鹽酸小檗堿多晶型的制備、表征及其對自制片劑溶出行為的影響

閆富龍，祝宇龍，彭燦，2，3，4*（.安徽中醫藥大學藥學院，合肥 23002；2.藥物制劑技術與應用安徽省重點實驗室，合肥 23002；3.中藥復方安徽省重點實驗室，合肥 23002；4.安徽省中醫藥科學院藥物制劑研究所，合肥 23002）

近年來，隨著對藥物研究的深入，研究者發現在藥物的藥物成分、手性、結構、純度等因素固定時，藥物在質量和療效上仍然存在著不穩定現象。經大量實驗后發現了多晶型這一重要影響因素[1]。多晶型現象是指固體藥物在結晶過程中因為條件的差異，分子在晶胞中對稱規律的不同，使得藥物分子之間、藥物分子與溶劑分子之間相互作用力或結合方式以及空間結構等發生變化，從而使藥物晶體出現兩種或兩種以上的空間群和晶胞參數[2-4]。不同的晶型具有不同的機械學、熱力學、物理學和化學特性，尤其是對難溶性藥物來說，不同晶型的轉變會影響其在體內的溶解和吸收，進而影響藥物的生物利用度、療效，甚至產生不良反應，影響用藥安全[5-7]。我國是一個仿制藥大國，并且仿制企業繁多，同一品種可能被多家企業仿制，而藥物的多晶型會直接影響藥品的有效性、安全性和質量[8]。因此，固體藥物多晶型的研究對藥物的開發上市至關重要。

鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride）是一種天然異喹啉類生物堿，又稱為黃連素，主要來源于黃連、黃柏、三顆針等小檗科等4 科10 屬藥用植物[9-11]。目前鹽酸小檗堿可以由植物提取和人工合成兩種途徑獲得[12]，在臨床上常用于治療細菌性瘧疾、腸胃炎等疾病[13-14]，效果顯著。現代藥理學研究證明，其還有降血脂[15]、降血糖[16]、抗腫瘤[17-19]和抗心律失常[20]等藥理作用，具有廣泛的應用前景。

目前國內外對于鹽酸小檗堿片劑的研究，大部分集中于質檢分析、含量測定以及輔料對鹽酸小檗堿溶出度的影響等方面，而對其晶型的研究很少[21-23]。羅小飛等[24]發現不同溶劑中析出的鹽酸小檗堿溶解度不同，經X 衍射分析發現鹽酸小檗堿也存在多種晶型現象。晶型研究對于鹽酸小檗堿藥效發揮尤為重要，本文應用單一溶劑重結晶法制備鹽酸小檗堿不同晶型，比較不同晶型自制片在不同溶出介質中的溶出行為，為改善鹽酸小檗堿溶出與藥物臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 試藥

鹽酸小檗堿對照品（含量：86.8%，批號：160901，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（北京百靈威科技有限公司）；冰醋酸、鹽酸（國藥集團化學試劑有限公司）；磷酸鹽（天津市福晨試劑公司）；三乙胺（批號：20191130，上海潤捷化學試劑有限公司）；蒸餾水。淀粉（批號：S116028）、羧甲基淀粉鈉（CMS-Na，批號：C105666，阿拉丁有限公司）；聚維酮 K30（PVP K30，批號：190506，安徽山河藥用輔料股份有限公司）；聚山梨酯 80（薩恩化學技術有限公司），硬脂酸鎂（遼寧奧達制藥有限公司）。所有輔料均為藥用級輔料。

1.2 儀器

SmartLab3KW X-射線衍射儀（日本理學公司）；S-3700N 掃描電子顯微鏡（日本島津公司）；Spectrum 400 紅外光譜儀（英國PE 公司）；Mettler TGA/DSC1 熱分析儀（瑞士梅特勒公司）；高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；超聲波清洗機（YL060S，濟南巴克超聲波科技有限公司）；超純水機（milli-Q Synt hesis，millipore）；十萬分之一電子天平（BT25S，墨多利斯科學儀器有限公司）；循環水式真空泵；溶出試驗儀（ZRS-8L，天津天大天發科技有限公司）；ZP29 旋轉式壓片機（上海天峰）；YD-1 片劑硬度測試儀（天津市國銘醫藥設備有限公司）。

