益根調理口服液質量標準及其免疫調節研究

蔣林，陳海燕，隨家寧，郭勇秀，謝孟姣，賴信宏，李芳嬋*（.廣西中醫藥大學，南寧530200；2.廣西壯瑤藥工程技術研究中心，南寧 530200；3.廣西高校中藥制劑共性技術研發重點實驗室，南寧 530200）

益根調理口服液是在中醫藥理論基礎上，采用藥食兩用的藥材所開發的中藥復方保健食品口服液，由黃精、桑椹、靈芝、沙棘、益智仁、五指毛桃及覆盆子7 味藥組成，具有良好的增強免疫力、抗氧化、輔助改善記憶、緩解體力疲勞等保健功效，用于年老體弱、形體消瘦、貧血、再生障礙性貧血、氣虛質等人群日常養生。方中君藥黃精功善補中益氣、養陰益精可達氣陰雙補[1]，臣藥桑葚、靈芝分別助黃精滋陰、補氣之功[2-3]，佐藥覆盆子及益智仁均具有益腎固精縮尿之功效[4-5]；沙棘健脾消食、五指毛桃健脾補肺，全方以此兩味為反佐藥可“以瀉助補”。益根調理口服液目前為止還未制訂相關的質量標準，本實驗采用薄層色譜法對該口服液的4 味藥材進行初步的藥材鑒別，采用高效液相色譜法同時測定補骨脂素、鞣花酸成分含量研究，為建立益根調理口服液質量標準提供科學依據；同時對其免疫調節作用進行藥效學研究，為該口服液進一步研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2020C 3D plus 高效液相色譜儀（日本島津），超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），分析天平（十萬分之一，賽多利斯科學儀器有限公司），漩渦混合器（常州越新儀器制造有限公司），數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司），超純水制備機（中國密理博有限公司），三用紫外分析儀（上海精科實業有限公司），硅膠GF254薄層板、雙槽展開缸、SpectraMax i3x 型多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]，SWCJ-2FD 型雙人單面垂直凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司），TD5A 型臺式多管架離心機（長沙英泰儀器有限公司）。

1.2 試藥

益根調理口服液的處方中黃精、桑椹、靈芝、沙棘、益智仁、覆盆子和五指毛桃藥材均購買自華泰中藥飲片責任有限公司，由廣西中醫藥大學中藥鑒定教研室田慧教授分別鑒定為黃精（Polygonatum sibiricumRed.）的干燥根莖、桑椹（Morus albaL.）的干燥果穗、靈芝（GanodermasinenseZhao，Xu et Zhang）的干燥子實體、沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）的干燥成熟果實、益智（Alpinia oxyphyllaMiq.）的干燥成熟果實、華東覆盆子（Rubus chingiiHu）的干燥果實、桑科植物粗葉榕（Ficus hirtaVahl）的干燥根。鞣花酸對照品（成都麥德生科技有限公司，批號：RP190721，含量：99.58%）、補骨脂素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110739-201918，含量：99.6%）以及益根調理口服液（批號分別為：20191029、20200512-1、20200512-2、20200512-3、20200512-4、20200512-5、20200512-6，由廣西中醫藥大學廣西壯瑤藥工程中心實驗室自制，每瓶45 mL）；RPMI 1640 完全培養液（批號：AD23107271，美國Gibco 公司），ConA（批號：1012J033）、臺盼藍（批號：620C055）（北京索萊寶科技有限公司），MTT（批號：M2128，美國Amresco 公司），印度墨汁（批號：0919A17，北京雷根生物技術有限公司）等。乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 益根調理口服液質量標準研究

