河南省部分屠宰場生豬肉孢子蟲感染情況調查

楊紅玉，張敏，馬超鋒，閆文朝

(1. 南陽農業職業學院，河南 南陽 473000；2. 焦作市動物疫病預防控制中心，河南 焦作 454150；3. 信陽市動物疫病預防控制中心，河南 信陽 464000；4. 河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471023)

肉孢子蟲病是由肉孢子蟲(Sarcocystis)寄生于多種宿主的肌肉而引起的一種人獸共患原蟲病，豬、牛、羊和鳥類等多種動物均可感染。肉孢子蟲屬于孢子蟲綱、真球蟲目、肉孢子蟲科。肉孢子蟲屬有200多個蟲種，不同蟲種的中間宿主和終末宿主也存在差異。一些蟲種感染動物后不表現明顯癥狀，而有些蟲種可對中間宿主表現明顯致病性，引起動物貧血、發熱、嗜酸性粒細胞肌炎、流產或者死亡。人因食用含有蟲體的肉制品主要是豬肉而感染，出現發熱、惡心、嘔吐和腹瀉等癥狀[1-2]。因此，開展豬的肉孢子蟲調查和研究具有重要的經濟價值和公共衛生意義。

豬是肉孢子蟲的中間宿主。根據報道，豬有3種肉孢子蟲，米氏肉孢子蟲(S.miescheriana)、豬人肉孢子蟲(S.suihominis)和豬貓肉孢子蟲(S.porcifelis)，其中米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲流行最為廣泛且致病性最強，曾引起豬場肉孢子蟲病暴發，給養豬業帶來較大危害和損失[1，3]。本研究采用劉婕等[4]開發的豬源肉孢子蟲雙重套式PCR檢測試劑盒對河南省11個地市62家屠宰場開展生豬肉孢子蟲感染情況調查，以期掌握河南省豬的肉孢子蟲感染情況，為該地區肉孢子蟲病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集及處理

2018年6月—2019年10月，在河南省11個地市62個屠宰場采集膈肌樣品2 038份，每份5～8 g，登記樣品來源(年存欄大于500頭為規模場，少于500頭為散養戶)，冷藏帶回實驗室，統一編號登記，置-20 ℃冰箱保存備檢。

1.2 主要檢測試劑

普通Taq聚合酶、dNTP、DL2000 DNA Marker、10×緩沖液、瓊脂糖等購自大連寶生物工程有限公司；組織細胞DNA提取試劑盒購自TaKaRa公司；豬源肉孢子蟲雙重套式PCR檢測試劑盒由河南科技大學動物科技學院動物檢疫實驗室提供。

1.3 主要試驗儀器

全自動樣品快速研磨儀(上海凈信實業發展有限公司)；5424R高速臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；LC-800低速離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司)；核酸提取儀(西安天隆科技有限公司)；PCR儀(德國Biometre公司)；Eppendorf 不同量程單道移液器及25～300 μL多道移液器(德國Eppendorf公司)；電泳儀、凝膠成像系統(以色列DNA公司)；HH數顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇晶玻實驗儀器廠)等。

1.4 引物的設計與合成

參考文獻[4]的報道米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲特異引物(如表1)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 豬源肉孢子蟲雙重套式PCR檢測引物

1.5 檢測方法

將采集的樣品剪成小塊放入離心管中，隨后加入液體在全自動樣品快速研磨儀上制成勻漿；采用組織細胞DNA提取試劑盒提取處理過樣品的總DNA，操作方法參照試劑盒說明書進行；將提取的總DNA作為模板，采用文獻[4]建立的肉孢子蟲雙重套式PCR方法對待檢樣品進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，米氏肉孢子蟲和豬人肉孢子蟲擴增產物的大小分別為415和591 bp。

反應條件：第一輪擴增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35 個循環；72 ℃ 10 min。第二輪PCR 擴增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共35個循環；72 ℃ 10 min。

1.6 檢測數據分析

結果采用SPSS 19.0軟件進行分析，分別對不同地區屠宰場肉孢子蟲場陽性率和樣品陽性率、不同規模豬群肉孢子蟲陽性率、不同季節屠宰場肉孢子蟲陽性率進行χ2檢驗分析差異顯著性，P<0.05時差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 河南省屠宰場肉孢子蟲總體感染情況