2 方法與結果

2.1 晶型樣品制備

本研究采用單一溶劑重結晶法制備鹽酸小檗堿晶型樣品，鹽酸小檗堿原料藥晶型設為晶A 型，其他新制備得到的晶型依次命名為晶B 型至晶F 型。取鹽酸小檗堿原料藥300 mg 于潔凈容器中，少量多次加入總量為40 mL 的醋酸溶液、或100 mL 的乙酸乙酯溶液、或總量為25 mL 的二氯甲烷溶液、或總量為80 mL 的乙腈溶液、或總量為100 mL 的丙酮溶液，加熱，體系溫度均為20～100℃，磁力攪拌（速度控制在500～1200 r·min－1），反應1～5 h，使其完全溶解，得到黃色澄清溶液。溶液趁熱過濾，濾液置于40～60℃真空干燥環境下揮發結晶，獲得淡黃色粉末分別為鹽酸小檗堿晶B型、鹽酸小檗堿晶C 型、鹽酸小檗堿晶D 型、鹽酸小檗堿晶E 型、鹽酸小檗堿晶F 型。

2.2 鹽酸小檗堿不同晶型表征分析

2.2.1 晶體粉末掃描電子顯微鏡法 使用碳雙面膠帶將樣品固定在黃銅樁上。然后設置電壓為15 kV，電流為119 μA，拍攝不同晶型粉末微觀照片。

如圖1所示，5 種不同晶型的鹽酸小檗堿粉末呈現不同的微觀形狀。晶B 型和晶F 型呈現兩端漸變鋒利趨勢的針狀，晶F 型呈現相比于普通針狀更加狹長纖細的狹長針狀；晶E 型為不規則塊狀晶型，晶體兩端邊緣無明顯漸變鋒利趨勢，比較光滑；晶C 型為較為明顯的柱狀晶型，比表面積較大；晶D 型呈現為片狀晶體，與晶C 型柱狀晶型較為相似，但側面可以看出特別薄，其比表面積比柱狀小。

圖1 鹽酸小檗堿晶5 種晶型的掃描電子顯微鏡圖Fig 1 SEM image of 5 crystal forms of berberine hydrochloride

2.2.2 差示掃描量熱法（DSC） 精密稱取不同晶型鹽酸小檗堿粉末樣品5～10 mg，置于40 μL 標準Al2O3坩堝中，鋪勻后壓蓋，放入差示掃描量熱儀中，以40 μL 標準Al2O3空坩堝為參比，在溫度范圍0～240℃，升溫速率10 ℃·min－1的條件下進行分析，記錄DSC 曲線。

如圖2所示，樣品在二次升溫過程中無特征吸收峰，經觀察樣品升溫到240℃和300℃時均已完全碳化，所以185℃左右為鹽酸小檗堿粉末的熔點溫度，與相關文獻記載的190℃相符。除熔點吸收峰外，晶B 型和晶C 型DSC 圖譜中只存在100℃左右的吸收峰，說明該晶型鹽酸小檗堿粉末中只存在游離水；晶B 型和晶C 型DSC 圖譜中只存在150℃左右的吸收峰，說明該晶型鹽酸小檗堿粉末中只存在結合水；晶F 型在圖譜上存在100℃左右和150℃左右兩個特征吸收峰，說明多晶型鹽酸小檗堿粉末中存在游離水和結晶水。由于制備的鹽酸小檗堿粉末在實驗前已干燥5 h，說明該晶型粉末具有較強的吸濕性。

圖2 鹽酸小檗堿5 種晶型的DSC 圖譜Fig 2 DSC spectrum of 5 crystal forms of berberine hydrochloride

2.2.3 傅里葉變換紅外光譜法 壓力作用因素可能會導致藥物晶型發生改變，本實驗采用衰減全反射法（ATR）紅外光譜法，藥物粉末直接進樣。光譜范圍：6000～650 cm－1，分辨率：4.00 cm－1，掃描次數：16 次。

采用紅外光譜法對5 種晶型鹽酸小檗堿樣品進行表征，其紅外吸收光譜如圖3所示。5 種晶型在3649、3324、3047、2162、1505、1140、1109、1066、1018 cm－1等處均具有紅外光譜特征峰，其中紅外光譜特征峰的允許偏差為±2 cm－1。比較鹽酸小檗堿不同晶型樣品紅外吸收峰發現，晶C型、晶D 型、晶E 型和晶F 型在3549 cm－1處無明顯吸收峰，表明可能發生了開環反應；晶B 型和晶C 型在1705 cm－1處存在吸收峰，表明存在羧基，可能來源于醋酸的羧基或乙酸乙酯的酯基。

圖3 鹽酸小檗堿5 種晶型的紅外圖譜Fig 3 Infrared spectrum of 5 crystal forms of berberine hydrochloride

