UPLC-Q-TOF-MS分析畬藥地菍的化學成分

曹丹，趙崇軍，王海燕，衛博文，蔣楊雨，林瑞超*，李健*（.北京中醫藥大學中醫學院，北京0488；.北京中醫藥大學中藥學院，中藥品質評價北京市重點實驗室，北京 0488）

地菍別稱地稔、地茄子、地葡萄、鋪地錦等，為野牡丹科野牡丹屬植物地菍（Melastoma dodecandrumLour.）的干燥全草。民間使用廣泛，為畬族常用藥材，畬民多稱嘎狗嚕或糞桶板[1]。地稔具有清熱化濕、祛瘀止痛、收斂止血之功效。現代藥理研究表明，地菍提取物有鎮痛消炎、降血糖、調血脂、止血、抗氧化、抗肝炎等作用[2-4]。地菍含有多種化學成分，主要有黃酮類、甾體類、萜類、鞣質、多糖類、有機酸等化合物[5]。然而，目前關于地菍有效成分的深入研究相對較少，因此，針對地菍建立快速的分析方法，對于地菍藥理活性物質的深入研究及開發利用具有重要參考價值。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜聯用技術（UPLC-Q-TOF-MS）具有高分辨率、高靈敏度和高分離度等優點，可在缺少對照品的情況下對復雜中藥成分進行定性分析，近年來已迅速成為中藥材成分分析領域的重要研究方法[6]。本文采用UPLC-Q-TOF-MS 技術結合UNIFI 天然產物數據庫，對地菍提取物中小分子成分進行快速、全面的分析，為進一步提升地菍藥材的質量控制和闡明藥效物質基礎提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity UPLC I-Class 超高效液相色譜儀、Q-TOF MS 串聯飛行時間四級桿質譜儀（Waters 公司），BT224S 型電子天平（賽多利斯科學儀器）。

1.2 試藥

地菍（采自福建，批號：20140421，經北京中醫藥大學中藥鑒定教研室劉春生教授鑒定野牡丹科植物Melastoma dodecandrumLour.的干燥全草）。乙腈（色譜純，Fisher），甲酸（分析純，北京化工廠），亮氨酸-腦啡肽（對照品，Sigma 公司），水為娃哈哈純凈水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相：乙腈（A）～0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～1 min，2%A；1～10 min，2%～30%A；10～12 min，30%～100%A；12～13 min，100%A；13～13.5 min，2%A；13.5～15 min，2%A），柱溫：40℃；流速：0.4 mL·min－1；進樣量：5 μL。

2.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）；毛細管電壓：正離子模式3.0 kV，負離子模式2.5 kV；錐孔電壓：40 V；離子源溫度：110 ℃；脫溶劑氣溫度：450 ℃；錐孔氣：150 L·h－1；脫溶劑氣：800 L·h－1；實時校正標準物：亮氨酸腦啡肽（[M ＋H]＋＝556.2771，[M-H]－＝554.2615）。

2.3 供試品溶液的制備

取地菍粉末（過60 目篩）4.0 g，精密稱定，置250 mL 圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，加熱回流提取3 h，放冷至室溫，再稱定質量，用提取溶劑補足減失的質量，搖勻，取5 mL 置10 mL 量瓶中，加蒸餾水至刻度，13 000 r·min－1離心5 min，上清液即為供試品溶液。

2.4 數據處理及譜庫檢索方法

采用UNIFI 軟件對正、負離子模式下地菍提取液LC-MS/MS 的Raw data（MSe 采集模式，含全部一級、二級質譜峰信息）進行分析，結合已報道的化學成分建立地菍成分數據庫，檢索Waters UNIFI 軟件中天然產物數據庫，UNIFI 軟件通過母離子的精確質量數、同位素峰度模型、子離子精確質量數等參數自動匹配中藥數據庫里已有化合物，誤差小于5 ppm，至少匹配上1 個子離子，且一級質譜響應值大于10 000 篩選鑒定結果，軟件自動產生提取離子流圖、一級質譜匹配結果和二級碎片匹配結果。

3 結果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS 分析地菍提取液總離子流圖

采用UPLC-Q-TOF/MS 對地菍提取液的化學成分進行定性分析，得到地菍提取液（＋）ESIMS 和（－）ESI-MS 的質譜總離子流圖（見圖1）。

圖1 正（A）、負（B）離子模式下地菍提取液總離子流圖Fig 1 Total ion chromatogram of Melastoma dodecandrum Lour.extraction in positive（A）and negative（B）ion mode

3.2 地菍化學成分的結構鑒定

通過查閱文獻[7-25]、使用UNIFI 軟件對正、負離子模式下地菍提取液LC-MS/MS 的Raw data（MSe 采集模式）進行分析，檢索Waters UNIFI 軟件中天然產物數據庫，結合文獻資料、Chemspider等數據庫以及質譜裂解規律等，推斷可能的化學成分及其裂解過程，對地菍的化學成分結構進行分類，并對主要碎片離子信息進行歸屬，結果見表1。

表1 地菍化學成分鑒定結果Tab 1 Identification of chemical constituents of Melastoma dodecandrum Lour.

