醫用高分子材料表面機械抗菌研究進展

張傳忠，肖晴，單長麗

（菏澤家政職業學院，山東 菏澤 274000）

醫用高分子材料在醫療器械領域有著十分重要的地位，這類材料在導尿管[1]、口腔預防用防齲材料、合理控制菌群生態防止微生物對牙面侵蝕[2]、中心靜脈導管[3]等都有著重要的應用，是生物材料中最重要的材料之一，其廣闊的應用前景與巨大的發展潛力使其備受研究人員和醫療器械制造公司的歡迎。在實際手術前后，醫療器械攜菌、術后染菌會誘發災難性感染，給患者帶來極大的生理痛苦和經濟壓力。細菌黏附于醫療器械表面的初始階段，可快速增殖形成一層致密生物膜，一旦生物膜開始形成，抑制細菌增殖將變得相當困難。高分子醫療器械表面大多數不具有殺菌作用，因此，抗細菌吸附、抗生物膜形成，是醫用高分子材料表面改性的主要方向[4]。

現存抗菌材料的抗感染途徑主要包括了抗細菌黏附、接觸殺菌及藥物釋放殺菌、機械殺菌4 類。機械殺菌是利用材料表面特殊拓撲結構實現抗菌效果，最具代表性的材料為黑硅，其表面具有類似蜻蜓翅膀微觀結構的仿生針狀納米結構，對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有強的殺傷作用[5]。抗黏附涂層和接觸殺菌涂層主要是通過化學接枝手段實現長鏈高分子聚合物（如聚乙二醇等）或抗菌物質（如季銨鹽等）的材料表面固定化。抗黏附涂層在抑制細菌黏附的同時也可能影響損傷修復細胞的黏附，通常表現為有一定的細胞毒性。釋放殺菌材料主要是通過在醫療器械表面制備構建具有金屬離子或殺菌物質緩釋功能的涂層[6-7]。該類材料是目前臨床應用的最多的。銀納米顆粒和金屬氧化物納米顆粒分別通過釋放出銀離子和生成活性氧（ROS）有效地殺死細菌，是目前應用最廣泛的兩種無機納米抗菌劑[8-9]。

每當抗生素應用于生物膜，其殺滅細菌的功效僅限于生物膜的頂層，對位于微生物群體內的細菌幾乎沒有影響。抗生素在整個生物膜中滲透并發揮其作用的這種能力不足可能使細菌產生抗生素耐藥性，這是使用抗生素對抗生物膜失敗的主要原因之一[10-13]。目前，每年世界各地70 萬人死于抗生素耐藥性感染，如果不改善這一狀況，這一數字將在2050年增加到驚人的1 000 萬。

如果在初始階段可以在醫療器械表面上防止細菌黏附和生長，則可以抑制細菌生物膜的形成。有一些研究不是通過化學方法殺死細菌，而是通過細菌與材料表面接觸而殺滅細菌。這些研究大部分是受到自然的啟發，其中已知的幾種昆蟲翅膀或皮膚具有殺死與其接觸的微生物的殺菌表面。這些表面的殺菌作用是由于存在尖銳的納米結構（納米柱形狀，直徑 50～250 nm，高度 80～250 nm，間距100～250 nm），在接觸或破裂細菌時刺入細菌細胞壁，從而殺死細菌。這種機械殺菌方法已經成為一種解決細菌耐藥性的有效途徑[14-16]。

1 細菌細胞壁分類

細菌細胞壁是一種多層結構，可為細菌提供強度、剛度和形狀，并保護細菌免受滲透破裂和機械損傷，機械殺菌的機制就是破壞細菌細胞壁的過程。根據其結構、組分和功能，細菌細胞壁可分為兩大類：革蘭氏陰性和革蘭氏陽性。革蘭氏陰性細胞壁是由外膜和一層7～8 nm 的肽聚糖組成，外膜和肽聚糖通過脂蛋白連接，肽聚糖又位于外膜和細胞質膜之間的周質內。外膜含有一種可以穿過膜的、親水的小分子孔蛋白以及延伸到細胞外空間的脂多糖（LPS）分子。外膜中的這些成分對于革蘭氏陰性細菌的結構完整性和活力是必不可少的。革蘭氏陽性細胞壁含有一層厚的30～100 nmPG 層（比革蘭氏陰性細菌厚4～5 倍），它其中含有磷壁酸和脂磷壁酸，磷壁酸附著并嵌入PG 層中，而脂磷壁酸延伸到細胞質膜中[17]。