2.2.4 X 射線粉末衍射法 稱取一定量的5 種晶型樣品，進行粉末X 射線衍射檢測。檢測條件：使用CuKα輻射在40 mA 和40 kV 下運行，并在衍射束上配備石墨單色儀，以收集X 射線衍射圖案；在3°≤2θ≤80°的范圍內以步長0.01°記錄XRD 圖案，每步至少采集1000 個計數。平均晶體尺寸通過Scherrer 方程估算，其中積分寬度已針對儀器加寬進行了校正。儀器輪廓加寬源自對標準樣品獲得的XRD 數據的擬合。

結果如圖4所示，鹽酸小檗堿5 種晶型在X射線粉末衍射圖譜上均有一定的差異。晶B 型鹽酸小檗堿在2θ＝8.92 處出現了強衍射峰，且強度較高，并在2θ＝47.3 處出現了為其他晶型所不具有的散射峰。晶C 型鹽酸小檗堿在2θ在8～10范圍內出現了雙強峰，晶D 型鹽酸小檗堿粉末在2θ為25.4、26.3 時無明顯散射峰，而在2θ為16.9、17.7 時處存在散射峰，表明晶D 型可能發生了鍵位變化或晶型變化。晶E 型鹽酸小檗堿在為2θ為10.1、11.3、11.8 處存在散射，說明晶E 型與其他晶型晶相不同，而晶F 型鹽酸小檗堿13.0～15.0內沒有出現衍射峰這與其他晶型不相同。X 射線衍射結果說明5 種鹽酸小檗堿晶型各不相同。粉末X 射線衍射分析法可用于不用晶型物質鑒別，是鹽酸小檗堿晶型鑒定的有效分析方法。

2.3 鹽酸小檗堿片劑制備

本實驗采用濕法制粒法，先將5 g 不同晶型鹽酸小檗堿粉末過100 目篩，置于研缽中，分別加入2.2 g 淀粉和3.55 g 含有聚山梨酯80 的80%乙醇溶液，充分攪拌均勻之后，制軟材，過80目篩，放置托盤中，105℃下干燥2 h，最后加入70 mg 羧甲基淀粉鈉和50 mg 硬脂酸鎂，混勻，隨之壓片（鹽酸小檗堿自制片規格為0.1 g/片）。然后對鹽酸小檗堿自制片進行了片劑質量檢查，包括片劑外觀、片重差異和片劑硬度等檢查。

從5 種晶型鹽酸小檗堿自制片中各隨機選擇6 片進行觀察，外觀檢查結果如表1所示。片劑表面略有黑點出現，經過分析，確定黑點是由輔料顏色加深造成的，這對片劑質量沒有影響。由于晶E 型粉末在壓縮時容易折斷，難以制成片劑，可能與晶E 型的不規則塊狀有關。所以后續研究中，晶E 型將不再納入研究范圍。從4 種晶型鹽酸小檗堿自制片中各隨機選擇20 片進行準確稱重，計算差異。鹽酸小檗堿粉末自制片片重差異見表2，差異范圍在90%～120%，符合藥典標準。從4 種晶型鹽酸小檗堿自制片中各隨機選擇6 片，用片劑硬度計測定片劑硬度，結果如表3所示，各片劑平均硬度在30～60 N，符合片劑標準。綜合所上，晶E 型鹽酸小檗堿粉末不符合壓片要求，其他4 種晶型粉末所制片劑均符合標準。

表1 5 種晶型鹽酸小檗堿自制片劑外觀檢查(n ＝6)Tab 1 Appearance of 5 crystal forms of berberine hydrochloride tablets (n ＝6)

表2 4 種晶型鹽酸小檗堿自制片片重差異(n ＝6)Tab 2 Weight of 4 crystal forms of berberine hydrochloride tablets(n ＝6)

表3 4 種晶型鹽酸小檗堿自制片硬度測試(n ＝6)Tab 3 Hardness test of 4 crystal forms of berberine hydrochloride tablets (n ＝6)

2.4 高效液相法測定溶出度

采用HPLC 系統，色譜柱為Unitary C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為36 ℃。流動相為0.2%三乙胺的0.02 mol·L－1磷酸溶液-乙腈（65∶35，V/V），以1.0 mL·min－1的流速進行洗脫。檢測波長為346 nm，進樣量為10 μL。

取鹽酸小檗堿對照品用甲醇溶液稀釋至1 mg·mL－1作為對照品儲備液在4 ℃下保存。取對照品儲備液逐級稀釋（5～100 μg·mL－1）后測定，以峰面積（Y）對質量濃度（X）建立標準曲線，Y＝44.03X＋9.982，R2＝0.999。

