基于UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS的新癀片化學成分分析

高旭華，馮欣，畢玥琳，倪詩婷，楊天歌，陶歐（北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488）

新癀片主要由腫節風、三七、人工牛黃、豬膽粉、肖梵天花等8 味中藥與西藥成分吲哚美辛組成，有清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛的功效。常用于治療熱毒瘀血所致的咽喉腫痛、牙痛、痹痛、脅痛、黃疸及無名腫毒等。

迄今為止，有關新癀片的研究大多集中于其臨床藥效觀察，研究表明新癀片對于痛風性關節炎、軟組織損傷、骨性關節炎、強直性脊柱炎、類風濕關節炎等骨傷科疾病均有較好的抗炎鎮痛作用[1]。此外，新癀片用于輕癥亞急性甲狀腺炎、帶狀皰疹等皮膚疾病、口腔種植牙齒術后疼痛或口腔正畸疼痛均有較好的治療作用[2-5]。目前關于新癀片具體中藥成分的研究僅有針對其中某個或某幾個特征成分進行含量測定的研究[6-9]，近期也有學者建立了新癀片的HPLC-ELSD 指紋圖譜，并通過比對指認了其中9 個色譜峰的化學成分[10]。到目前為止，尚未見對新癀片化學成分進行全面分析的研究。

Orbitrap 高分辨質譜法具有高分離性能、高靈敏度及高檢測能力，可以進行高精度的定量和定性分析，已廣泛用于中藥成分分析、藥物動力學等領域[11]。故本研究首次采用超高效液相色譜-四極桿-靜電軌道場離子阱質譜（UPLC-QExactive-Orbitrap-MS）技術對新癀片水提液進行檢測，并結合相關文獻和化合物質荷比及碎片離子信息，快速分析鑒定新癀片中的化學成分，并對其進行藥材歸屬，為明確新癀片物質基礎，闡明其體內藥理作用機制等提供研究基礎。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Scientific Q Exactive、Xcalibur、Vanquish Duo UHPLC 系統、Pico 17 高速離心機（Thermo Scientific）；Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×150 mm，USA）；CPA225D 電子天平（SARTORIUS）；HH-S4A 電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試藥

質譜級乙腈（美國賽默飛世爾科技有限公司）；質譜級甲酸（美國ROE 公司）；新癀片（廈門中藥廠有限公司，批號：200102）；水為純凈水。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

新癀片樣品粉碎，精密稱取2.50 g，加水50 mL，80℃水浴加熱回流提取1 h，取上清液1 mL，10 000 r·min－1離心10 min，取上清液20 μL，用水稀釋50 倍，13 000 r·min－1離心15 min，取上清液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm），柱溫：40℃，進樣量：5 μL，流速：0.3 mL·min－1，流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～3 min，5%B；3～16 min，5%～95%B。

2.3 質譜條件

離子源為電噴霧離子化源（ESI），正負離子交替掃描；掃描模式為：全掃描/數據依賴的二級掃描（Full scan/ddMS2），掃描范圍為100～1300 Da，毛細管溫度為350℃，負模式下的噴霧電壓為3800 V，正模式下的噴霧電壓為3200 V，鞘氣為35 arb，輔助氣為15 arb，MS2采用低、中、高3種碰撞能。正離子模式為20 V、40 V、60 V，負離子模式為30 V、50 V、70 V。一級質譜分辨率Full Scan 70000 FWHM（Full Width at Half Maximum），二級質譜分辨率：MS/MS 17500 FWHM。

2.4 數據處理分析

通過文獻及PubChem 在線數據庫檢索，收集新癀片組方中8 味中藥所含成分的分子式，中英文名稱，準分子離子及特征碎片離子等信息，建成Excel 格式質譜數據庫。采用Xcalibur 3.0 數據軟件根據分子式計算出精確質量數及可能的準分子離子質荷比，并以此對采集的質譜數據進行峰提取，與自建數據庫中的準分子離子質荷比、特征碎片離子質荷比以及文獻中的裂解規律進行比對分析，對樣品中的化合物進行快速鑒定。

3 結果與分析

考慮到中藥組分化學成分復雜，故采用正、負兩種電離模式對新癀片水提液中的成分進行全掃描，以期鑒定出盡可能多的化學成分。基峰色譜圖（BPI）見圖1。

圖1 ESI＋模式（A）和 ESI－模式（B）下新癀片水提液的BPI 圖Fig 1 Base peak ion flow diagram of Xinhuang tablets water extract under positive ion（A）and negative ion（B）modes by UPLC-QExactive-Orbitrap-MS