2.1 益根調理口服液制備

取黃精、桑椹、靈芝、沙棘、益智仁、五指毛桃及覆盆子7 味藥材處方量，回流提取2 次，提取液混合，熱濾濃縮，混勻過濾，添加適量蔗糖，分裝，即得每瓶45 mL 益根調理口服液（1 mL 相當于1.28 g 生藥量）。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 沙棘薄層鑒別 取益根調理口服液2 mL置于分液漏斗中，加水至10 mL，乙酸乙酯連續萃取3 次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，待濾液蒸干后，殘渣添加甲醇1 mL 溶解，即得供試品溶液。依據處方比例稱取除了沙棘外的其他6味藥材，按“2.1”項下方法制得陰性樣品；取缺沙棘的陰性樣品1 mL，以供試品溶液處理方法得到沙棘陰性樣品溶液。另取沙棘對照藥材1 g，加入乙酸乙酯30 mL 超聲（功率200 W，頻率40 kHz）提取30 min，濾液蒸干后，殘渣加入甲醇1 mL 溶解，即得沙棘對照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液、沙棘對照藥材溶液、陰性樣品溶液各5、13、10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（60～90℃）-氯仿-乙酸乙酯（3∶8∶5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁溶液進行顯色。在105℃加熱至斑點顯色清晰，放冷至室溫后在365 nm 紫外燈下觀察。沙棘薄層色譜圖中，供試品色譜與對照品色譜在相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且陰性樣品無干擾（見圖1）。

圖1 沙棘薄層色譜圖Fig 1 TLC of Hippophae rhamnoides L.

2.2.2 益智仁薄層鑒別 按“2.2.1”項下方法制得供試品溶液。依據處方比例稱取除了益智仁外的其他6 味藥材，按“2.1”項下方法制得缺益智仁的陰性樣品，再取缺益智仁的陰性樣品1 mL，以供試品溶液處理方法得到益智陰性樣品溶液。另取益智仁對照藥材1 g，加入乙酸乙酯30 mL超聲（功率200 W，頻率40 kHz）提取30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加入甲醇1 mL 進行溶解，作為益智對照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液、益智仁對照藥材溶液、陰性樣品溶液各5、13、10 μL，分別點于同一硅膠GF254 薄層板上，以石油醚（60～90℃）-氯仿-乙酸乙酯（3∶8∶5）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%香草醛硫酸溶液進行顯色，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在益智仁薄層色譜圖中，供試品溶液色譜與益智仁對照藥材色譜在相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且斑點清晰，無拖尾現象；且陰性樣品色譜中無相同的斑點（見圖2）。

圖2 益智仁薄層色譜圖Fig 2 TLC of Alpiniae Oxyphyllae Fructus

2.2.3 五指毛桃薄層鑒別 取益根調理口服液5 mL 按“2.2.1”項下方法制得供試品溶液。依據處方比例稱取除了五指毛桃外的其他6 味藥材，按“2.1”項下方法制得缺五指毛桃的陰性樣品；再取缺五指毛桃的陰性樣品5 mL，按照供試品溶液方法制備得到五指毛桃陰性樣品溶液。另取補骨脂素對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 補骨脂素的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯（2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干；噴以氫氧化鉀甲醇溶液進行顯色，晾干后在365 nm 紫外燈下觀察。五指毛桃薄層色譜圖中，供試品溶液色譜與五指毛桃對照藥材色譜在相應位置上顯相同顏色的斑點，斑點清晰，并且陰性樣品無干擾（見圖3）。

圖3 五指毛桃薄層色譜圖Fig 3 TLC of Radix FiciHirtae

2.2.4 桑椹薄層鑒別 取益根調理口服液1 mL 按“2.2.1”項下方法制得供試品溶液。依據處方比例稱取除了桑椹外的其他6 味藥材，按“2.1”項下方法制得缺桑椹的陰性樣品；再取缺桑椹的陰性樣品1 mL，按供試品溶液處理方法制備桑椹陰性樣品溶液。另取桑椹對照藥材1 g，加乙酸乙酯30 mL 超聲（功率200 W，頻率40 kHz）提取30 min，濾液蒸干，殘渣添加甲醇1 mL 進行溶解，制成桑椹對照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗，吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254 薄層板上，以石油醚（60～90℃）-氯仿-乙酸乙酯（3∶8∶5）為展開劑，展開，取出，晾干。在105℃加熱至斑點顯色清晰，取出放冷至室溫，在365 nm 紫外燈和日光燈下進行觀察。在桑椹薄層色譜圖中，供試品溶液色譜在與桑椹對照藥材色譜對應位置上，顯相同顏色的清晰斑點，而陰性樣品溶液色譜在相應位置無斑點（見圖4）。