同時，基于課題組前期的研究[25]，考察所建立HPLC 方法的方法學，包括特異性、線性、精密度、準確度、重復性和加樣回收率，結果均符合要求。

2.5 藥物溶出度實驗

分別取鹽酸小檗堿自制片各6 片，以超純水，pH 4.5 醋酸緩沖液，pH 6.8 磷酸鹽緩沖液為溶出介質，參照2015年版《中國藥典》鹽酸小檗堿片溶出度測定法（籃法）進行考察。溶出介質為1000 mL，轉速為120 r·min－1，溫度設置為（37±2）℃，分別在第5、10、15、20、30、45、60、120 min 取樣，用微孔濾膜過濾后，進樣。依據CFDA 頒布的《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》，連續兩點溶出量均達85%以上，且差值在5%以內，可作為考察截止時間點選擇的依據。從圖5a 中可以看出，在純水溶出介質中，晶F 型鹽酸小檗堿自制片較快溶解，能有良好的溶出行為；晶D 型自制片在90 min 內累計溶出量達到85%，晶B 型和晶C 型自制片在此溶出介質中溶出較慢。4 種自制片劑在醋酸緩沖液溶出介質的溶出曲線如圖5b 所示，晶B 型、晶D 型和晶F 型自制片能在較短時間內達到85%溶出量，表現出良好的溶出行為，而晶C型自制片溶出較慢。如圖5c 所示，晶D 型和晶F 型在磷酸緩沖液溶出較快，具有良好的溶出行為；晶B 型和晶C 型自制片在此溶出介質中溶出較慢；此外，晶D 型自制片溶出曲線在20～60 min 有一定的下降趨勢，可能是晶D 型鹽酸小檗堿發生了一定程度的降解行為。綜合考慮4 種不同晶型自制片在3 種溶出介質中的溶出行為，晶F 型自制片在所有介質中都有較快的溶出行為，而晶C 型自制片都表現出較慢的溶出，晶B 型和晶D 型自制片在3 種溶出介質中表現出不一致的溶出行為。

圖5 4 種晶型鹽酸小檗堿片在超純水（a）、醋酸鹽緩沖液（b）、磷酸鹽緩沖液（c）的溶出曲線Fig 5 Dissolution curve of 4 crystal forms of berberine hydrochloride tablets in ultrapure water （a）， acetate buffer （b）and phosphate buffer （c）

3 討論

藥物多晶型現象對于藥物的研發具有極其重要的意義，約70%臨床使用的藥物為固體口服制劑，而且50%以上固體藥物存在多晶型現象。不同晶型藥物對藥物的吸濕性、穩定性、生物利用度、藥效以及安全性等產生較大的影響[26]。由此固體藥物選擇一種合適的存在形式對于藥物應用顯得尤為重要。鹽酸小檗堿在臨床上以鹽酸小檗堿片為主要用藥劑型，本研究中采用單一溶劑重結晶法制備了鹽酸小檗堿5 種晶型，從晶型微觀、紅外光譜、熱分析以及物質結構分析等多個方面對鹽酸小檗堿多晶型進行表征，可以直觀且準確地描繪出鹽酸小檗堿多晶型在各個方面的差異，為鹽酸小檗堿多晶型后續研究提供數據參考。

本實驗在前期優化片劑制備工藝的基礎上，均采用最佳工藝條件進行制片，設置原料藥晶型為實驗設計單一變量，考察原料藥晶型因素對于片劑溶出度的影響。并依據《普通口服固體制劑溶出曲線測定與指導原則》，根據藥物的理化性質，充分考慮體內環境因素的影響，應選擇不同pH 的溶出介質進行溶出度的考察。實驗中為模擬體內胃腸道環境，純水、pH 1.2 的鹽酸溶液、pH 4.5 的醋酸鹽緩沖液和pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液被選擇為4 種不同pH 的溶出介質。因在pH 1.2 的鹽酸溶液介質中，鹽酸小檗堿的穩定性不好，且在5～100 μg·mL－1線性關系不符合要求，故后續研究中剔除了pH 1.2的鹽酸溶液的溶出介質。基于多晶型鹽酸小檗堿的溶出行為結果，表明晶F 型自制片在所有介質中都有較快的溶出行為，而比表面積較大的晶C 型自制片在各介質中都表現出較慢的溶出。溶出速度從快到慢依次為針狀、片狀和柱狀，狹長針狀的溶出速度快于針狀。

綜上所述，本文從藥物晶型表征以及研究其對片劑溶出度的影響，發現晶型單晶比表面積對藥物溶出行為產生顯著的影響。后續研究可關注藥物晶型、粒徑、形貌等屬性對溶出行為的影響，以更加精準地控制原料藥質量，并根據臨床對藥物釋放速度的需求，選擇不同晶型的原料藥制備所需制劑。