3.1 新癀片化學成分分析

按照“2.4”項下的數據處理方法，共鑒定出新癀片水提液中化學成分54個[12-34]，結果見表1，其中有2 個成分因存在多個同分異構體，且可供參考的資料有限，未能確定其準確保留時間。

表1 新癀片中化學成分的UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 鑒定結果Tab 1 Identified chemical constituents of Xinhuang tablets by UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS

續表1

續表1

3.2 新癀片中主要化學成分的質譜裂解規律

3.2.1 皂苷類化合物 峰29 保留時間為9.53 min，可觀察到準分子離子峰m/z1107.5921 [M－H]－，同時可觀察到主要碎片離子m/z945.5421、783.4887、621.4365、459.3836，根據負離子模式下的精確分子質量以及特征碎片的質量，結合相關文獻[8，34]可判斷該化合物為ginsenoside Rb1。碎片離子m/z945 是C-3 位連接最外側的葡萄糖丟失形成，再進一步丟失一分子葡萄糖形成離子m/z783。碎片離子m/z783 在C-17 位支鏈最外側丟失一分子葡萄糖形成m/z621，進一步丟失葡萄糖形成離子m/z459。其裂解規律如圖2所示。

圖2 Ginsenoside Rb1 可能的裂解途徑Fig 2 Proposed fragmentation pathways of ginsenoside Rb1

峰32 保留時間為9.63 min，準分子離子峰m/z799.4838 [M-H]－，峰22 保留時間為8.14 min，準分子離子峰m/z799.4843 [M－H]－，兩者為同分異構體，均可觀察到主要碎片離子m/z637、475、391。而在峰32 的碎片離子中觀察到了兩個葡萄糖相連形成的m/z221.0653 離子，且峰22 的m/z637 離子豐度高于峰32 的m/z637 離子，與文獻[14-34]相符，則可判斷峰32 對應化合物ginsenoside Rf，峰22 對應化合物ginsenoside Rg1。兩者的裂解規律如圖3所示。

圖3 Ginsenoside Rf（A）和ginsenoside Rg1（B）可能的裂解途徑Fig 3 Proposed fragmentation pathways of ginsenoside Rf（A）and ginsenoside Rg1（B）

峰18 保留時間為7.89 min，可觀察到準分子離子峰m/z931.5243 [M－H]－，同時可觀察到主要碎片離子m/z799.4845、637.4315、475.3786、391.2843，根據負離子模式下的精確分子質量以及特征碎片的質量，結合相關文獻[34]可判斷該化合物為notoginsenoside R1。其裂解規律如圖4。

圖4 Notoginsenoside R1 可能的裂解途徑Fig 4 Proposed fragmentation pathways of notoginsenoside R1

3.2.2 膽酸類化合物 峰54 保留時間為11.58 min，可觀察到準分子離子峰m/z431.2752 [M ＋Na]＋，同時可觀察到一系列脫水離子m/z373.2726、355.2623、337.2522，以及較小豐度的碎片離子m/z159.1164、147.1156，根據正離子模式下的精確分子質量以及特征碎片的質量，結合相關文獻[33]可判斷該化合物為hyocholic acid。其裂解規律如圖5。

圖5 Hyocholic acid 可能的裂解途徑Fig 5 Proposed fragmentation pathways of hyocholic acid

峰57 保留時間為12.01 min，可觀察到準分子離子峰m/z450.3198 [M ＋H]＋，同時可觀察到主要碎片離子m/z432.3117、414.2998、339.2683、76.0398、376.2171、158.0811，根據正離子模式下的精確分子質量以及特征碎片的質量，結合相關文獻[33]可判斷該化合物為glycochenodeoxycholic acid。其裂解規律如圖6。

圖6 Glycochenodeoxycholic acid 可能的裂解途徑Fig 6 Proposed fragmentation pathways of glycochenodeoxycholic acid

峰49 保留時間為10.82 min，可觀察到準分子離子峰m/z500.3022 [M ＋H]＋，同時可觀察到主要碎片離子m/z482.2923、464.2821、339.2675、126.0219，根據正離子模式下的精確分子質量以及特征碎片的質量，結合相關文獻[13-33]可判斷該化合物為tauroursodeoxycholic acid，其裂解規律如圖7。