2 醫用高分子材料表面改性后殺菌效果

有研究表明，使用納米壓印光刻來制作聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）表面的仿生納米柱后并接種大腸桿菌，相較于在平坦的PMMA 表面上大腸桿菌呈形態正常的棒狀，在擁有納米柱的結構上，當細菌伸展在幾根柱子上時，細菌出現了萎縮，柱子上不規則的（塊狀）細菌表明細胞已經破裂，膨脹壓力已經消失。柱狀表面與平面相比具有較低的黏附細菌密度（平膜上67%～91%的密度）。此外，黏附的大部分大腸桿菌死于柱狀表面（死亡部分比平膜上高16%～141%）。研究還指出，較小間距的納米柱具有更好的殺菌性能[18-19]。最小間距且最小的納米柱與平面對照相比，在24 h 內將細菌水性懸浮液中的負荷降低了50%。通過對細胞取向數據的定量分析，確定最佳納米柱間距的最小閾值在130～380 nm 之間。細菌細胞長度的測量也表明納米柱對大腸桿菌形態產生不利影響。總之，這項工作表明，具有精確尺寸的幾何形狀的印跡聚合物納米結構可以在不進行任何化學修飾的情況下殺死細菌。

具有抗反射和疏水性能的功能性聚合物膜已廣泛用于電子器件顯示器。然而，這種功能膜的抗菌特性的設計一直是一個挑戰。有的研究者[20-21]使用嚴格的耦合波分析納米壓印設計出的納米結構表面，以在平坦的聚（甲基丙烯酸甲酯）膜上制備了納米結構，該結構不僅疏水，并且表現出所需的光學特性，在可見波長范圍內反射率小于0.5%。此外，與相應的平坦表面相比，納米壓印聚合物表面顯示出抗菌特性和低黏附性。結果表明，在該研究中設計的納米結構表面是多功能的并且應該適合于用于便攜式電子設備的顯示器的保護性光學和衛生聚合物膜的生產。

有研究者使用直接激光干涉圖案（DLIP）來修改亞微米級的聚苯乙烯表面形貌。結果表明，三維微米結構對細菌黏附產生明顯的影響。因此，線狀和柱狀圖案增強了金黃色葡萄球菌的黏附，而復雜的薄片微觀形貌在靜態和連續流動培養條件下減少了金黃色葡萄球菌的黏附[22]。

然而，因為關于表面微觀形貌對細菌黏附的影響的知識仍然很大程度上是經驗性的，所以有必要通過實驗測試每種模式以確定其在體外和體內條件下的行為。規則的線狀和柱狀圖案增強了金黃色葡萄球菌的黏附，而不規則的LA 微觀形貌減少了靜態和連續流動培養條件下的黏附。此外，薄片狀紋理表面在人血清蛋白存在下抑制金黃色葡萄球菌黏附，并且當材料皮下植入異物相關感染模型時，表明由薄片狀紋理組成的PS 表面可能提供有希望的策略減少金黃色葡萄球菌對生物醫學表面的黏附。有趣的是，當表面涂有人血清蛋白時，以及當材料皮下植入異物相關感染模型時，薄片狀紋理表面保留了抑制金黃色葡萄球菌黏附的能力。正在進行的研究有必要證明其他聚合物（如聚酰亞胺和聚對苯二甲酸乙二醇酯）表面的薄片微觀形貌也能抑制金黃色葡萄球菌的黏附[23]。

3 納米結構表面的機械特性對其殺菌功效的影響

從這些模型和相關的實驗研究中可以看出，納米結構表面的殺菌活性取決于幾個參數，例如納米結構的尺寸、形狀和間隔/密度。這些結果表明，可以通過納米結構的密度和直徑來調節殺菌效率。然而，他們沒有解釋具有較小直徑和較高密度的較高殺傷效率背后的潛在機制。細菌和納米結構表面之間的黏附強度是納米結構中的重要元素，誘導細胞破裂。細菌細胞壁和表面之間的較大黏附力導致給定納米結構幾何形狀破裂的可能性很高。細菌與納米結構表面的黏附取決于表面的疏水性/親水性和細胞膜組成。當受到納米結構表面的挑戰時，細菌將通過增加與多個錨定點的接觸面積來嘗試沉積在納米結構表面上。在該拉伸過程中，當細胞壁達到作用于其上的應變的閾值極限時，細胞壁破裂可以發生。如果存在于表面上的納米結構是柔韌的，則它們可能彎曲并且更難以獲得拉伸的細胞壁破裂的閾值應變。因此，這種柔韌性可能使細菌使納米結構變形，使得微生物可以在“釘床”上沉降和增殖。