圖4 桑椹薄層色譜圖Fig 4 TLC of Mulberry

2.3 補骨脂素、鞣花酸含量測定研究

2.3.1 色譜條件 色譜柱：phenomenex-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長：254 nm；流動相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脫為0～16 min 時5%→28%B，16～30 min 時28%→55%B，30～45 min 時55%→85%B，45～50 min 時85%→100%B；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min－1；進樣量：20 μL。

2.3.2 供試品溶液制備 精密量取5.0 mL 益根調理口服液，置于具塞錐形瓶中，精密加入25.0 mL 甲醇，精密稱重；超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理30 min 后，放冷至室溫，再次精密稱重，補足重量并搖勻，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.3.3 對照品溶液制備 精密稱取鞣花酸對照品、補骨脂素對照品適量，置于10 mL 量瓶中，加入甲醇稀釋定容，搖勻后制得每1 mL 含補骨脂素0.0304 mg、鞣花酸0.1672 mg 的混合對照品溶液。

2.3.4 陰性樣品溶液制備 依據處方比例稱取除了五指毛桃外的其他6 味藥材，按口服液制劑的制備工藝制得缺五指毛桃陰性樣品，同法制得缺覆盆子陰性樣品。分別精密量取五指毛桃陰性樣品、覆盆子陰性樣品5.0 mL，按“2.3.2”項下方法進行處理，分別得到缺五指毛桃陰性樣品溶液、缺覆盆子陰性樣品溶液。

2.3.5 系統適用性考察 分別精密吸取上述供試品溶液、混合對照品溶液、缺五指毛桃陰性樣品溶液、缺覆盆子陰性樣品溶液各20 μL，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，見圖5；結果補骨脂素、鞣花酸成分與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，理論塔板數均大于20 000，陰性對照樣品對補骨脂素、鞣花酸成分無干擾，方法專屬性好。

圖5 補骨脂素、鞣花酸的HPLC 色譜圖Fig 5 HPLC of psoralen and ellagic acid

2.3.6 線性關系考察 精密吸取“2.3.3”項下混合對照品溶液適量，配制成具有6 個濃度梯度的混合對照品溶液，并分別精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀測定，分別記錄峰面積。以進樣量（μg）為橫坐標（X）、對應峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。結果鞣花酸成分的回歸方程為Y＝7.83×109X－3.96×105（r＝0.9993），在16.72～100.32 μg 內線性關系良好；補骨脂素成分的回歸方程為Y＝3.53×109X＋1.63×104（r＝0.9999），在18.24～48.64 μg 內線性關系良好。

2.3.7 精密度試驗 精密吸取“2.3.3”項下的混合對照品溶液20 μL，連續進樣6 次，結果補骨脂素、鞣花酸峰面積的RSD分別為1.3%、1.5%（n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.3.8 穩定性試驗 精密吸取“2.3.2”項下同一份供試品溶液（批次：20191029）20 μL，依據“2.3.1”項下色譜條件分別在第0、2、4、8、12、24 h 進樣，結果補骨脂素峰面積的RSD為1.9%，鞣花酸峰面積的RSD為1.8%，表明在24 h 內供試品溶液的穩定性良好。

2.3.9 重復性試驗 平行量取同一批次口服液（批次：20191029）6 份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結果口服液樣品中的補骨脂素、鞣花酸成分的含量分別為0.2583 mg·mL－1、0.3871 mg·mL－1，RSD值分別為0.6%、2.0%（n＝6），說明該方法的重復性良好。

2.3.10 加樣回收試驗 精密量取同一批次口服液（批次：20191029）2.5 mL，平行量取6 份，加入鞣花酸（0.949 mg·mL－1）及補骨脂素（0.624 mg·mL－1）混合對照品溶液1.0 mL，置于具塞錐形瓶中，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定。結果補骨脂素平均回收率為100.77%，RSD為2.1%；鞣花酸平均回收率為98.09%，RSD分別為2.0%。