3.2.1 黃酮類成分裂解規律分析 黃酮類化合物在MS/MS 正離子模式下，易得到[M ＋H]＋的分子離子峰。黃酮苷會失去糖基產生[M ＋H-glc]＋的特征性苷元碎片離子，游離的黃酮苷元主要有兩種裂解方式，方式Ⅰ：苷元C 環的逆-狄爾斯-阿爾德反應（RDA）裂解產生m/z153 和m/z134的碎片離子；方式Ⅱ：苷元還可以裂解產生m/z137 和m/z109 質譜碎片信息。以木犀草素-7-O-葡萄糖苷為例，對黃酮類化合物質譜裂解規律進行探討，木犀草素-7-O-葡萄糖苷可能的裂解途徑如圖2所示，與文獻[7]木犀草素-7-O-葡萄糖苷對照品碎片一致，推測峰13 為木犀草素-7-O-葡萄糖苷。

圖2 木犀草素-7-O-葡萄糖苷裂解途徑Fig 2 Fragmentation pathway of luteolin-7-O-glucoside

峰6、11、15～20、22～25 為黃酮或黃酮醇類化合物，正/負離子模式下，分子離子峰m/z依次是611.1594 [M ＋H]＋，595.1277 [M ＋H]＋，447.0923 [M ＋H]＋，449.1071 [M ＋H]＋，617.1133 [M ＋H]＋，609.1445[M-H]－，465.1036[M ＋H]＋，433.1133 [M ＋H]＋，433.1135 [M ＋H]＋，465.1021 [M ＋H]＋，595.1657 [M ＋H]＋，287.0549 [M ＋H]＋，黃酮苷失去糖基后，形成的黃酮苷元易產生正離子模式m/z153，負離子模式m/z151 及m/z109 的特征碎片，結合文獻[7-14]，推測峰6、11、15～20、22～25 依次為nelumboroside A、山柰酚-3-O-鼠李糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷（峰13 的同分異構體）、desmanthin-1、蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、牡荊素、異牡荊素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（峰19 的同分異構體）、山柰酚-3-O-刺槐二糖苷和山柰酚。

峰7 的分子離子峰為m/z593.1293 [M-H]－，二級掃描產生m/z305.0661 [M-H-C15H13O6]－，m/z287.0543 [M-H-C23H21O8]－，m/z153.0188 [C7H5O4]－等特征峰，查閱文獻[15]，推測其為表沒食子兒茶素（4，8）-沒食子兒茶素。峰10 的分子離子峰為m/z457.0772 [M-H]－，二級掃描產生m/z169.0141 [C7H6O5]－的特征峰，查閱文獻[16]，推測其為表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯。

3.2.2 鞣質類成分裂解規律分析 鞣質是由沒食子酸葡萄糖（多元醇）酯或其衍生物聚合物組成的多元酚。其MS/MS 易失去H2O、CO2、CO和glc 等碎片峰，通過失去六羥基聯苯二甲酰基（HHDP，m/z301），沒食子酰基（-galloyl，m/z152）而發生裂解，HHDP 和沒食子酸（m/z169）也是鞣質的特征碎片。以casuarinin 為例，推測鞣質類化合物可能的裂解途徑（見圖3），峰12在負離子模式下，其分子離子峰為m/z935.0798[M-H]－，失去一分子H2O 產生碎片離子917.0691[M-H-H2O]－，失去一分子HHDP 產生633.0734[M-H-HHDP]－的碎片離子，失去一分子沒食子酰基產生153.0179 [-galloyl]－的碎片，查閱文獻[10]，推測其為casuarinin。