4 細菌與納米結構表面相互作用機械模型

圖1（A）為棒狀細胞和蟬翼表面之間的模型相互作用的三維圖。當細胞（a1）接觸并且（a2）吸附在細胞上時納米柱，（a3）外層開始在柱子之間的區域破裂復制。圖1（B）為粘附于a 的細菌細胞的示意圖（b1）平面和（b2）細菌細胞粘附在蟬翼狀納米圖案表面（L和R分別代表細菌的長度和半徑，h是納米柱的高度，Rp 是納米柱的半徑）。圖1（C）為吸附在兩個相鄰納米柱上的細菌膜的側視示意圖，其中H是納米級的高度，2R是納米級的底部寬度，SA表示覆蓋該部分的細菌膜部分的接觸區域，SB表示懸浮膜的面積，r0是從分界線到X軸的距離，D是兩個相鄰納米柱之間的距離。圖1（D）（d1）以六邊形排列的納米柱附著在表面上的細菌膜的頂視圖，橫截面圖和放大圖（Rp 是納米柱的半徑，Dp 是納米柱之間的距離，L和R代表納米圖案表面上細菌的長度和半徑，h是變形深度和θ細菌細胞膜與圖案化表面的接觸角）；（d2）細菌膜在半徑空間與納米柱間距拉伸時的相圖（顏色條表示細菌膜拉伸程度的值，紅色對應高值，藍色對應低值）[24]。

圖1 細菌與表面改性后高分子相互作用的模型示意圖

POGODIN 等開發了一個生物機械模型來解釋納米蟬翼和細菌之間的相互作用，考慮細菌細胞壁的兩個部分：與納米柱接觸的區域和懸浮在納米柱之間的區域（圖1A）。假定細菌細胞為薄的彈性層，因為蟬翼上的納米柱（100 nm）的尺寸比細胞壁的厚度（10 nm）大一個數量級并且細菌表面與納米柱之間的曲率被忽略。由于蟬翼上存在機械納米結構形貌，細菌膜通過增強相互作用的表面積而吸附在多個納米柱上，這導致不均勻的拉伸而使膜破裂。LI[25]等通過考慮細菌細胞（長度L和半徑R）的自由能變化，研究了納米結構表面（圖1B 中的高度h和半徑Rp）的殺菌機理和定量熱力學模型，在細菌細胞壁于平坦表面和納米結構表面的相互作用中顯示了差異。細菌細胞與平坦表面和納米結構表面的相互作用之間的主要對比是黏附區域中黏附和細胞膜變形的接觸區域。與平坦表面相比，納米結構表面增強的殺菌效率歸因于接觸黏附總面積的增加（參見圖1B（b2）），其增強了膜的拉伸應變，當拉伸足夠時導致細胞裂解。因此可以通過增加表面粗糙度以及納米結構的半徑和高度來促進殺菌率。在類似于蟬翼的模型中，薛等假設在與納米柱接觸的區域中細菌膜的變形以及懸掛在納米柱之間的細菌膜的變形的拋物線輪廓（圖1C），這與POGODIN等的研究不同他們忽略了懸在納米柱之間的細菌膜的曲率，考慮了重力和范德瓦爾力在破裂細胞壁中的組合作用，并且顯示出納米蟬翼面可以非常高效地殺死革蘭氏陰性細菌[26]。還提出通過具有大間距的尖銳納米特征可以增強殺菌效率，這與KELLEHER 等的發現相反，他們建議采用更緊密的納米結構以提高殺滅效率。LI 等考慮了細胞-納米結構表面黏附能量與細胞膜變形能之間的平衡（圖1D（d1））。他們認為，由于表面粗糙度引起的接觸面積增加，黏附能量可以增強，同時半徑小的納米柱也可以增加變形能量，設計了相圖（顏色條表示細菌膜的拉伸程度的值，紅色對應于高值（增強階段）和藍色低值（抑制階段）），用于解釋納米柱半徑和細菌在納米結構表面上黏附的間距（圖1D（d2））的相關的影響。

5 結束語

抗菌素耐藥性已成為一項緊迫的全球挑戰，需要智能替代解決方案來應對細菌感染。細菌的形狀、大小、細胞壁厚度、外膜組成和其他特征不同。盡管已經在不同的納米結構形態上證明了機械殺滅細菌，但是沒有明確的通用指南適用于所有細菌和具有不同物理和化學性質的所有底物。不同的模型優先考慮不同的節距：較低彎曲能量模型首選的節距、更高的節距優選通過基于拉伸的模型。事實上，太高的螺距可能導致支柱之間的細菌生長。似乎納米紋理需要一定的最小縱橫比，否則細胞將能夠“感知”其拓撲結構。在尺寸、形狀、縱橫比和密度方面找到優化的納米形貌，這應該針對不同大小和類型的細菌進行調整，仍然是一項重大的科學挑戰。