圖7 Tauroursodeoxycholic acid 可能的裂解途徑Fig 7 Proposed fragmentation pathways of tauroursodeoxycholic acid

3.2.3 酚酸類化合物 峰5 保留時間為4.60 min， 準分子離子峰m/z353.0872 [M － H]－，峰7 保留時間為5.74 min，準分子離子峰m/z353.0873 [M－H]－，兩者為同分異構體，均可觀察到主要碎片離子m/z191、179、173、135，根據兩者色譜保留時間，結合相關文獻[32]可判斷峰5 對應化合物chlorogenic acid，峰7 對應化合物cryptochlorogenic acid，其中chlorogenic acid 的裂解規律如圖8。

圖8 Chlorogenic acid 可能的裂解途徑Fig 8 Proposed fragmentation pathways of chlorogenic acid

峰12 保留時間為6.55 min，準分子離子峰m/z197.0446 [M－H]－，同時可觀察到主要碎片離子m/z182.0210、153.0545、138.0309、121.0282，根據負離子模式下的精確分子質量以及特征碎片的質量，結合相關文獻[16，31]可判斷該化合物為syringic acid，其裂解規律如圖9。

圖9 Syringic acid 可能的裂解途徑Fig 9 Proposed fragmentation pathways of syringic acid

峰20 保留時間為7.92 min，準分子離子峰m/z359.0764 [M－H]－，同時可觀察到主要碎片離子m/z197.0446、179.0339、161.0233、135.0439，根據負離子模式下的精確分子質量以及特征碎片的質量，結合相關文獻[30]可判斷該化合物為rosmarinic acid，其裂解規律如圖10。

圖10 Rosmarinic acid 可能的裂解途徑Fig 10 Proposed fragmentation pathways of rosmarinic acid

4 討論

本研究首次采用UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 技術對新癀片水提液中化學成分進行系統分析，并對其中10 種主要成分可能的裂解規律進行具體描述，以期為各成分及其代謝過程的研究提供依據。

本次研究鑒定出的化合物中，皂苷類、膽酸類和酚酸類成分中均有鎮痛作用的相關報道。謝暕[35]研究發現ginsenoside Rg1可顯著抑制醋酸致小鼠扭體反應和福爾馬林致大鼠疼痛反應，顯示出良好的鎮痛活性，抑制TRPV1 陽離子通道的激活，可能是其發揮抗炎和鎮痛作用的共同機制。郝文利[36]研究發現taurocholic acid 對熱刺激、化學刺激和機械刺激對小鼠引起的疼痛均有顯著的鎮痛作用，其作用機制與其阻斷DA 受體，與5-HT2受體結合，并降低小鼠腦中PGE2的含量有關。周怡梅等[37]的實驗研究結果顯示，腹腔處理中高劑量的chlorogenic acid 能減輕紫杉醇對小鼠引起的機械痛敏，對外周神經痛有鎮痛作用，其鎮痛機制仍有待研究。李繼珩等[38]通過熱板試驗法發現，tauroursodeoxycholic acid 具有鎮痛作用，且發揮作用的時間比對照藥品熊去氧膽酸快。現有研究表明，glycocholic acid 和taurochenodeoxycholic acid 均可通過抑制NO、LTB4、PGE2 等炎癥介質的產生發揮抗炎作用[39-40]，此外taurochenodeoxycholic acid 還能通過提高IL-1β、IL-6、TNF-α的產生間接發揮抗炎作用。王新亭等[41]的研究發現，tauroursodeoxycholic acid 對慢性乙型病毒性肝炎殘留黃疸的療效比對照組丁二磺酸腺苷蛋氨酸腸溶片的療效更佳，且可能會改善患者的遠期預后。這些化合物的藥理作用與新癀片消腫止痛、治療黃疸的功效一致，且在譜圖中有較為明顯的峰形，有可能是新癀片主要的藥效物質基礎。

此外，鑒定得到的人參二醇型-A 型類成分均未發現m/z375 的碎片離子，與趙靜等[14，34]m/z459 的碎片離子C-17 位側鏈斷裂形成m/z375 特征碎片離子的描述不符，推測可能是質譜條件的設置導致m/z459 碎片離子未能進一步斷裂導致的。