2.3.11 樣品含量測定 分別取6 批益根調理口服液樣品，平行制備2 份，按“2.3.2”項下方法處理，進樣測定，計算益根調理口服液中補骨脂素、鞣花酸的含量。結果見表1。

表1 鞣花酸及補骨脂素含量測定結果Tab 1 Content of ellagic acid and psoralen

3 益根調理口服液對小鼠免疫功能調節作用

3.1 受試動物

雄性ICR 小鼠80 只（SPF 級），體質量為（22±3）g [湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，使用許可證號：SYXK（湘）2015-0016]。小鼠于實驗室適應性喂養1 周，室溫（23±2）℃，明暗12 h 交替，自由飲食、攝水。

3.2 動物分組及給藥

將雄性ICR 小鼠隨機分為實驗Ⅰ組、Ⅱ組，每實驗組各40 只：實驗Ⅰ組用于脾臟淋巴細胞活性測定，實驗Ⅱ組用于巨噬細胞吞噬指數測定；同時將各實驗組均分為4 小組，即益根調理口服液低、中、高劑量組及陰性對照組。其中益根調理口服液低、中、高劑量組分別按9.67 g·kg－1、19.33 g·kg－1、29.00 g·kg－1，以20 mL·kg－1灌胃，陰性對照組給予相應劑量的0.5%CMC-Na，每日灌胃1 次，連續30 d。實驗期間，溫度恒定、通風，所有小鼠自由飲食、飲水。

3.3 統計學方法

采用SPSS 16.0 進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，計數資料以率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3.4 脾臟淋巴細胞活性測定

實驗前將第Ⅰ組小鼠進行稱重并記錄，末次給予受試樣品1 h 后，無菌條件下取脾，并且制成單個細胞懸液。脾淋巴細胞活性應用ConA 刺激脾淋巴細胞分化增殖，采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定；細胞增殖率（%）＝（實驗組OD值－空白組OD值）/實驗組OD值×100%。

與陰性對照組相比，各給樣組動物平均體質量差異均無統計學意義（P＞0.05，見圖6）。與陰性對照組相比，益根調理口服液高劑量組小鼠淋巴細胞增殖能力明顯增加（P＜0.05，見圖7）。

圖6 益根調理口服液對ICR 小鼠（第Ⅰ組）體質量的影響Fig 6 Effect of Yigen conditioning oral liquid on body mass of ICR mice（group Ⅰ）

圖7 益根調理口服液對ConA 誘導的小鼠淋巴細胞增殖能力的影響Fig 7 Effect of Yigen conditioning oral liquid on conA-induced lymphocyte proliferation in mice

3.5 巨噬細胞碳廓清吞噬指數測定

實驗前將第Ⅱ組小鼠進行稱重并記錄，末次給予受試樣品1 h 后，按體質量從小鼠尾靜脈注入20%印度墨汁（10 mL·kg－1）。分別于墨汁注入后2、10 min 從內眥靜脈叢取血，并立即加入0.1%Na2CO3溶液，充分混勻，用酶標儀在600 nm 波長處測光密度值（OD）。采血后將小鼠處死，取肝臟和脾臟，分別稱重，以吞噬指數表示小鼠碳廓清能力。吞噬指數a ＝體質量/（肝質量＋脾質量）×，K＝（lgOD1－lgOD2）/（t2－t1），OD1為2 min 吸光度值，OD2為10 min吸光度值；t為時間（min）。

與陰性對照組相比，各給藥組體質量差異均無統計學意義（P＞0.05，見圖8），益根調理口服液中劑量組小鼠碳廓清吞噬指數明顯增加（P＜0.05），低劑量及高劑量組小鼠吞噬指數差異均無統計學意義（P＞0.05，見圖9）。

圖8 益根調理口服液對ICR 小鼠（第Ⅱ組）體質量的影響Fig 8 Effect of Yigen conditioning oral liquid on the body mass of ICR mice（group Ⅱ）

圖9 益根調理口服液對ICR 小鼠吞噬指數的影響Fig 9 Effect of Yigen conditioning oral liquid on the phagocytic index of ICR mice

