浮游植物群落結構，進而對水體中GSM的含量產生影響；吉富羅非魚肌肉中的GSM含量與顆粒直鏈藻有較強相關性。