從圖1可以看到，本次調查中發現的只有米氏肉孢子蟲(415 bp)。本次檢測調查河南省11個地市的62個屠宰場，肉孢子蟲陽性場37個，平均場陽性率為59.7%，最高的為駐馬店、商丘和鄭州，均為66.7%，其次為信陽，為62.5%；場陽性率最低的為安陽和漯河，陽性率均為33.3%。2 038份樣品的平均陽性率為29.4%，南陽、駐馬店、信陽、鄭州、周口和新鄉樣品陽性率均超過30%，周口樣品陽性率最高，為37.1%；陽性率最低為漯河和安陽，分別為為10.5%和11.1%(見表2)。χ2檢驗分析表明，河南不同地區屠宰場肉孢子蟲場陽性率差異不顯著(P>0.05)，不同地區間樣品陽性率均差異極顯著(P<0.01)。

表2 樣品來源及抗體陽性率

M．DL2000 DNA Marker；1～6.被檢樣品；7.陽性對照；8.陰性對照

2.2 河南省不同規模豬場肉孢子蟲感染情況

本次調查根據豬的來源，分為規模場(存欄500頭以上)和散養戶(存欄500頭以下)。從表3可以看出，散養戶的肉孢子蟲陽性率(32.3%)略高于規模場(27.7%)。χ2檢驗分析表明，不同規模豬場肉孢子蟲陽性率差異顯著(P<0.05)。

表3 不同場點類型豬場肉孢子蟲感染率

2.3 河南省屠宰場不同季節豬肉孢子蟲感染情況

本次屠宰場生豬肉孢子蟲感染調查，每個季節均有陽性檢出，其中，春季最高，達到33.8%，冬季最低為26.1%(見表4)。χ2檢驗分析表明，不同季節豬群肉孢子蟲陽性率差異不顯著(P>0.05)。

表4 屠宰場不同季節肉孢子蟲感染率

3 討論

肉孢子蟲病是一種重要的人獸共患寄生蟲病，感染后會對人體健康造成一定的危害。牛、羊、豬等動物是肉孢子蟲傳播的中間宿主，與人類密切接觸，因此查清肉孢子蟲的感染狀況，有重要公共衛生意義。豬肉因其較高的營養價值而為人們所喜愛，我國每人年平均豬肉消費量為27.1 kg(2019年)，豬肉是國人餐桌的主要肉類。2019全年，河南省生豬出欄量達3 170萬頭，對屠宰生豬開展肉孢子蟲感染調查有重要的公共衛生意義。本次共調查11個地區的62個屠宰場，場陽性率為59.7%，樣品陽性率為29.4%；這與曹謙[5]調查的青海同仁縣隆務地區豬感染率83.15%，馮成蘭等[6]調查的青海共和地區屠宰生豬感染率61.91%，周偉業[7]調查的青海冷湖地區的感染率47.34%，王榮菊等[8]調查的青海西寧屠宰場豬感染率44%相比，都要低；與薛瑞等[9]2018年調查的河南洛陽豬源肉孢子蟲感染率26.8%接近；遠高于李明偉等[10]對湛江市豬肉孢子蟲調查的感染率2.05%，張浩吉等[11]對廣州地區豬肉孢子蟲調查的感染率0.7%，李小軍等[12]對河南豫北地區豬肉孢子蟲調查的感染率0.238%。需要說明的是以上調查所采用的方法均是鏡檢壓片法，檢測結果靠主觀判斷，與檢測者水平有較大關系，存在一定誤差。周望平等[13]采用ELISA 方法對湖南地區開展豬肉孢子蟲病血清學調查，感染率為4.4%，低于本次調查的感染率。本次調查肉孢子蟲感染情況采用的雙重套式PCR檢測方法，具有敏感、特異和快捷等優點，可以實現對豬肌肉組織和血液等樣品中肉孢子蟲的快速、準確檢測，可以為豬肉孢子蟲病診斷和流行病學調查提供高效的檢測手段和方法，可以大范圍推廣應用。

本次調查將根據屠宰場豬的來源，將豬群劃分為規模場和散養戶，均有肉孢子蟲陽性檢出，說明不同場點豬場均有感染，分析散養戶陽性率高于規模場可能與規模場大多集約化養殖，有效切斷了中間宿主與終末宿主的聯系有關。從本次調查結果來看，河南省豬群一年四季均有肉孢子蟲感染，但是不同季節感染率有差異，春季感染率最高，夏季、秋季和冬季感染率較接近，其中冬季感染率最低。當前還沒有特效藥物治療肉孢子蟲病，防治肉孢子蟲病主要采取綜合性防控措施切斷傳播途徑：一是豬場禁止飼養犬貓，犬貓作為肉孢子蟲的終末宿主，在肉孢子蟲的感染中起到重要作用；二是病死動物及時處理，禁止用生肉或者下水飼喂犬貓等動物。