4 討論

本研究建立了益根調理口服液的薄層鑒別，在沙棘、桑椹、益智仁薄層鑒別的過程中，分別考察了濕度、溫度、不同展開劑以及不同薄層板對樣品展開的影響，發現石油醚（60～90 ℃）-氯仿-乙酸乙酯（3∶8∶5）作為沙棘、桑椹、益智仁鑒別的展開劑，斑點均明亮清晰，分離效果均較好，且無拖尾現象。

遵循中藥質量標志物理論，對益根調理口服液質量標志物進行預測分析。該處方中黃精多糖是君藥黃精的主要功效成分之一，其具有抗氧化、抗疲勞、調節免疫力、降血脂、護肝等藥理作用[6-7]；靈芝多糖、桑椹多糖分別為臣藥靈芝、桑椹的主要有效成分，均具有調節免疫、抗氧化、降血糖、降脂、抗衰老、護肝等藥理作用[8-9]，多糖類成分較復雜，常用紫外分光光度法進行測定，而在測定過程中發現口服液中蔗糖甜味劑影響其總多糖的含量測定，因此不考慮黃精多糖、靈芝多糖、桑椹多糖作為該口服液功效成分的含量測定。五指毛桃為桑科榕屬植物粗葉榕Ficus hirtaVahl.的根。本品性平，味甜辛，歸肺、脾、胃、大腸、肝經，有益氣健脾、祛痰化濕、舒筋活絡之功[10]。處方中五指毛桃的特征性成分為補骨脂素成分，具有良好的抗氧化、抗衰老的藥理作用以及具有調節免疫力的功能[11-12]。劉春玲等[13]通過實驗研究發現五指毛桃能提高免疫功能低下小鼠的細胞免疫和體液免疫功能，對免疫功能具有調節作用。覆盆子為薔薇科植物華東覆盆子Rubus chingiiHu 的干燥果實，始載于《神農本草經》，具有益腎固精縮尿、養肝明目的功效[14]。覆盆子中含量較高的有效成分為鞣花酸，具有良好的抗氧化以及調節免疫力的作用[15-16]。姜成哲等[17]通過觀察鞣花酸對脾淋巴細胞增殖、自然殺傷細胞活性和Th1/Th2 細胞因子的影響，發現鞣花酸主要通過影響NK 細胞活性而起到一定的免疫調節作用。因此選擇補骨脂素與鞣花酸作為益根調理口服液含量測定的特征成分。

現代藥理研究表明，處方中的黃精多糖[18]、桑椹多糖[19]、靈芝多糖[20]、沙棘多糖[21]、補骨脂素[12]、鞣花酸[16]等成分均具有免疫調節作用。增強免疫力功能檢驗方法有很多，本課題組選擇ConA 誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗及巨噬細胞吞噬指數實驗對益根調理口服液增強免疫力的作用進行研究。細胞免疫主要是由T 淋巴細胞介導的一種特異性免疫反應，淋巴細胞轉化率降低表示細胞免疫水平低下[22]。Con A 誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗，其轉化率常被用來衡量機體細胞免疫水平；T 淋巴細胞轉化率低，意味著在外來因子的刺激下淋巴細胞的增殖反應降低，機體的免疫力下降[23]。非特異性免疫是機體免疫系統的重要組成部分，巨噬細胞吞噬功能是反映非特異性免疫功能的常用指標之一。巨噬細胞為一類重要的免疫調節細胞，可通過吞噬病原體、細胞碎片、遞呈抗原、分泌IL-1、IL-6、TNF-α等細胞因子誘導并調節特異性免疫應答[24]。有研究表明提高NK 細胞的殺傷活性與巨噬細胞的吞噬活性為增強免疫力的作用機制之一[25]。評價單核巨噬細胞的吞噬功能常采用碳廓清實驗，當碳顆粒進入血液后，血液中的吞噬細胞便開始吞噬異物顆粒[26]。

本實驗所建立的益根調理口服液質量標準科學合理、操作簡便，且準確性、重現性較好，可用于益根調理口服液的質量控制；藥效學初步研究表明益根調理口服液可能通過增強小鼠淋巴細胞增殖和吞噬功能的作用，從而增強機體免疫力，為進一步研究其免疫調節機制奠定基礎。