圖3 Casuarinin 的裂解途徑Fig 3 Fragmentation pathway of casuarinin

峰4 的分子離子峰為m/z783.0686 [M-H]－，失去一分子H2O 產生碎片離子765.0578 [M-HH2O]－，二級掃描產生481.0631 [M-H-HHDP]－和沒食子酸169.0140 [C7H5O5]－的碎片離子，查閱文獻[17]，推測其為英國櫟鞣花酸。峰5 的分子離子峰為m/z783.0688 [M-H]－，二級掃描產生603.0636 [M-H-C8H5O5]－，481.0621 [M-HHHDP]－，300.9989 [HHDP]－的碎片離子，查閱文獻[18]，推測其為二逆沒食子酰基葡萄糖。峰9 的分子離子峰為m/z933.0716 [M-H]－，二級掃描產生915.0691 [M-H-H2O]－，783.0684 [M-Hgalloyl]－，631.0738 [M-H-HHDP]－的碎片離子，查閱文獻[19]，推測其為栗木鞣花素。峰14 的分子離子峰為m/z937.0924 [M-H]－，二級掃描產生785.0745 [M-H-galloyl]－，300.9987 [HHDP]－查閱文獻[20]，推測其為tellimagrandin Ⅱ。峰21的分子離子峰為m/z951.0896 [M-H]－，失去1 分子H2O 產生933.0637 [M-H-H2O]－， 結合300.9992 [HHDP]－和169.0142 [C7H5O5]－的特征碎片，查閱文獻[21]，推測其為老鸛草素。

3.2.3 有機酸和其他成分裂解途徑推測 峰2 的分子離子峰為m/z331.0671 [M-H]－，二級掃描產 生211.0250 [M-H-C4H9O4]－，169.0142 [M-Hglc]－等特征峰（見圖4），查閱文獻[10]，推測其為單沒食子酰葡萄糖。

圖4 單沒食子酰葡萄糖的裂解途徑Fig 4 Fragmentation pathway of galloylglucose

峰3 的分子離子峰為m/z169.0134 [M-H]－，二級掃描產生125.0235 [M-CO2]－特征峰，查閱文獻[10]，推測其為沒食子酸。峰8 的分子離子峰為m/z355.0304 [M-H]－，二級掃描產生169.0141[M-H-C7H6O6]－特征峰，查閱文獻[22]，推測其為訶子次酸。峰26的分子離子峰為m/z717.1457 [MH]－，二級掃描產生519.0924 [M-H-C9H11O5]－，321.0403[M-H-C18H21O10]－，161.0246[M-HC27H25O13]－等特征峰，查閱文獻[23]，推測其為丹酚酸B。

峰27 的分子離子峰為m/z453.3353 [M ＋H]＋，二級掃描產生261.1840 [M ＋H-C13H19O]＋，219.1744 [M ＋H-C15H21O2]＋等碎片離子，查閱文獻[24]，推測其為靈芝酸S。峰28 的分子離子峰為m/z517.3173 [M-H]－，二級掃描產生485.3381[M-H-OH-CH3]－，471.3114 [M-H-COOH]－，171.1023 [C9H15O3]－等特征峰，查閱文獻[25]，推測其為2-羥基商陸酸。

峰1 的分子離子峰為m/z665.2199 [M-H]－，二級掃描產生647.2039 [M-H-H2O]－，485.1512[M-H-rha]－，179.0558 [C6H11O6]－等特征峰，查閱文獻[26]，推測其為水蘇糖。

4 討論

目前，關于地菍的化學成分研究較少，查閱已報道的文獻[5]，僅分離純化得到78 個化合物。為進一步分析地菍中的化學成分，本課題組前期已分析鑒定出地菍中109 種物質[10]，通過比對發現本次試驗中有6 個成分（沒食子酸、單沒食子酰葡萄糖、牡荊素、蘆丁、casuarinin 和山柰酚）與文獻[10]報道一致。本文采用了與之不同的提取方式，提取的化合物多以極性成分（鞣質、黃酮苷、酚酸等）為主，既對已分離得到的地菍中化合物進行了驗證，又補充和豐富了地菍中的化學成分，為完善地菍藥材質量標準提供了參考。

比較正、負離子模式下的地菍提取液總離子流圖發現，黃酮類化合物的一級質譜中正離子模式下的響應優于負離子，且正離子模式下其MS/MS 碎片更為穩定、更具有特征性，因此，選擇正離子模式下對黃酮類進行分析；鞣質和酚酸類物質在一級質譜中負離子模式下的響應優于正離子，在負離子模式下碎片較為豐富，特征碎片強度較高，因此，選擇在負離子模式下對鞣質和酚酸類進行分析，故本文同時選擇正、負離子模式對地菍的化學成分進行數據采集。

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技術， 通過檢索Waters UNIFI 軟件中天然產物數據庫、Chemspider 數據庫等，結合文獻資料以及質譜裂解規律，初步鑒定出28 個化學成分，包括15 個黃酮、6 個鞣質、4 個酚酸、2 個三萜和1 個寡糖，其中16 種成分為首次在地菍中發現。由于天然產物數據庫質譜信息有限和質譜無法鑒定同分異構體，本研究尚有含量較高成分未指認，需進一步分離鑒定，增加對照品進行驗證，也為未來繼續研究地菍中新成分提供了方向。